一種透明質酸菌種復壯新方法
2023-08-03 16:05:56 1
專利名稱：一種透明質酸菌種復壯新方法
技術領域：
本發明涉及一種菌種復壯的方法，特別涉及一種透明質酸菌種復壯新方法。
背景技術：
在實際生產或實驗室中保存的透明質酸菌種經常會發生退化現象，因此，需要不 斷進行復壯，以得到性能優良的菌種，常規的復壯方法是利用常規或加富培養基平板，進行 劃線分離方法，利用淘汰方法將菌種進行分離，從中選擇出性能良好的菌種而得到復壯，但 是這種方法較保守，復壯成功率非常低，而且復壯得到的菌種不夠好，容易退化。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種復壯劑原料易得，製作和使用過程簡單，提 高了菌種的復壯率和產酸率的透明質酸菌種復壯新方法，解決了上述現有技術中存在的問題。解決上述技術問題的技術方案是一種透明質酸菌種復壯新方法，包括以下步 驟
(1)復壯劑的製備
al、先取土豆切碎成粒度小於5mm的顆粒狀，然後將土豆和玉米按重量比為3-4 :1混合 絞碎得到復壯劑原料，再按lg復壯劑原料加入1. 8-2. 2mL水計向復壯劑原料中加入水，得 到混合物；
bl、將步驟al得到的混合物加熱至沸騰，然後繼續加熱使混合物保持沸騰2. 5-3. 5小 時，並蒸發掉混合物體積50%-70%的水，加熱過程每間隔20-30分鐘對物料進行攪拌防止發 焦；
cl、在無菌操作臺上用滅菌的濾布過濾得到浸提液，冷卻到常溫備用； dl、按羊血與浸提液體積比為2 7-8計把無菌脫纖維綿羊血加入到浸提液中，混合均 勻製得復壯劑，放入2V _6°C的冰箱內保存；
(2)透明質酸菌種復壯
a2、配製透明質酸固體培養基，高溫滅菌後冷卻至50°C -60°C ； b2、在無菌操作臺上將固體培養基體積12-16%的復壯劑加入到固體培養基中，搖勻後 再倒到平板中冷卻到室溫，得到復壯平板；
c2、把退化的透明質酸菌種斜面或甘油管取出活化25-35分鐘，然後用接種環挑出退 化菌種在復壯平板上劃線；
d2、把劃好線的復壯平板放在培養箱中培養30-40小時，直到菌種在平板上出現透明 質酸單菌落，再用接種環挑出單菌落進行斜面培養，培養好後得到復壯好的菌种放入冰箱 進行保存。步驟a2所述的固體培養基和步驟d2所述的斜面培養採用的培養基的配製如下 先分別稱取腦心浸粉37克、酵母粉10克、葡萄糖1克、七水硫酸鎂2克，然後一起溶解於1000mL水中，溶解完全後調節液體pH值到7. 2，最後將25克瓊脂剪碎放入配製得到。步驟a2所述的高溫滅菌是在121 °C高溫條件下滅菌30分鐘，步驟d2所述的把劃 好線的復壯平板放在35V -40°C培養箱中培養，所述的復壯好的菌种放入2V -6°C冰箱進 行保存。本發明之一種透明質酸菌種復壯新方法具有以下有益效果。1.本發明復壯劑原料易得，製作和使用過程簡單本發明的復壯劑利用常見的動 物材料(羊血)和植物材料(土豆和玉米)通過簡單的粉碎、蒸發浸提、混合等步驟處理後制 得復壯劑，復壯劑與透明質酸固體培養基按一定比例混合後即可用於透明質酸菌種的復 壯。2.提高了菌種的復壯率和產酸率使用該方法使透明質酸菌種的復壯機率提高 10倍以上，即可使每個平板得到的優良菌種個數由原來的1-3個提高到30-40個，而且得到 的菌種性能良好，產酸率提高30%左右。下面，結合實施例對本發明之透明質酸菌種復壯新方法的技術特徵作進一步的說 明。
具體實施例方式實施例1 :
一種透明質酸菌種復壯新方法，包括以下步驟
(1)復壯劑的製備
al、先取150克新鮮土豆切碎成粒度小於5mm的顆粒狀，然後將土豆和50克新鮮土豆 一起放入豆漿機中絞碎，再加入到裝有400毫升水的1800mL燒杯中混合均勻；
bl、將上述混合物加熱，加熱到水小開沸騰，保持物料上下翻滾，燒杯上加蓋玻璃片以 防水過分蒸發，加熱保持沸騰的時間為3小時左右，每間隔20分鐘對物料進行攪拌防止發 焦，將水蒸發掉50%-70% (體積比)，得到300-400mL混合液；
cl、在無菌操作臺上以無菌操作方式用滅菌的濾布過濾出120mL浸提液，冷卻到常溫 備用;
dl、在無菌操作臺上把30mL無菌脫纖維綿羊血加入到上述120mL浸提液中，混合搖勻 而製得150mL復壯劑，放入2V _6 °C的冰箱內保存。(2)透明質酸菌種復壯
a2、配製透明質酸固體培養200ml，121 °C高溫滅菌30分鐘，冷卻到60°C ； b2、在無菌操作臺上按15%(體積比)比例把30ml復壯劑加入到上述60°C透明質酸固 體培養基中，搖勻後再分別倒到10個平板中冷卻到室溫，製成10個透明質酸菌種用的復壯 平板；
c2、把退化的透明質酸菌種斜面或甘油管取出活化30分鐘，然後用接種環挑出退化菌 種在復壯平板上劃線；
d2、把劃好線的復壯平板放在35°C _40°C培養箱中培養30-40小時，直到菌種在平板上 出現肥厚且粘性高的單菌落，再用接種環挑出單菌落進行斜面培養，培養好後得到復壯好 的菌種可放入2V _6°C冰箱進行保存，最後得到性能優良的透明質酸菌種。實施例2:一種透明質酸菌種復壯新方法，包括以下步驟
(O復壯劑的製備
al、先取225克新鮮土豆切碎成細小塊(小於5mm)狀物，然後將土豆和75克新鮮土豆一起放入豆漿機中絞碎，再加入到裝有600毫升水的ISOOmL燒杯中混合均勻；
bl、將上述混合物加熱，加熱到水小開沸騰，保持物料上下翻滾，燒杯上加蓋玻璃片以防水過分蒸發，加熱保持沸騰的時間為2. 5-3. 5小時，每間隔20分鐘對物料進行攪拌防止發焦，將水蒸發掉50%-70% (體積比)，得到450-600mL混合液；
Cl、在無菌操作臺上以無菌操作方式用滅菌的濾布過濾出160mL浸提液，冷卻到常溫備用;
dl、在無菌操作臺上把40mL無菌脫纖維綿羊血加入到上述160mL浸提液中，混合搖勻而製得200mL復壯劑，放入2 V _6°C的冰箱內保存。(2)透明質酸菌種復壯與實施例I相同。本發明各實施例所述的無菌脫纖維綿羊血是由綿羊以無菌方式採血，玻璃珠搖床脫纖而成的羊血，可以從市場上購買。步驟a2所述的固體培養基和步驟d2所述的斜面培養採用的培養基的配製如下先分別稱取腦心浸粉37克、酵母粉10克、葡萄糖I克、七水硫酸鎂2克，然後一起溶解於裝有IOOOml水的三角瓶中，溶解完全後調節液體pH值到7. 2，最後將25克瓊脂剪碎放入配製得到。本發明各實施例所述的新鮮的土豆是指出土 10天內的土豆，新鮮的玉米是指10天內米摘的玉米。本發明各實施例所述的透明質酸菌種可以是獸疫鏈球菌、馬鏈球菌、類馬鏈球菌 或多殺性巴氏桿菌等，實驗證明，上述這些透明質酸菌種使用本發明復壯後，可使每個平板得到的優良菌種個數由原來的1-3個提高到30-40個，而且產酸率提高30%左右。
權利要求
1.一種透明質酸菌種復壯新方法，其特徵在於包括以下步驟 (O復壯劑的製備 al、先取土豆切碎成粒度小於5mm的顆粒狀，然後將土豆和玉米按重量比為3-4 :1混合絞碎得到復壯劑原料，再按Ig復壯劑原料加入I. 8-2. 2mL水計向復壯劑原料中加入水，得到混合物； bl、將步驟al得到的混合物加熱至沸騰，然後繼續加熱使混合物保持沸騰2. 5-3. 5小時，並蒸發掉混合物體積50%-70%的水，加熱過程每間隔20-30分鐘對物料進行攪拌防止發焦； Cl、在無菌操作臺上用滅菌的濾布過濾得到浸提液，冷卻到常溫備用；dl、按羊血與浸提液體積比為2 :7-8計把無菌脫纖維綿羊血加入到浸提液中，混合均勻製得復壯劑，放入2V _6°C的冰箱內保存； (2)透明質酸菌種復壯 a2、配製透明質酸固體培養基，高溫滅菌後冷卻至50°C -60°C ；b2、在無菌操作臺上將固體培養基體積12-16%的復壯劑加入到固體培養基中，搖勻後再倒到平板中冷卻到室溫，得到復壯平板； c2、把退化的透明質酸菌種斜面或甘油管取出活化25-35分鐘，然後用接種環挑出退化菌種在復壯平板上劃線； d2、把劃好線的復壯平板放在培養箱中培養30-40小時，直到菌種在平板上出現透明質酸單菌落，再用接種環挑出單菌落進行斜面培養，培養好後得到復壯好的菌种放入冰箱進行保存。
2.根據權利要求I所述的一種透明質酸菌種復壯新方法，其特徵在於步驟a2所述的固體培養基和步驟d2所述的斜面培養採用的培養基配製如下先分別稱取腦心浸粉37克、酵母粉10克、葡萄糖I克、七水硫酸鎂2克，然後一起溶解於IOOOmL水中，溶解完全後調節液體PH值到7. 2，最後將25克瓊脂剪碎放入配製得到。
3.根據權利要求I或2所述的一種透明質酸菌種復壯新方法，其特徵在於步驟a2所述的高溫滅菌是在121 °C高溫條件下滅菌30分鐘，步驟d2所述的把劃好線的復壯平板放在350C _40°C培養箱中培養，所述的復壯好的菌种放入2V _6°C冰箱進行保存。
全文摘要
本發明涉及一種透明質酸菌種復壯新方法，該方法利用常見的動物材料(羊血)和植物材料(土豆和玉米)通過特殊的處理方法得到復壯劑，具體步驟先將土豆和玉米混合絞碎，再加入水；加熱至沸騰2.5-3.5小時，並蒸發掉混合物體積50%-70%的水；然後過濾得到浸提液備用；最後把無菌脫纖維綿羊血加入到浸提液中混合均勻製得復壯劑。復狀劑按一定比例加入到透明質酸菌種選擇固體培養基中，製成復壯平板，然後把退化的菌種用接種環接到該平板中進行劃線分離，培養後獲得性能良好的透明質酸菌種。本發明復壯劑原料易得，製作和使用過程簡單，使用該方法使菌種的復壯機率提高10倍以上，而且得到的菌種性能良好，產酸率提高30%左右。
文檔編號C12N1/00GK102703322SQ201210233180
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者劉樹新, 歐韋福, 黃雲兵 申請人:柳州市柳化集團大力透明質酸有限公司