定量檢測hpv16/18型感染的螢光pcr試劑盒的製作方法

2023-08-05 16:35:11

專利名稱：：定量檢測hpv16/18型感染的螢光pcr試劑盒的製作方法
技術領域：
：本發明屬於體外核酸檢測領域，尤其涉及一種在臨床樣本中同時定量檢測高危16和(或者)18型HPV(人乳頭瘤病毒)感染的螢光PCR(聚合酶鏈式反應)試劑盒。
背景技術：
：宮頸病變是女性最常見的疾患之一，其最嚴重的發展結局是宮頸癌。現認為官頸癌是全球性公共衛生問題。中國每年的新發病例超過13萬，佔世界發病的28%，且近年來在廣大農村地區有增高趨勢，並呈現發病年齡提前的現象。在全球致力於宮頸癌研究的學者們的共同努力下，WHO於1996年宣布，HPV持續感染是宮頸癌的直接病因。人類乳頭瘤狀病毒(HumanPapilomaviruses，HPV)是一類具有嚴格宿主範圍和組織特異性的DNA病毒，感染人的皮膚和黏膜上皮細胞，寄生在磷狀和柱狀上皮層，可通過直接或者間接接觸汙染物品或性途徑傳播，引起感染部位的良性和惡性病變。HPV是一類在自然界廣泛傳播的病毒，人類感染HPV十分普遍，多數人往往同時感染多型病毒。HPV目前確定的型別有100多種，大約有35種與生殖道感染有關，其中約20種與腫瘤有關。依據不同型別HPV與癌發生的危險性高低分為低危型HPV如HPV6、11、42、43、44等，常引起良性病變，高危型HPV如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，與宮頸癌及宮頸上皮內高度瘤變(CIN2/3)的發生相關。據統計，在全世界範圍內，每年有27萬女性死於宮頸癌。研究表明，HPV是引發宮頸癌的元兇，其中HPV16/18型是引發婦女子宮腫瘤的最主要的類別——至少引發全世界70%以上的宮頸癌病例。HPV是威脅女性健康乃至生命的"隱形殺手"。在我國，85%的宮頸癌由HPV16/18型引發，這一數據明顯高於全球平均水平。自從1977年Lavedy觀察到宮頸活檢組織中存在HPV後，隨著現代科研水平的不斷提高我們不僅從宮頸組織中分離到了HPV，而且還對其進行了分型。2002年Clifford等對2000年2月前的85項涉及全球範圍的10058例官頸癌患者的研究進行Meta分析，發現HPV16為宮頸癌患者中最常見亞型，感染率為51%;HPV18型位居其次，佔16.2%。在國際癌症研究協會(IARC)最新報導的包括全球25個國家的3607例宮頸癌患者的多中心研究中顯示，HPV16在所有HPV陽性的宮頸癌患者中的平均感染率為57.4%。HPV感染高峰年齡在1828歲。HPV檢出期較短，約23年。HPV感染期也短，常在810個月可消失。持續、反覆發生的HPV感染與子宮頸癌關係密切，但通常無明顯臨床症狀，不易引起人們的重視，只有通過人群篩查才能對感染者進行監測。現有對HPV的檢測方法有細胞學檢測、斑點印跡法、螢光原位雜交法、原位雜交法、Southern雜交法、多聚合酶鏈反應(PCR)和雜交捕獲法。各種方法的敏感性和特異性各不相同。目前臨床應用較為普遍的是細胞學檢測、多聚合酶鏈反應(PCR)和雜交捕獲法。細胞學檢查價格低廉，但是存在靈敏度低、特異性差、假陰性率和假陽性率高、不能對HPV進行分型；雜交捕獲法靈敏度和特異性均較好，但是存在交叉汙染、費用昂貴等問題；利用該法進行HPV分型需要將HPV常見基因型逐個篩選才能最後確定感染的HPV型別，成本高。螢光PCR技術在1995年由美國PE公司率先研製成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，結果直觀，能直接監測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結果可實時觀察，產物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了PCR產物汙染的風險。螢光PCR技術的螢光探針以發展形成多種類型，如T叫man探針，FRET探針等，本方法涉及的是T叫man探針技術。其工作原理是它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5'—3'酶切活性所降解，探針的5'端有一螢光報告基團，3'端有一螢光淬滅基團，當兩個基團相互先靠近的時候，由於發生能量傳遞作用，報告基團不能發出螢光，但隨著擴增反應的進行，5'端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅發生能量傳遞作用，從而能發出螢光，被信號探測器所捕獲。常同探針5'端相結合的基團有FAM(6-羧基螢光素)，TET(四氯_6-羧基螢光素)，JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基螢光素)，HEX(六氯-6-甲基螢光素)或VIC等，常與3'端相結合的螢光淬滅基團常為TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL(4-(4'-惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。目前市場上還沒有利用螢光PCR技術進行HPV檢測的產品。
發明內容為克服傳統方法對高危型HPV檢測的缺點，本發明提供一種特異性高、成本低並且能夠作定量分型檢測的檢測產品。本發明提供了一種定量檢測HPV(人乳頭瘤病毒)16/18型感染的螢光PCR(聚合酶鏈式反應)試劑盒，包括定量參考品、陰性參考品、強陽性對照品、臨界陽性對照品、UNG酶、Taq聚合酶、螢光PCR反應液，以及DNA提取液；所述的螢光PCR反應液包括PCR分型引物、特異性螢光探針。所述的定量參考品、強陽性對照品和臨界陽性對照品為含有插入HPV16和HPV18型特異序列的PMD18-T載體質粒，所述的插入序列分別如下HPV16型核酸插入序列為atacacagcggctggtttgggcctgtgtaggtgttgaggtaggtcgtggtcagccattaggtgtgggcattagtggc77bp;hpvl8型核酸插入序列為tcaatatccccttggacgtaaatttttggttcaggctggattgcgtcgcaagcccaccataggccctcgcaaac74bp。所述的定量參考品為存放濃度為1.0Xl(^-5.0Xl(T拷貝/微升的重組質粒。使用時可按梯度稀釋，用於做定量判斷的參考。所述的陽性對照品重組質粒濃度為1.OX106_5.OX106拷貝/微升；所述的臨界陽3重組質粒濃度為1.OX104_5.OX104拷貝/微升。所述的陰性參考品為HPV陰性血清。所述的PCR分型引物序列如下擴增檢測HPV16型的正向引物atacacagcggctggtttgg20擴增檢測HPV16型的反向引物gccactaatgcccacacctaat22擴增檢測HPV18型的正向引物tcaatatccccttggacgtaaa22性對照f擴增檢測HPV18型的反向引物gtttgcgagggcctatggt19。所述的特異性螢光探針序列如下檢測HPV16型的探針ctgaccacgacctacctcaacacttacac29;檢領ljHPV18型的探針cgacgcaatccagcctgaacca22。所述的特異性螢光探針為T叫man探針，標記探針5'端的為一種螢光報告基團，可以是FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMRA、CY3、CY5;3，端的為一種螢光淬滅基團，可以是TAMRA、DABCYL、NFQ。在本發明的反應體系中，可以使用一個或者多個螢光探針，所標記的螢光報告基團可以為一種或者兩種。本發明與現有技術相比具有以下優點和效果①定量準確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術精確定量的優點，結果直觀，能直接監測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結果可實時觀察，產物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了PCR產物汙染的風險；②靈敏度和特異性高。由於採取特異性和引物和探針的雙保險設計，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床症狀出現之前檢測到病毒的感染；③檢測速度快，加上樣本提取總共僅需2-3個小時；步驟簡單；⑤可同時進行高通量的樣本檢測。總之螢光PCR技術靈敏度高，特異性好，可實時監測反應進程，反應時間可控制在兩個半小時以內，而且是閉管操作，無需後續處理，可最大限度避免反應產物汙染，可以取代傳統細胞檢測或者普通PCR檢測進行HPV的早期診斷。圖1為HPV-16定量參考品的螢光PCR擴增曲線曲線從左到右分別為(2.0X107，2.0X106，2.0X105，2.0X104，2.0X103拷貝/微升)；圖2為HPV-16定量參考品的標準曲線，相關係數二0.9936，說明線性關係非常好，可用於HPVDNA拷貝數的定量分析；圖3為HPV-18定量參考品的螢光PCR擴增曲線，曲線從左到右分別為(2.0X107，2.0X106，2.0X105，2.0X104，2.0X103拷貝/微升)；圖4為HPV-18定量參考品的標準曲線，相關係數=0.9902，說明線性關係非常好，可用於HPVDNA拷貝數的定量分析；圖5為臨床樣本的HPV螢光PCR擴增曲線。所測得陽性樣本Ct值在2030之間，在定量參考品線性範圍之內。具體實施例方式應當理解，下面實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規採用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照製造廠商所建議的步驟和條件。實施例1:試劑盒的製備1.引物和探針設計與合成使用PrimerExpress2.0，針對HPV16和HPV18型的Ll區(研究表明HPV各型5基因組的LI區序列之間，具有一定的同源性序列和多態性序列，其序列差異是不同HPV型劃分的依據)，篩選處於保守區的探針，在選擇好的探針基礎上設計16和18型的上下遊引物。引物與探針均委託專業公司合成，其中引物為PAGE純化，探針為HPLC純化，探針5'端標記FAM螢光基團，3'端標記TAMRA螢光基團。擴增序列如表1:表l.特異性探針與引物序列序列名稱寡核苷酸序列(5'-3')鹼基長度(bp)HPV16探針ctgaccacgacctacctcaacacttacac29HPV18探針cgacgcaatccagcctgaacca22HPV16正向引物atacacagcggctggtttgg20HPV16反向引物gccactaatgcccacacctaat22HPV18正向引物tcaatatccccttggacgtaaa22HPV18反向引物gtttgcgagggcctatggt192.HPV質粒陽性模板定量參考品的製備本實施例中HPV質粒作為陽性模板用於製備定量參考品、強陽性對照品和臨界陽性對照品。使用步驟1中合成的擴增HPV16型和18型特異性引物擴增HPVLI區耙序列，將經過純化的PCR產物連接到PGEM-Teasy載體上；然後轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中；通過藍白斑篩選，分別構建HPV16和HPV18型重組質粒DNA作為靈敏度參考品。構建的HPV重組質粒經雙向DNA測序鑑定。提取質粒，紫外分光光度計定量，稀釋到2.0X1010拷貝/微升於-2(TC保存。3.對照品選擇使用無HPV血清為陰性對照；HPV16和HPV18重組質粒(2X106拷貝/微升)為強陽性對照;HPV16和HPV18重組質粒(2X104拷貝/微升)為臨界陽性對照。4.螢光PCR反應液組成表2.PCR反應液組成tableseeoriginaldocumentpage6原料名稱終濃度d證0.1-0.5mMHPV引物0.1-0.50iiMHPV探針0.1-0.50iiMUNG酶0.05-1UTaq酶0.5-3UH20適量DNA模版總體積飾L由於針對兩種HPV分型進行擴增，所以每一組引物和探針組成一種螢光PCR反應液，本試劑盒提供兩種螢光PCR反應液，分別用相應引物和探針檢測HPV16型和HPV18型。實施例2:試劑盒的使用1.樣本提取使用DNA提取液提取待測樣品中的HPV病毒核酸1)樣本前處理拭淨宮頸口過多的分泌物，用生理鹽水浸潤的棉拭子緊貼宮頸口黏膜稍用力轉動2周以取得分泌物和脫落細胞，將取樣後的棉拭子放入備有lml無菌生理鹽水的EP管中充分漂洗，貼壁擠幹。鹼裂解法提取HPV病毒。裂解液配方:60,1/LTrisHCl，pH8.0;0.5%SDS;200,1/LNaCl2)操作步驟取500ii1分泌物混勻於13000rpm離心10min，棄上清；加50裂解液，IO(TC保溫20min，13000rpm離心lmin，取上清2做PCR反應。2.定量參考品準備將HPV質粒陽性模板定量參考品用去離子水進行梯度稀釋，濃度分別為2.OX107，2.0X106，2.0X102，2.0X104，2.0X13拷貝/微升。3.樣本檢領lj分別取步驟1中提取的核酸，步驟2中獲得的梯度稀釋的定量參考品，臨界陽性對照、強陽性對照和陰性對照，作為DNA模板，加入UNG酶、Taq聚合酶、及含有特異性PCR引物和特異性螢光探針的螢光定量反應液中，組成PCR反應體系。在16和18型PCR反應體系中分別加入各自對應並且已經稀釋混勻好的HPV-16和HPV-18型質粒標準品(2.OX107，2.0X106，2.0X102，2.0X104，2.0X103拷貝/微升)，作為樣本定量判定的標準。該體系各主要成分如下PCR反應液37.5UNG酶0.05ulT叫酶0.4ulDNA模版2PL總體積40叱4.反應程序設置收集FAM螢光信號的螢光檢測通道，將反應管放入螢光PCR儀(ABI7500)開始擴增，反應程序如下表3.PCR反應程序步驟溫度時間循環數137°C2分鐘1395°C2分鐘1495°C15秒40560°Cl分鐘5.結果判斷基線範圍的Ct值(循環數)為6-15或由軟體自動選擇，設定閾值使之超過無規則擴增曲線的最高值。螢光PCR儀不同，所得基線範圍的Ct值會有所不同。6.質控標準(1)各類對照質控品判斷結果如下表表4.質控品標準檢測結果質控品標準檢驗結果1陰性對照無擴增2臨界陽性對照25<Ct值《303強陽性對照220.99時可用於HPVDNA拷貝數的定量分析；否則要重新實驗。圖1為HPV16型質粒定量參考品擴增後得到的擴增曲線，根據該曲線得到的標準曲線為圖2;圖3為HPV16型質粒定量參考品擴增後得到的擴增曲線，根據該曲線得到的標準曲線為圖4。7.結果報告圖5為臨床樣本的HPV螢光PCR擴增曲線。所測得陽性樣本Ct值在2030之間，在定量參考品線性範圍之內。8樣本結果的判斷標準如下表4.報告樣本檢測結果tableseeoriginaldocumentpage9序列表〈110〉上海裕隆基因科技中心有限公司〈120〉定量檢測HPV16/18型感染的螢光PCR試劑盒〈160>81〈211>77〈212>DNA〈213〉人屬(Homo)〈400>1atecacagcggctggtttgggcctgtgteggtgttgaggtaggtcgtggtcagccatteggtgtgggcattegtggc〈210>2〈211>74〈212>DNA〈213〉人屬(Homo〈400>2tcaatetccccttggacgteaatttttggttcaggctggattgcgtcgcaagcccaccataggccctcgcaaac〈210>3〈211>29〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉根據核酸鹼基配對原理和擴增條件設計，以用作診斷人乳頭瘤病毒1型感染的螢光PCR試劑盒的上遊引物，命名為HPV16探針。〈400>3ctgaccacgacctecctcaacacttecac〈210>4〈211>22〈212>DNA777429〈213>人工序列〈220〉〈223〉根據核酸鹼基配對原理和擴增條件設計，以用作診斷人乳頭瘤病毒16/18型感染的螢光PCR試劑盒的上遊引物，命名為HPV18探針。〈400>4cgacgcaatccagcctgaacca22〈210>5〈211>20〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根據核酸鹼基配對原理和擴增條件設計，以用作診斷人乳頭瘤病毒16/18型感染的螢光PCR試劑盒的上遊引物，命名為HPV16正向引物。〈400>5atacacagcggctggtttgg20〈210>6〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根據核酸鹼基配對原理和擴增條件設計，以用作診斷人乳頭瘤病毒16/18型感染的螢光PCR試劑盒的上遊引物，命名為HPV16反向引物。〈400>6gccactaatgcccacacctaat22〈210>7〈211>22〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根據核酸鹼基配對原理和擴增條件設計，以用作診斷人乳頭瘤病毒16/18型感染的螢光PCR試劑盒的上遊引物，命名為HPV18正向引物。〈400>7tcaatatccccttggacgtaaa22〈210>8〈211>19〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉根據核酸鹼基配對原理和擴增條件設計，以用作診斷人乳頭瘤病毒16/1810型感染的螢光PCR試劑盒的上遊引物，命名為HPV18反向引物。〈400>8gtttgcgagggcctatggt19權利要求一種定量檢測HPV(人乳頭瘤病毒)16/18型感染的螢光PCR(聚合酶鏈式反應)試劑盒，包括定量參考品、陰性參考品、強陽性對照品、臨界陽性對照品、UNG酶、Taq聚合酶、螢光PCR反應液，以及DNA提取液；所述的螢光PCR反應液包括PCR分型引物、特異性螢光探針。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的定量參考品、強陽性對照品和臨界陽性對照品為含有插入HPV16和HPV18型特異序列的PMD18-T載體質粒，所述插入的特異序列分別如下HPV16型核酸插入序列為atacacagcggctggtttgggcctgtgtaggtgttgaggtaggtcgtggtcagccattaggtgtgggcattagtggc77bp;hpvl8型核酸插入序列為tcaatatccccttggacgtaaatttttggttcaggctggattgcgtcgcaagcccaccataggccctcgcaaac74bp。3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於所述的定量參考品為存放濃度為1.OX101Q-5.OX101Q拷貝/微升的重組質粒。4.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於，所述的陽性對照品重組質粒濃度為1.0X106-5.0X106拷貝/微升；所述的臨界陽性對照品重組質粒濃度為1.OX104-5.OX104拷貝/微升。5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述的陰性參考品為HPV陰性血清。6.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的PCR分型引物序列如下擴增檢測HPV16型的正向引物atacacagcggctggtttgg20;擴增檢測HPV16型的反向引物gccactaatgcccacacctaat22;擴增檢測HPV18型的正向引物tcaatatccccttggacgtaaa22;擴增檢測HPV18型的反向引物gtttgcgagggcctatggt19。7.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的特異性螢光探針序列如下檢測HPV16型的探針ctgaccacgacctacctcaacacttacac29;8.如權利要求1或7所述的試劑盒，其特徵在於，所述的特異性螢光探針為T叫man探針，標記探針5'端的為一種螢光報告基團，可以是FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMRA、CY3、CY5;3'端的為一種螢光淬滅基團，可以是TAMRA、DABCYL、NFQ。全文摘要本發明公開了一種用於定量檢測人乳頭瘤病毒(HPV)16/18型感染的螢光PCR(聚合酶鏈式反應)試劑盒，屬於體外核酸診斷試劑盒領域。該試劑盒包括定量參考品、陰性參控品、陽性對照品、臨界陽性對照品、螢光聚合酶鏈式反應液、PCR分型引物和特異性螢光探針、DNA提取液。本發明包括一個以螢光PCR技術為基礎的多重PCR體系，包含針對16和18型HPV的正、反向引物和螢光探針，在適合的PCR條件下可以在一個反應管中同時檢測16和18型HPV的DNA；可以簡便快速地在臨床樣本中檢測HPV感染，特異性高，對宮頸癌的早期防治有很大的臨床價值。文檔編號C12Q1/70GK101781686SQ20091004543公開日2010年7月21日申請日期2009年1月16日優先權日2009年1月16日發明者汪寧梅,穆宇豪,穆海東,黎颯申請人:上海裕隆基因科技中心有限公司