一種脂肪酶鍵合固定相及其製備方法和用途的製作方法

2023-08-03 19:48:21 2

專利名稱：：一種脂肪酶鍵合固定相及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種脂肪酶鍵合固定相及其製備方法和用途，屬於色譜固定相製備領域。技術背景用固定化酶作為液相色譜固定相拆分對映體早有文獻報導。1988年，Wainer等人提出了用固定化糜蛋白酶作為液相色譜的固定相來拆分手性物質。拆分了很多胺基酸、胺基酸的衍生物及二肽。1989年，他們用同樣的方法合成了固定化胰蛋白酶拆分了大量O-衍生化的外消旋胺基酸。1989年，Kalbe等人固定化了糜蛋白酶和胰蛋白酶，拆分了大量芳香族和脂肪族的胺基酸酯。1992年，Marl等人合成了4種固定化糜蛋白酶，拆分了大量的對映體。2001年G,Fe'lk等人固定化了青黴素酶，他們在製得的固定相分離了大量的手性羧酸，並且該固定相作為在線反應器對某些酯也具有不對稱水解效果。到目前為止，還未有人報導將固定化脂肪酶作為液相色譜固定相用於拆分對映體。
發明內容本發明的目的是提供一種脂肪酶鍵合固定相及其製備方法和用途，以提高酶在載體表面的鍵合量，保留酶的活性，提高柱效。為實現上述目的，本發明的技術方案為一種脂肪酶鍵合固定相，其特徵在於，該固定相由表面帶有醛基的球形矽膠填料與脂肪酶的氨基以亞胺鍵直接鍵合，而後把亞胺還原為氨基製得。所述固定相製備方法的具體步驟為1)環氧基矽膠的製備在100mL三口瓶中加入3.0g球形矽膠和50mL10。/o的鹽酸溶液，加熱回流1214h後，停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，60°C真空乾燥12h，將乾燥好的矽膠置於100mL三口瓶中，然後加入58mL3-縮水甘油丙氧基三甲氧基矽烷和50mL無水甲苯，氮氣保護下於11(TC回流攪拌反應12~14h，然後停止加熱，抽濾，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己垸洗淨，60°C真空乾燥12h;2)二醇基矽膠的製備將上述步驟l)中製備的環氧基矽膠置於500mL三口瓶中，然後加入300mL、pH-34的硫酸溶液回流攪拌反應1.5h，然後停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，室溫下真空乾燥12h;3)醛基矽膠的製備將上述步驟2)中製備的二醇基矽膠置於100mL三口瓶中，然後加入60mL90n/。的醋酸水溶液和23g高碘酸鈉攪拌反應2h，抽濾，用蒸餾水洗淨；4)脂肪酶鍵合固定相的製備稱取南極假絲酵母脂肪酶B150~600mg，置於250mL三口瓶中，加入100mL、pI^56的0.1mol/L醋酸鹽緩衝液，攪拌溶解，加入上述步驟3)中製備的醛基矽膠3g和75mg氰基硼氫化鈉，於04'C攪拌反應3~5天，抽濾，用pI^8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液洗淨；所得固定相在100mLp1^8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液中，在23h內分3次共加入硼氫化鈉75mg,每次25mg，以還原矽膠表面剩餘的醛基，抽濾，用pH-8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液洗淨，得到所需脂肪酶鍵合固定相。所述球形矽膠的粒徑為530微米，孔徑為2004000埃。所述球形矽膠由日本富士公司購得；所述南極假絲酵母脂肪酶B由荷蘭Chiralvision公司購得。所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱及在線液相色譜反應器填料。所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱填料，分離手性化合物。所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱填料，分離l-萘乙醇、2-萘乙醇、1-萘丙醇、2-萘丙醇或烯唑醇。所述脂肪酶鍵合固定相用作在線液相色譜反應器填料，催化手性仲醇酯和3-氯-l-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不對稱水解。本發明的優點1)該脂肪酶鍵合固定相具有很高的手性識別能力，裝填有這種固定相的色譜柱，既可以用做手性色譜柱，又可以用做在線液相色譜反應器；2)該脂肪酶鍵合固定相的化學性質相當穩定，三個月之內都可以保持相當高的活性；3)該脂肪酶鍵合固定相的製備成本相對較低，不論是裝填分析柱還是製備柱都有很好的應用前景。圖1為l-萘乙醇的拆分譜圖；圖2為2-萘乙醇的拆分譜圖；圖3為l-萘丙醇的拆分譜圖；圖4為2-萘丙醇的拆分譜圖；圖5為烯唑醇的拆分譜圖；圖6為2-萘乙醇乙酯的不對稱水解譜圖；圖7為2-萘乙醇丙酯的不對稱水解譜圖；圖8為4-甲氧基苯乙醇丙酯的不對稱水解譜圖；圖9為4-甲基苯乙醇丙酯的不對稱水解譜圖；圖10為3-氯-l-(2-噻吩)丙醇丁酯的不對稱水解譜圖。具體實施方式以下實施例用於解釋本發明，但是這些實施例不以任何方式限制本發明的範圍。實施例l:環氧基矽膠的製備在100mL三口瓶中加入3.0克球形矽膠(粒徑5微米，孔徑300埃，曰本富士公司)和50mL10。/。的鹽酸溶液，加熱回流12h，然後停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗漆至中性，6(TC真空乾燥12h。將乾燥好的矽膠置於100mL三口瓶中，然後加入5mL3-縮水甘油丙氧基三甲氧基矽烷和50mL無水甲苯，氮氣保護下於ll(TC回流攪拌反應12h，然後停止加熱，抽濾，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己烷洗淨，6(TC真空乾燥12h。實施例2:二醇基矽膠的製備將上述環氧基矽膠置於500mL三口瓶中，然後加入300mLpH=3的硫酸溶液回流攪拌反應1.5h，然後停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，室溫下真空乾燥12h。實施例3:醛基矽膠的製備將上述二醇基矽膠置於100mL三口瓶中，然後加入60mL90%的醋酸水溶液和3g高碘酸鈉攪拌反應2h，抽濾，用蒸餾水洗淨。實施例4:脂肪酶鍵合固定相的製備稱取南極假絲酵母脂肪酶B300mg(荷蘭Chiralvision公司)，置於250mL三口瓶中，加入100mLpH^6的0.1mol/L醋酸鹽緩衝液，攪拌溶解，加入上述實施例3中製備的醛基矽膠3g和75mg氰基硼氫化鈉，於24。C攪拌反應3天，抽濾，用pI^8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液洗淨；所得固定相在100mLpH=8的O.lmol/L磷酸鹽緩衝液中，在2h內分3次共加入硼氫化鈉75mg，每次25mg，以還原矽膠表面剩餘的醛基，抽濾，用pH=8的O.lmol/L磷酸鹽緩衝液洗淨，得到所需固定相。實施例5:色譜柱裝填上述固定相以pH=8的O.lmol/L磷酸鹽緩衝液為勻漿液，在4000psi壓力下裝入不鏽鋼柱(250mmx4.6mm)中。實施例6:對手性仲醇的分離裝填有上述固定相的色譜柱可以作為手性色譜柱來使用，可以拆分多種手性化合物。圖1-圖5為手性仲醇的拆分色譜圖。色譜實驗數據列於表1中。表1拆分部分手性仲醇的色譜實驗數據樣品名禾爾K！(X流動相流速1-萘乙醇0.321.50A0.5mlVmin2-萘乙醇0.371.21A0.5mL/min1-萘丙醇1.471.38Blmlv/min2-萘丙醇1.471.20BlmL/min烯唑醇2.131.52AlmL/min流動相A:pH=8的O.lmol/L磷酸鹽緩衝液:乙腈100/5流動相B:pH=8的O.lmol/L磷酸鹽緩衝液檢測波長230nm^為保留因子；a為選擇性因子實施例7:對手性仲醇酯的不對稱水解裝填有上述固定相的色譜柱又可以作為在線液相色譜反應器來使用，並且同時具備了酶催化的高立體選擇性與色譜分離的高效性。因此，當把消旋的底物進樣到此色譜系統中，在一次色譜過程中就可以得到某一種絕對構型的催化產物和另一種絕對構型的未反應的底物，並且產物與底物在此過程中還會被分離開。圖6、圖7、圖8和圖9是幾種手性仲醇酯的不對稱水解色譜圖。其中，每個圖的第一個色譜峰為水解產物一醇的峰，第二個峰為未水解的底物一酯的峰。色譜實驗數據列於表2中。tableseeoriginaldocumentpage9流動相pH=8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液:乙腈100/5流速lm!7min檢測波長230nm實施例8:3-氯-1-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不對稱水解抗抑鬱藥物度洛西汀的中間體,3-氯-1-(2-噻吩)丙醇的丁酸酯也可以在此固定相上被不對稱水解，轉化率和光學純度都很高。圖10是3-氯-l-(2-噻吩兩醇的丁酸酯的不對稱水解色譜圖。其中，第一個色譜峰為水解產物-醇的峰，第二個峰為未水解的底物一酯的峰，醇的絕對構型為R，ee值>99%。權利要求1.一種脂肪酶鍵合固定相，其特徵在於，該固定相由表面帶有醛基的球形矽膠填料與脂肪酶的氨基以亞胺鍵直接鍵合，而後把亞胺還原為氨基製得。2.權利要求1所述的脂肪酶鍵合固定相的製備方法，其特徵在於，所述方法具體步驟為1)環氧基矽膠的製備在100mL三口瓶中加入3.0g球形矽膠和50mL10。/。的鹽酸溶液，加熱回流1214h後，停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，60°C真空乾燥12h，將乾燥好的矽膠置於100mL三口瓶中，然後加入58mL3-縮水甘油丙氧基三甲氧基矽烷和50mL無水甲苯，氮氣保護下於11(TC回流攪拌反應12~14h，然後停止加熱，抽濾，依次用甲苯，甲醇，丙酮和正己垸洗淨，60°C真空乾燥12h;2)二醇基矽膠的製備將上述步驟l)中製備的環氧基矽膠置於500mL三口瓶中，然後加入300mL、pP^34的硫酸溶液回流攪拌反應1.5h，然後停止加熱，抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，室溫下真空乾燥12h;3)醛基矽膠的製備將上述步驟2)中製備的二醇基矽膠置於100mL三口瓶中，然後加入60mL90e/。的醋酸水溶液和23g高碘酸鈉攪拌反應2h，抽濾，用蒸餾水洗淨；4)脂肪酶鍵合固定相的製備稱取南極假絲酵母脂肪酶B150~600mg，置於250mL三口瓶中，加入100mL、pH-56的0.1mol/L醋酸鹽緩衝液，攪拌溶解，加入上述步驟3)中製備的醛基矽膠3g和75mg氰基硼氫化鈉，於04。C攪拌反應35天，抽濾，用pH-8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液洗淨；所得固定相在100mLpH二8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液中，在23h內分3次共加入硼氫化鈉75mg，每次25mg，以還原矽膠表面剩餘的醛基，抽濾，用pH-8的0.1mol/L磷酸鹽緩衝液洗淨，得到所需脂肪酶鍵合固定相。3.根據權利要求2所述的脂肪酶鍵合固定相的製備方法，其特徵在於，所述球形矽膠的粒徑為530微米，孔徑為2004000埃。4.根據權利要求2所述的脂肪酶鍵合固定相的製備方法，其特徵在於，所述球形矽膠由日本富士公司購得；所述南極假絲酵母脂肪酶B由荷蘭Chiralvision公司購得。5.權利要求l所述的脂肪酶鍵合固定相的用途，用作手性色譜柱及在線液相色譜反應器填料。6.根據權利要求5所述的脂肪酶鍵合固定相的用途，其特徵在於，所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱填料，分離手性化合物。7.根據權利要求5所述的脂肪酶鍵合固定相的用途，其特徵在於，所述脂肪酶鍵合固定相用作手性色譜柱填料，分離l-萘乙醇、2-萘乙醇、l-萘丙醇、2-萘丙醇或烯唑醇。8.根據權利要求5所述的脂肪酶鍵合固定相的用途，其特徵在於，所述脂肪酶鍵合固定相用作在線液相色譜反應器填料，催化手性仲醇酯和3-氯-l-(2-噻吩)丙醇丁酸酯的不對稱水解。全文摘要本發明公開了色譜固定相製備領域一種脂肪酶鍵合固定相及其製備方法和用途。該固定相由表面帶有醛基的球形矽膠填料與脂肪酶的氨基以亞胺鍵直接鍵合，而後把亞胺還原為氨基製得。該固定相具有很高的手性識別能力，既可以用作手性色譜柱的填料，又可以用做在線液相色譜反應器的填料；化學穩定性好，三個月之內都可以保持相當高的活性；製備成本也相對較低，不論是裝填分析柱還是製備柱都有很好的應用前景。文檔編號B01J20/30GK101574646SQ200910086839公開日2009年11月11日申請日期2009年6月8日優先權日2009年6月8日發明者呂春光,周志強,範鑫鑫,賀澤英申請人:中國農業大學