用於檢測和測定綠原酸的抗體、方法和試劑盒的製作方法

2023-08-06 01:57:11

專利名稱：用於檢測和測定綠原酸的抗體、方法和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及小分子半抗原的抗體及其製備方法與應用，特別是涉及綠原酸及其衍生物的抗體及其製備方法與應用。
背景技術：
本發明涉及用於檢測和定量綠原酸的方法和試劑盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶聯物(conjugate)和抗體。
其中"檢測"是指定性分析物質是否存在。其中"測定"是指對物質進行定量分析。
綠原酸(Chlorogenic acid，以下簡稱CA),分子式C16H1809，分子量354.30，是由咖啡酸(Caffeic acid)與奎尼酸(Quinic acid， l-羥基六氫沒食子酸)生成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，系統名1， 3， 4， 5-四羥基環己烷羧酸-(3， 4-二羥基肉桂酸酯)，化學名3-0-咖啡醯奎尼酸(3-0-caffeoylquinic acid)。
中藥或中藥複方是一個複雜的巨系統，其中的化學成分具有結構多樣性和複雜性的特點。揭示中藥或中藥複方化學成分在體內靶器官的分布，細胞或亞細胞定位，以及體內分布的動態變化，時量一時效關係等，是闡明中藥或中藥複方作用耙點以及作用機理的關鍵環節。綠原酸作為抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，是金銀花、杜仲、忍冬藤、魚腥草、茵陳、梔子、清開靈注射液等藥材和中成藥，在藥典或國家標準中規定的定性和定量的指標成分。
從相關文獻可知，針對綠原酸的定性與定量，目前建立了多種檢測和測定分析方法，如薄層層析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色譜法。但含綠原酸的生物樣品(包括血漿、尿、唾液等)含有大量的影響含量測定的蛋白質及內源性物質；同時綠原酸可能呈結合狀態，必須經過處理，排除內源性雜質和代謝物的幹擾，使結合狀態的綠原酸游離後才能測定；同時還需要濃縮以滿足儀器檢測靈敏度的要求，處理程序複雜，費時費力；同時由於綠原酸進入體內後，組織中的分布是極其微量的，即使經過富集，進行含量測定仍是極其困難的。另外，對於綠原酸在靶器官和組織中分布，以及細胞和亞細胞定位的研究，需要通過免疫組織化學和western-blot等方法，但由於缺乏綠原酸的抗體，阻礙了此方面的研究。因此，有必要開發出一種用於檢側和測定生物樣品中綠原酸的方法，對闡明相關藥材或複方的作用機理，以及其體內分布和代謝研究，將具有特別的價值。

發明內容
本發明的半抗原綠原酸可提供確定的結構性抗原決定部位，但是它本身並不具備免疫原性，因此必須要偶聯到適宜的賦予抗原性的載體物質上，這樣所形成的免疫原才會在注射到宿主動物體內後誘發免疫應答。因此，本發明提供一種如下結構的免疫原-
o
其中R是0至6個碳的烷基橋(連接半抗原與載體物質的橋)，優選R = 0，即Pl直接與綠原 羰基碳原子結合，或R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的亞烷基， 更優選R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞垸基。
Pl是賦予抗原性的載體物質。載體物質選自蛋白質、蛋白質片合成的多肽或半合成的多 肽。其中蛋白質、蛋白質片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目鏡蛋白和脂蛋白，優選為 牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙種球蛋白、甲狀腺素結合球蛋白、鎖眼形血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin， KLH)，更優選自鎖眼形血藍蛋白或牛血清蛋白(BAS)。合成多肽或 半合成多肽是具有足夠數量的可利用氨基的合成聚胺基酸，優選多聚賴氨酸。合成或天然聚 合物是帶有反應官能基的聚合物材料，特別是能夠結合到半抗原產生免疫原的碳水化合物、 酵母或多糖。
半抗原的製備本發明描述了半抗原綠原酸在羧基處或任一羥基處與賦予抗原性的載體 物質發生的偶聯作用，產生免疫原。為了讓半抗原的結構特徵充分暴露，可在-C00H位點上 接上一個連接臂。據此以綠原酸為起始原料，同時以氯化亞楓，氨基丁酸或氨基己酸等為原 料，經過二步反應，合成了半抗原2和3。產物2和3純化後分別經質譜(MS)和核磁共振 氫譜和碳譜(1麗MR和13CNMR)確證。
免疫原的合成本發明的半抗原和蛋白質載體的連接可使用本領域己知的任何連接方 式。例如但不限於碳二亞胺法(EDC )、戊二醛法等。採用碳二亞胺法製備綴合物和免疫原時， 是將0. 2毫摩爾的半抗原綠原酸溶解在N, N-二甲基甲醯胺中，加入1. 5當量的二環己基碳二 亞胺和3當量的N-羥基琥珀醯亞胺，室溫下反應過夜，離心，取上清液加入到10-20mg/mL 的牛血清蛋白碳酸鹽緩衝溶液中，攪拌反應1-6小時，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0. Olmol/L 的PBS緩衝溶液透析3-5d，分裝保存於-2(TC的冰箱中。
合成免疫原的分析方法為了確認載體物質上結合有適當的半抗原，在免疫前，使用紫 外分光度法或矩陣輔助紫外雷射解析/電離飛行時間質譜(MALDI-TOFMS)對每個免疫原進行評估。綠原酸免疫原反應物和產物的吸收峰相比(200nm-400nrn)，可判斷是否偶合，並根據 反應物和產物的摩爾吸光係數計算偶聯物與半抗原的比例。
使用voyager STR生物分光度測量方法研究站雷射解析質譜與延遲萃取結合進行MALDI -TOF質譜e將每個要分析的等分試樣在0. 1%的三氟乙酸水溶液中稀釋製成lmg/ml的試樣溶 液。使用芥子酸基質和牛血清白蛋白作為外標分析等分試樣(luL)。
對於優選的載體物質，牛血清白蛋白或KLH而言，優選半抗原與蛋白質的結合比為6-15:
第二方面，免疫檢測時需要將綠原酸與標記試劑進行偶合。因此，本發明提供一種如下 結構的偶合物； O
其中R是0至6個碳的烷基，P2是可檢測的標記試劑，標記試劑選自酶、發光物質、放射性 物質或它們的混合物，更優選地標記試劑是過氧化物酶。最優選地標記試劑是辣根過氧化物 酶(HRP)。發光物質選自生物發光物質、化學發光物質或螢光物質。
偶合物的合成利用混合酸配法，但不限於此法，可以採用已知的其他偶合方法。將0. 25 毫摩爾半抗原綠原酸溶解在N,N-二甲基甲醯胺中，加入60uL正三丁胺和30uL氯甲酸丁酯， 室溫下反應l-2小時，反應液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸鹽緩衝溶液中，攪拌反應 1-4小時，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.01niol/L的PBS緩衝溶液透析3-5d，分裝保存於 -20匸的冰箱中。
另一方面，本發明涉及對於本發明第一方面的免疫原產生的抗體，這些抗體能夠至少與 一個綠原酸結構上的表位結合，優選與完整的綠原酸結構表位相結合，該抗體是多克隆的， 或是單克隆的，優選為單克隆抗體，且具有對綠原酸的特異性，並對於結構上相關的咖啡醯 基類化合物交叉的反應活性應低於10%，優選低於5%，更優選低於線，最優選低於0.5%。
免疫檢測時要將該抗體固定在支撐底物上。優選地，該方法進一步包括將所述血清抗體 固定到支撐底物上，優選固體支持物，最優選聚苯乙烯固體支持物。
本發明進一步提供一種製備抗體的方法，該方法包含通過重複給予根據本發明的綠原酸的免疫原免疫動物，優選脊稚動物，最優選哺乳動物，並收集從免疫動物得到的血清的步驟。 另一方面，本發明包括在試樣中檢測或測定綠原酸的方法，該方法包括用本發明的偶合
物或其混合物和本發明的抗體或其混合物接觸試樣；檢測或測定結合的綴合物的數量；並且
從標準曲線推斷試樣中綠原酸的存在或數量。
另一方面，本發明還描述了如何將針對這種免疫原產生的抗體用於開發可用來檢測和測
定綠原酸的存在的通用分析方法和相應的試劑盒。本該試劑盒包括用本發明的偶合物或其混
合物和本發明的抗體或其混合物。該試劑盒可以任意地包括應用所述綴合物和所述抗體在試
樣中檢測或測定綠原酸的指導。優選地，試樣是溶液，如生物流體。更優選地，試樣是血清 或尿。在本發明的方法和試劑盒中，首選各自不同的交聯劑(免疫原的和偶合物的)。
另一方面，本發明包括使用本發明的偶合物或其混合物和本發明的抗體或其混合物在試 驗試樣如生物流體中檢測或測定綠原酸。
為了產生多克隆抗血清，將免疫原與Freund佐劑混合，並且將混合物注射入宿主動物體 內，如兔、羊、鼠、天竺鼠或馬。進一步注射(加強)並取血清試樣評價抗體滴度。3 但 達到最佳滴度時，隨後將宿主動物放血得到適當體積的特異性的抗血清。要求的抗體純化水 平視計劃的應用而定。對於許多目的，根本不需要純化，但是，在其它情況下，例如抗體固 定在固體載體上，純化步驟能夠除去不想要的物質和除去非特異性的結合。本發明特異性抗 體作為試劑在免疫試驗中用於測定或檢測生物流體中的綠原酸的試劑是有用的。
單克隆抗體的製備本發明所述單克隆抗體是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組 成該群體的抗體個體都相同，除了可能存在少量可能的自發突變。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員己知的各種技術進行製備。例如，本發明完全 抗原，可被施用於動物以誘導單克隆抗體的產生。對於單克隆抗體，可利用雜交瘤技術來制 備或可用重組DNA法製備。骨髓瘤細胞可選鼠類的骨髓瘤細胞系，包括衍生自M0PC-21和 MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細胞系以及SP-2 、 NZO或X63-Ag8-653細胞，以及人骨髓瘤和小 鼠-人雜合骨髓瘤細胞系。
對雜交瘤細胞生長於其中的培養基進行分析以檢測具有所需特異性的單克隆抗體的產 生，如通過體外結合分析，例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表達抗 體的細胞的位置可用FACS進行檢測。然後，可將雜交瘤克隆通過有限稀釋步驟形成亞克隆， 並通過標準方法生長。為了達到這一目的而使用的適合的培養基包括，例如，DMEM或 RPMI-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可在動物體內作為腹水瘤生長。
由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養基、腹水或血清中，通過常規的免疫球蛋白純化工藝 適當地得到分離，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法(protein A-S印harose)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
本發明的一個優選的方案中，抗綠原酸單克隆抗體採用Balb/C小鼠腹水生產單克隆抗體 的方法製備。將約106 -107雜交瘤細胞接種到致敏的小鼠腹腔內，2-4周內可見腹部明顯脹大。 抽取腹水，經飽和硫酸按沉澱法粗提出IgG ，再將粗提的抗體經親和層析柱(Protein G-S印hrose)純化。
具體實施方式
實施例1 半抗原化合物1
金銀花葯材100g， 用95%乙醇或50%的乙醇水溶液，固液比均為1: 10，調節溶液的pH=3， 5(TC左右提取3次。合併提取液，濃縮至無醇味，4'C冰箱冷藏過夜，抽濾得上清液，將此上 清液加入聚醯胺樹脂裝於玻璃柱(400X10mra)中，至流出液變渾濁，依次用水、10%、 20%、 30%、 40%和50%乙醇水溶液(鹽酸調節pH至4. 0左右)梯度洗脫，HPLC檢測合併綠原酸含量大於60% 的洗脫液，濃縮後置於O'C冰箱中析晶，抽濾。上述晶體溶於適量水中，加於S印hadexLH-20 柱柱頂。層析條件為洗脫劑50。/。的丙酮水溶液(pH二4)、流速0.5mL/min。 HPLC檢測，合併綠 原酸洗脫液，減壓濃縮，冷凍乾燥得綠原酸純品。 實施例2
按氯化亞楓(S0Cl2)和綠原酸裝入三口燒瓶中，在磁力攪拌下，加熱回流反應lh，蒸餾除 去多餘的氯化亞楓，即得產物氯化綠原酸。按投料比Y氨基丁酸CA=1.5:1，在三口燒瓶中 投入Y氨基丁酸，冰浴下加入適量NaOH溶液，攪拌溶解，溶解在二惡垸中，加入恆壓滴液漏 鬥中，分五次滴加此溶液，隨後補加適量NaOH溶液，使反應液pH值維持在8-10，加畢，繼 續在0-4。C反應5h 。升至室溫，用濃鹽酸調節反應液pH值至4.0左右，用乙酸乙酯提取， 合併乙酸乙酯提取液，用水洗，無水硫酸鈉乾燥，濃縮得到固體物，經矽膠柱層析純化得半 抗原四垸基化綠原酸。 實施例3
按實施例2的方法，用6—氨基己酸合成六烷基化綠原酸。 實施例4
將0. 2毫摩爾的半抗原綠原酸溶解在2mlN， N-二甲基甲醯胺中，加入1. 5當量的二環己 基碳二亞胺和3當量的N-羥基琥珀醯亞胺，室溫下反應過夜，離心，取上清液O. lml加入到 20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩衝溶液中，攪拌反應1_6小時，裝入透析袋，分別用蒸餾水 和0. Olmol/L的PBS緩衝溶液透析3-5d，分裝保存於-2(TC的冰箱中。 實施例5
8將0. 25毫摩爾半抗原綠原酸溶解在2mlN， N-二甲基甲醯胺中，加入60uL正三丁胺和30uL 氯甲酸丁酯，室溫下反應1-2小時，反應液加入到10-20mg/mL的卵清蛋白碳酸鹽緩衝溶液 中，攪拌反應1-4小時，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0. 01mol/L的PBS緩衝溶液透析3-5d， 分裝保存於-2(TC的冰箱中。 實施例6
製備方法同實施例2 ，只是將KLH換成牛血清白蛋白(BSA)，製得CA-BSA全抗原120mg 。 實施例7
免疫原(CA-BSA、 CA-KLH)按常規方法各免疫了三隻兔子。從加強免疫第二次開始，在 每次免疫後第8天於兔子耳緣靜脈採血，血清經適當稀釋後用間接ELISA測定效價。待第4次 免疫時，兔子獲得了高效價的抗體，經純化製成凍乾粉後的效價分別為20000: 1。 實施例8
先將綠原酸抗原與弗氏佐劑乳化，用PBS將完全抗原CA—KLH配製成lmg/ral的溶液， 然後將完全抗原溶液與弗氏佐劑等體積混合，用高速震蕩器震蕩形成均勻乳濁液，將此乳濁 液用於動物的免疫。選擇8周齡的小鼠進行注射免疫。取8周齡的健康Balb/C小鼠12隻， 在第0天，每隻腹腔注射完全弗氏佐劑乳化抗原100uL 。第14天，再對每隻小鼠腹腔注射 不完全弗氏佐劑乳化抗原100uL 。第21天，以摘小鼠眼球法採血，用ELISA方法檢測血清 中抗體效價(滴度)。第28天，再次腹腔注射不完全弗氏佐劑乳化抗原100uL 。在細胞融合 反應前一周，用100ug/100ul抗原生理鹽水再次加強免疫。採血後經測定，所得抗血清效價 為l :64000。細胞融合操作3天後檢查細胞融合情況，8天後加HT'完全培養基，每孔加入 lral。在12天間，就可以觀察到雜交細胞的克隆。當克隆直徑長到約lmm時，用CA-BSA包 被的酶聯板來篩選出抗CA的雜交瘤細胞。篩選到的陽性克隆用有限稀釋法進行克隆化，以 CA-BSA包被的ELISA法酶標板來篩選抗CA的特異性雜交瘤細胞。經五次克隆後，得到一株 能分泌專一性抗體的抗氯胺酮單克隆細胞。 實施例9
取實施例4中經過4次免疫的小鼠，用CA-BSA包被的酶聯板測定抗血清的滴度。將包 被抗原以10ug/ml稀釋於pH 9. 6的0. 05M碳酸鹽緩衝液中，100ul /孔加入到96孔酶標板 於4。C過夜。棄去包被液後用1%明膠/ PBS在37。C下封閉2小時，然後用PBS-Tween-20洗 液洗板3遍，再加入稀釋後的CA抗血清，置於37。C孵育1小時。用PBS-Tween-20洗液洗板 3遍，加入1:2000的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG多抗，37'C孵育1小時後用 PBS-Tween-20洗液洗板3遍，加TMB/H202底物進行顯色IOmin ，並用終止液(0. 1N硫酸) 終止顯色。在450nm光波長下測定吸收值(OD)，與空白對照孔的OD均值比較，採用計量資料的t 檢驗，取P〈0.05的最低稀釋度作為此抗體的效價。經比色測定，所得綠原酸抗血清的效價為 1:6400 。 實施例10
融合效率分析用CFSE綠色螢光預標記的淋巴細胞顯綠色，用PE標記的抗小鼠B220 單克隆抗體預標記的SPZ/0細胞顯紅色，兩種細胞融合形成的雜交瘤細胞帶有雙色螢光。經 流式細胞儀測定分析雙螢光細胞比例，用於反映融合效率。如圖2所示，代表PE標記的抗 小鼠B220單克隆抗體預標記的SPZ/0 (骨髓瘤)細胞，代表CFSE綠色螢光預標記淋巴細 胞，代表帶有雙色螢光的雜交瘤細胞。本實驗體系中脾細胞和SPZ/0的最初融合效率約為 45% ， ELISA法測定陽性率為15 % 。
權利要求
1、一種如下通式的免疫原其中R是0至6個碳的烷基橋(連接半抗原與載體物質的橋)，P1是賦予抗原性的載體物質。
2、 根據權利要求l的免疫原，R = 0，即？1直接與綠原酸羰基碳原子結合。
3、 根據權利要求l的免疫原，R是C1-C6取代或未取代的、直鏈或支鏈的、飽和或不飽和的 亞烷基。
4、 根據權利要求1或3的免疫原，R是C1-C4未取代的、直鏈的、飽和的亞垸基。
5、 根據權利要求l的免疫原，其中載體物質為蛋白質、蛋白質片段、合成或天然多肽或半合 成多肽、合成或天然聚合物。
6、 根據權利要求1或5的免疫原，其中蛋白質、蛋白質片段選自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、 和脂蛋白。
7、 根據權利要求1或5的免疫原，其中蛋白質、蛋白質片段選自牛血清白蛋白、卵清蛋白、 牛丙種球蛋白、甲狀腺素結合球蛋白、鎖眼形血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin， KLH) 等。
8、 根據權利要求1或5的免疫原，其中合成或天然多肽或半合成多肽是具有足夠數量的可利 用氨基的合成聚胺基酸。
9、 根據權利要求1或5的免疫原，其中合成或天然聚合物選自碳水化合物、酵母或多糖。
10、 抗如權利要求1至9的免疫原的抗體，其中抗體能與完整的綠原酸中的至少一種結構性 抗原決定部位結合。
11、 如權利要求10的抗體，其中抗體固定在支持底物上，特別是聚苯乙烯固體支持物。
12、 製備如權利要求10或11中的抗體的方法，該方法包括將如權利要求1至9的免疫原重 復給予動物而使動物免疫，以及從免疫動物中收集所得到的血清抗體；以及利用免疫學上可 接受的細胞系與產生抗體的免疫動物單克隆細胞系融合後產生的細胞系，所製備的單克隆抗 體。
13、 如權利要求12的方法，其中該方法還包括將所述血清抗體固定在支持底物上。包括如權利要求l至3中任一項的半抗原與可檢測到的標記物共價結合的偶聯物。
14、 一種如下結構的偶合物formula see original document page 3其中R是0至6個碳的垸基，P2是可檢測的標記試劑。
15、 根據權利要求14的偶合物，標記試劑選自酶、發光物質、放射性物質或它們的混合物。
16、 根據權利要求14或16的偶合物，標記試劑是過氧化物酶。
17、 根據權利要求16的偶合物，標記試劑是辣根過氧化物酶(HRP)。
18、 根據權利要求14或15的偶合物，發光物質是生物發光物質、化學發光物質或螢光物質。
19、 用於檢測和定量樣品中綠原酸的方法，該方法包括將供試樣品和如權利要求14至18中 任一項的偶聯物或其混合物，與如權利要求10或11的抗體或其混合物接觸；檢測或定量結 合的偶聯物；以及從校準曲線中推出樣品中綠原酸的存在或含量。
20、 用於檢測和定量綠原酸的試劑盒，該試劑盒包括如權利要求14至18中任一項的偶聯物 或其混合物，以及如權利要求10或11的抗體或其混合物。
全文摘要
本發明提供包括綠原酸或其衍生物的半抗原，與賦予抗原性的載體物質結合的前述半抗原的免疫原，與標記試劑結合的前述半抗原的偶聯物(包被原)，以及抗前述免疫原的抗體，該抗體能與完整的綠原酸中的至少一種結構性抗原決定部位結合。本發明還提供用於檢測或定量樣品中綠原酸的方法和試劑盒，以及前述偶聯物和前述抗體在檢測或定量綠原酸中的用途。本發明對綠原酸具有特異性，可用於樣品中檢測綠原酸的存在和測定綠原酸的含量。
文檔編號C07K14/76GK101486762SQ200810172700
公開日2009年7月22日 申請日期2008年11月13日 優先權日2008年1月18日
發明者任會明, 屈會化, 李翼飛, 楊愛玲, 王慶國, 蔣興凱, 琰 趙 申請人:北京中醫藥大學