細菌聚集表面的處理的製作方法

2023-08-05 23:55:16 3

專利名稱：細菌聚集表面的處理的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用絲光綠蠅的幼蟲的分泌物處理聚集了能產生生物薄膜的細菌的表面的方法以及可用於此方法的組合物。
生物薄膜是在表面生長並且持續存在的生物膜。它們可存在於運輸或處理流體的工業設備的表面上、管道系統中以及在與這些設備或系統鄰近的表面上。它們通常存在於醫用植入物或插入到體內的裝置的表面上。它們也可形成於暴露於空氣的身體的區域；尤其是它們可存在於傷口中以及在肺的內層上。生物薄膜可被描述成包圍在粘附於表面的多糖基質內的細菌群落。
生物薄膜通常為穩定的形式，通過傳統方法很難對其進行處理。這取決於其中包埋了微生物的多糖生物薄膜基質的保護特性。
常規的藥物，諸如抗生素受生物薄膜中微生物的擴散壁壘或改變的新陳代謝狀態的影響而效果較小。
生物薄膜的形成被認為與微生物通過被稱為密度感受的過程進行的可擴散的信號分子的產生相關。這些分子被認為通過微生物啟動外多糖、外蛋白質及其它次級代謝產物的產生。幹擾這些分子作用的化合物可抑制生物薄膜的形成和/或削弱已經形成的生物薄膜。
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種最普通和最成問題的傳染性細菌。尤其是其形成的生物薄膜很難用常規的抗生素處理。銅綠假單胞菌形成的生物薄膜對於具有囊狀纖維化的患者是非常嚴重的問題，其中銅綠假單胞菌在所述患者的肺中繁殖會引起很難治療且最終常常致死的感染。
有效的傷口癒合是一個複雜的生理過程，其涉及許多的機制包括細胞遷移、生長因子的分泌、血管生成、組織n lelling以及有助於以協調以及以明顯分階段的方式來促進受控的組織再生的傷口的固有蛋白酶/抗蛋白酶平衡。
傷口護理產品在現代醫療實踐中是必要的，尤其是用於慢性創傷或燒傷患者的治療。許多不同的物質以前被認為具有有助於傷口癒合的活性。這些以前所討論的物質包括鏈激酶、膠原酶以及鏈道酶(全部獲自細菌來源)、菠羅蛋白酶(來自菠蘿)、纖溶酶和胰蛋白酶(獲自牛)以及磷蝦酶(獲自甲殼綱動物)。臨床試驗的數據顯示這些物質僅對促進傷口癒合部分地有效。
已知作為活生物體的麗蠅(green bottle fly)、絲光綠蠅的幼蟲(蛆)具有顯著的傷口癒合特性。利用絲光綠蠅幼蟲進行的清創術治療已成為被廣泛接受的臨床應用。然而，在文獻中很少有關於此方式的報導，其中這些幼蟲能夠將傷口淨化到通常非妥協性的傷口癒合的程度。癒合可以是機械的、生化的或兩者相結合的方式。我們的工作表明了可以利用體外分泌物來模仿這些幼蟲的作用。
儘管是有效的，然而活幼蟲對許多來說是使人厭惡的，並且通過在傷口上利用活幼蟲以及當使用幼蟲時不可避免地將它們的天然分泌物導入到傷口中，對於許多病人和對許多醫療工作者來說是無法接受的。使用活的生物體也增加了患者發生過敏性反應的危險。
已知絲光綠蠅幼蟲的排洩物/分泌物(ES)含有一種顯示出胰蛋白酶類絲氨酸蛋白酶活性的酶。本發明是基於發現了體外的ES也具有破壞細菌產生的低分子量信號分子的能力來測定細菌群落的密度，並且因此破壞生物薄膜所賴以形成的細菌信息網絡。
本發明的第一個方面提供了一種處理聚集了能產生生物薄膜的細菌的表面的方法，其包括用獲自絲光綠蠅分泌物/排洩物的具有N-醯基高絲氨酸內酯降解活性的物質接觸表面。典型地，所述的能產生生物薄膜的細菌為銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌。
目前通常比較接受的對生物薄膜的研究是更接近於細菌存在的自然模式而不是更廣泛地研究浮遊生物的系統。Thomas S.等，J.TissueViability，1999 Vol 9 No.4 p127-132報導了絲光綠蠅幼蟲的分泌物針對浮遊細菌細胞的抗微生物活性。我們尚不能重複這些結果。然而，在我們的實驗中，我們已經發現在實驗室的條件下，絲光綠蠅幼蟲的分泌物具有阻止或減少細菌性的生物薄膜形成的活性。去除傷口中的細菌性的生物薄膜在與感染進行的鬥爭中將是有利的。
我們的實驗顯示作為細菌性的生物薄膜的一部分而形成的外多糖被通過絲光綠蠅分泌物的作用去除。這些作用有說服力地表明了在分泌物中存在糖苷酶活性。
慢性傷口的癒合已被證明由於細菌感染的存在而削弱。感染的水平影響癒合和惡化之間的平衡。導致傷口組織缺氧和病變作用的細菌是有效癒合的阻礙。
眾所周知，可擴散的低分子量的信號分子允許單獨的細菌來測定群體密度，並且因此當集聚「密度」時以一種協調的方式進行作用。這些作用，通常被稱為「密度感受」，現在已知它調控病原體中毒性決定因子的產生，因此確保感染危險期的鞏固的攻擊。已知低分子量的信號分子(密度感受分子)包括N-醯基高絲氨酸內酯，例如，來自銅綠假單胞菌(參見

圖1)的N-丁醯基L-高絲氨酸內酯(BHL)和N-(3-氧代十二烷基)-L-高絲氨酸內酯(OdDHL)。內酯也引起真核生物組織中的細胞程序性死亡，因此在抵抗傷口癒合所需的組織再生中起作用。顯然破壞這些信號分子將減少細菌對宿主組織的有效攻擊的能力。我們通過實驗表明，絲光綠蠅幼蟲的分泌物具有降解BHL和較小程度的降解OdDHL的活性。一旦細菌形成一種生物薄膜，BHL被認為是更有活性的。我們已發現這些活性為熱穩定的，然而對苯基甲磺醯氟(PMSF)和4-氨基苯基-甲磺醯氟(APMSF)是敏感的，已知其中所述的苯基甲磺醯氟(PMSF)和4-氨基苯基-甲磺醯氟(APMSF)抑制絲氨酸蛋白酶和酯酶的活性。
來自絲光綠蠅幼蟲的分泌物可以通過用磷酸鹽緩衝液洗滌無菌的幼蟲，然後在無菌的條件下過濾來收集。
我們令人驚訝地發現，當幼蟲的分泌物與常規的抗生素諸如四環素結合使用時，具有大於幼蟲分泌物和抗生素分別單獨地使用時各自的作用。因此，當組合使用時這些單獨的物質之間具有某些協同作用。因此，根據進一步的方面，本發明提供了包括絲光綠蠅幼蟲的分泌物和一種或多種抗生素化合物的抗微生物組合物。在一個優選的實施方案中，所述的抗生素化合物為四環素。
在我們研究的過程中，我們意識到幼蟲分泌物的很多重要組分可能被忽略了，如它們可以是在血淋巴或其它組織中通過暴露於細菌就可誘導的(如Hoffmann等在Drosophila melanogaster中描述的(1999))而不是組成型表達的。因此，我們測試了在體外暴露於用於在血淋巴中產生抗微生物化合物的細菌之後表型改變的絲光綠蠅幼蟲。
可利用任意已知的皮膚傳遞系統或輸入到無菌載體諸如膏藥中以敷料的形式將添加或者沒有添加常規抗生素的無菌分泌物輸送到傷口區域上，來用於傷口區域。
實驗用於製備絲光綠蠅(L.sericata)分泌物的方法1日齡的(1St齡蟲)叉葉綠蠅絲光綠蠅的幼蟲購自SurgicalMaterials Testing Laboratory(SMTL)Bridgend。
在無菌條件下飼養且利用無菌設備以及在層流櫥櫃中收集所有這些絲光綠蠅幼蟲的分泌物。在向每一通用樣品(含有大約200個幼蟲)中添加200μl磷酸的緩衝鹽水溶液(PBS)後，收集分泌物。在移取(無菌移液管)、離心(13,000xg 10分鐘)和冷凍(-20℃)分泌物之前用PBS洗滌幼蟲。在第二次洗滌之前，讓幼蟲休息40分鐘，然後重複進行第三次洗滌。
測定所收集的分泌物的蛋白質含量(BioRad蛋白測定試驗)和蛋白酶活性(異硫氰胺螢光素標記的(FITC)酪蛋白)。無菌過濾分泌物(22μm過濾)並等分備用且在-20℃儲藏。
1.絲光綠蠅ES與常規抗生素的協同作用利用最小抑菌濃度試驗在96孔平皿中測定抑制浮遊細菌生長的ES的濃度-通過在492nm處吸光率的增加來測定生長。
與Thomas等(1999)的觀察進行比較的結果表明，由絲光綠蠅在無菌條件下生長產生的ES對革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌(分別為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌)的生長沒有抗生作用(圖2)。
類似地，在492nm處進行24h的吸收之後，比較ES和加熱變性(沸騰10分鐘)的ES以及常規抗生素四環素對銅綠假單胞菌生長的影響(圖3)。10μg/ml四環素完全破壞生長。相比之下，活性的ES顯示通過此方法測定的生長的微弱增強(可能取決於生物薄膜剝離-參見下面的圖4)。然而，利用亞致命水平的四環素與ES結合，發現在降低細菌生長的這兩者之間具有協同效應(圖4)。這也通過用24小時後的菌落數來證實，其中發現四環素和活性ES的組合將活菌數減少了三分之一。
結論是，單獨的絲光綠蠅分泌物對浮遊條件下的細菌生長不具有抗生作用，然而與常規的抗生素四環素一起具有協同效應。
2.在存在絲光綠蠅ES的條件下減少生物薄膜的形成目前通常比較接受的是，對生物薄膜的研究是更接近於細菌存在的自然模式，而不是更廣泛使用的但是不適當的浮遊生物系統。去除傷口中的細菌性生物薄膜在與感染進行的鬥爭中將是有利的。
利用O′Toole和Kolter(1999)的結晶紫法測定在存在絲光綠蠅ES時生物薄膜形成的減少。
在96孔平皿中培養生長24h，然後在去除浮遊細菌之後測定附著的細菌(參見第3部分)。在溶解和在540nm處測定染色的吸光率之前用結晶紫染料染色所附著的細菌。在絲光綠蠅ES的存在下，測定金黃色葡萄球菌生物薄膜在生物薄膜形成中的劑量反應減少達24之久(圖5a)。在ES存在時溫育蓋玻片的培養生長中，在銅綠假單胞菌生物薄膜形成中發現類似的減少。利用Baclight染色來顯像微菌落(圖5b和5c)。
結論是，在實驗室的條件下絲光綠蠅分泌物對於阻止細菌膜的形成是有活性的。
3.絲光綠蠅ES產物的糖苷酶活性當培養物在存在絲光綠蠅ES產物的條件下生長時，在產生生物薄膜的條件下生長的培養物中回收的細胞顯示出了差異。培養物在96孔微滴定板中的100μL等分試樣中生長。與燒瓶生長培養相比，這樣具有增加液體與塑料孔表面接觸的表面面積的作用，由此促進了生物薄膜的增長。從過夜的培養物接種銅綠假單胞菌並生長到早期的指數生長期，然後稀釋(1/2000)來得到～103個細胞/孔。培養物然後在存在ES、滅活ES(沸騰10min)或磷酸鹽緩衝液(對照)的條件下生長。37℃過夜培養培養物，然後收集每一種等分試樣並離心(13,000xg 10分鐘)回收細胞。結果表明(圖6)，在對照和滅活ES樣本中存在的「粘液層」，而在活性ES存在時卻不存在。加入活性ES的等分試樣到樣本D(變性ES)中，然後在37℃溫育過夜導致最初形成的粘液層被除去。我們認為粘液層可能包括作為生物薄膜的一部分的外多糖，並且通過絲光綠蠅ES中的糖苷酶可使其去除。就銅綠假單胞菌而言，人們認為其外多糖是藻酸鹽(一種由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸構成的聚合物)。
結論是酶催化除去外多糖將降低細菌形成有效的生物薄膜並且因此在傷口中形成一種有效的感染的能力。
4.通過來自絲光綠蠅排洩/分泌產物(ES)的熱穩定的PMSF/APMSF-敏感的活性(內酯酶)使銅綠假單胞菌的密度感受信號分子失活可利用薄層色譜法(TLC)測定BHL和OdDHL(分別為RP18F245S或RP2UV254板)。在色譜層析之後，信號分子的位置和量可以通過它們對生物傳感器生物的影響來顯示。當和BHL或HL接觸時，所使用的特定生物會發光。因此，如果將TLC板用含有生物傳感器生物的軟瓊脂覆蓋，則溫育一段時期後，通過光線的發射顯示了信號分子的位置。通過轉換成假的顏色顯示了發射光的強度，其中最強烈的光顯示為黃色並且漸變為最弱的-深藍色(附圖7-側面的條棒)。
通過下列的溫育測試絲光綠蠅分泌物對BHL的作用1.100μl ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL2.100μl沸騰的ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL3.100μl ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL4.用APMSF(2mM)預溫育的100μl ES(120μg/ml蛋白)+100μM BHL5.在緩衝液(磷酸鹽緩衝液)中的100μMBHL溫育6小時後，每一溫育的1μl被用於RP18F254STLC板並在如上所述利用生物傳感器覆蓋來顯示BHL之前用60％(v/v)甲醇/水進行分離。
結果(圖7)證實了幼蟲ES對降低BHL的作用。陽性對照(泳道5)表明光產生來自單獨的BHL。在幼蟲ES(泳道1)存在下與BHL一起溫育時光產生降低(泳道1)，表明了信號分子的降解。通過將ES與苯基甲磺醯氟(PMSF)(泳道4)一起預溫育阻止了此降解以及通過將ES與4-氨基苯基-甲磺醯氟(APMSF)一起預溫育在較低的程度上阻止了此降解(泳道3)(絲氨酸蛋白酶活性的抑制劑)。煮沸的ES(泳道2)沒有阻止降低，由此表明了活性的熱穩定性。
此外，實驗證實了ES對在6小時的溫育開始時和結束時採集的OdDHL(附圖8和9)比較樣品有類似的作用。
這一次，在RP2/UV254板上利用45％(v/v)甲醇/水進行色譜層析。降解導致了第二種物質的出現，確信它為OdDHL分子的開環。這有待於通過柱層析(通過C18柱進行高效液相色譜)來證實。同樣，該降解對煮沸是穩定的但其受PMSF抑制和在較少程度上受APMSF抑制。
結論是，絲光綠蠅幼蟲ES具有對能降解BHL和OdDHL的PMSF和APMSF敏感的熱穩定活性，其中的BHL和OdDHL是兩種涉及銅綠假單胞菌的生物薄膜形成和感染並且由此與傷口癒合有關的信號分子。
5.絲光綠蠅中抗微生物活性的誘導絲光綠蠅的無菌幼蟲獲自Surgical Materials TestingLaboratory SMTL(Princess of Wales Hospital，Bridgend CF311RQ)。
將幼蟲培養在Sherman(1995)所描述的培養基上，該培養基包括分解的豬肝和細菌培養用瓊脂，用在密閉容器中的高壓滅菌器進行殺菌，其中的密閉容器允許氣體和溼氣在容器的內部和外部之間交換但其阻止細菌進入到容器中。在容器的基體中提供用於幼蟲的培養基的薄膜層。
將無菌的第一齡幼蟲(200個)懸浮在200μl的無菌磷酸鹽緩衝液中並轉入到容器中。在保溼室中在28℃的無菌條件下培養48個小時，來允許幼蟲的產生。將銅綠假單胞菌的突變體PAO P47接種到10mlLuria Bertani(LB)培養基中並在37℃振蕩培養過夜。給容器接種1ml(～108活菌數)的培養物並且允許幼蟲在細菌的存在下培養。在另一48h之後，處死幼蟲並在脊前部切口收集血淋巴。微離心(13,000xg持續10分鐘)血淋巴以除去細胞。
通過在含有大腸桿菌D31的細菌菌苔中的2μl血淋巴的微孔周圍無菌噬菌斑的形成來評估抗微生物的活性。接種1μl的培養物到7ml的熔化(50℃)的含有10μg/ml鏈黴素和5mg....yso酶的1％LB瓊脂中來製備平板。這些在無菌皮式培養皿中形成。利用模板以距離平板邊緣等間距的規則模式來形成微孔(8)。通過與用2μl分別為100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的天蠶素B(Sigma)產生的噬菌斑進行比較來評估抗微生物活性(附圖10)。通過銅綠假單胞菌誘導48h之後獲得的血淋巴產生的5mm直徑的抗微生物噬菌斑大於那些用10μg/ml標準的天蠶素產生的抗微生物噬菌斑(4.25mm)但小於用100μg/ml標準的天蠶素產生的抗微生物噬菌斑(8mm)。
結論是，通過在培養過程中暴露於銅綠假單胞菌誘導後，在絲光綠蠅的血淋巴中發現了抗細菌活性。
參考文獻OT′oole，G.A.和Kolter，R.(1999)，通過多重的、收斂的信號途徑引發螢光假單胞菌WCS365中生物薄膜的形成一種遺傳分析，Molecular Microbiology 28449-461.
Sherman，R.A.和Tran，J.M.(1995)，用於飼養絲光綠蠅(Diptera；Calliphoridae)幼蟲的簡單的無菌食物來源，Medical andVeterinary Entomology 9393-398.
Thomas，S.，Andrews，A.M.，Hay，N.P.和Bourgoise，S.(1999)蛆分泌物的抗微生物活性初步研究的結果，J.Tissue Viability 9127-132.
Hoffmann，J.A.，Kefatos，F.C.，Janeway，C.A.和Ezekowitz，R.A.B.(1999)，先天免疫中的系統發育前景，Science 2841313-1318.
權利要求
1.一種處理聚集了能產生生物薄膜的細菌的表面的方法，其包括使獲自絲光綠蠅分泌物/排洩物的具有N-醯基高絲氨酸內酯降解活性的物質與表面接觸。
2.根據權利要求1的方法，其中所述的表面選自金屬表面、玻璃表面和塑料材料的表面。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述的表面為醫療裝置或植入物的表面。
4.根據權利要求1的方法，其中所述的表面為傷口表面。
5.根據權利要求1到4中任意一項的方法，其中所述的能夠產生生物薄膜的細菌為銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌。
6.根據權利要求1到5中任意一項的方法，其中在包括另外一或多種抗生素化合物的組合物中提供所述的物質。
7.根據權利要求6的方法，其中所述的抗生素化合物為四環素。
8.一種包括分離自絲光綠蠅的分泌物/排洩物或其類似物以及一種或多種抗生素化合物的抗微生物的組合物。
9.根據權利要求8的組合物，其中所述的抗生素化合物為四環素。
10.一種抗微生物的組合物，它包括作為活性成分的分離自絲光綠蠅的分泌物/排洩物的具有N-醯基高絲氨酸內酯-降解活性的物質或其類似物以及載體。
11.一種抗微生物的組合物，它包括作為活性成分的分離自絲光綠蠅的分泌物/排洩物的絲氨酸蛋白酶或其類似物以及載體。
12.一種抗微生物的組合物，其包括作為活性成分的分離自絲光綠蠅的分泌物/排洩物的糖苷酶或其類似物以及載體。
13.一種抗微生物的組合物，其包括作為活性成分的分離自絲光綠蠅的分泌物/排洩物的具有無蠶素類活性的物質或其類似物以及載體。
14.根據權利要求10到13中任意一項的組合物，它還含有一種或多種抗生素化合物。
15.根據權利要求14的組合物，其中所述的抗生素化合物為四環素。
16.一種含有獲自絲光綠蠅幼蟲的無細胞血淋巴的抗微生物組合物，其中讓絲光綠蠅幼蟲生長在存在銅綠假單胞菌或所述血淋巴的一種或多種活性組分或該組分的合成類似物的條件下。
17.一種含有權利要求8到16中任意一項的組合物以及載體的傷口敷料。
全文摘要
本發明提供了通過與具有N－醯基高絲氨酸內酯降解活性的物質接觸來處理聚集了能產生生物薄膜的細菌的表面，其中所述的具有N－醯基高絲氨酸內酯降解活性的物質獲自麗蠅、絲光綠蠅(Luciliasericata)幼蟲的分泌物和/或排洩物。此外，當所述的幼蟲分泌物/排洩物與抗生素，例如四環素結合使用時可獲得協同作用。這些獲自絲光綠蠅幼蟲分泌物和/或排洩物的具有N－醯基高絲氨酸內酯降解活性的物質也構成了本發明的一部分。
文檔編號A61L15/44GK1649606SQ03809944
公開日2005年8月3日 申請日期2003年3月6日 優先權日2002年3月9日
發明者D·I·普裡查德 申請人:英國國防部