一種從雞蛋中同時提取甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的方法

2023-08-05 21:20:01 2

專利名稱：：一種從雞蛋中同時提取甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的方法
技術領域：
：本發明涉及獸藥殘留檢測領域，具體涉及一種雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺同時提取、淨化及濃縮的方法。
背景技術：
：在對食品殘留物進行檢測時，如果能同時對多種物質進行檢測，那麼將大大提高工作效率，但只有同時能將多種殘留物同時從樣本中提取出來，才可能建立起高效的檢測方法。氟苯尼考微溶於水，溶於有機溶劑。代謝物氟苯尼考胺極性強，易溶於水，國內外關於甲碸黴素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的提取方法有許多報導。提取劑一般為乙酸乙酯、乙腈、丙酮等。國內外對雞蛋中該三種藥物同時提取的方法未見報導。
發明內容為了解決現有技術不能同時從雞蛋中提取甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的問題，本發明提供了一種同時提取、淨化及濃縮方法，該方法簡單、方便、快速，回收率高。本發明所採用的技術方案是一種同時從雞蛋中提取甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的方法，是將雞蛋製成勻漿後，加入30%_50%乙腈溶液中混勻，再用體積比49:49:2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取。所說的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取是用乙酸乙酯_乙腈_氨水振蕩萃取，離心，將上清液移出，重複萃取3-4次，合併上清液，即得提取液。上述所說的提取液在氮吹儀上吹乾，用乙腈溶解殘渣，用經純乙腈飽和的正己烷重複脫脂兩次，然後氮吹儀上再次吹乾，用30%_35%乙腈溶液溶解殘渣，離心，過濾，得濾液，即濃縮液。採用本發明方法能將雞蛋中的甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺同時提取出來，並經淨化、濃縮步驟得到的濃縮液可以供HPLC檢測用。本發明比較了不同的提取劑對回收率的影B向，結果表明乙腈、丙酮提取效率較差，回收率較低，均小於40%，乙酸乙酯提取效率雖高，但提取的組織內源性物質較多，同時又不能有效提取氟苯尼考代謝物氟苯尼考胺，因為氟苯尼考胺只有在鹼性條件下才能溶於有機溶劑，所以本實驗採用乙酸乙酯-乙腈-氨水(49:49:2)作為提取劑，三種藥物的提取效率都很高，均達到86%以上，鹼性的乙酸乙酯-乙腈可有效提取氟苯尼考胺，且不影響其他兩種藥物的提取；乙腈可有效去除部分蛋白質，減少內源性雜質，有利於樣品淨化。篩選出雞蛋中甲碸黴素、氟苯尼考和代謝物氟苯尼考胺殘留的最佳前處理方法。該方法簡單、方便、快速，回收率高，平均回收率均在86%以上，日內和日間RSD均分別低於5.7%和9.8%，符合AOAC殘留測定要求。具體實施例方式本發明中所涉及的試劑的百分濃度，除特別說明外均指質量百分濃度。1.實驗雞的飼養、給藥和樣品採集1.l實驗雞選擇及分組選取28周齡京海黃雞175隻，體重1.75±0.20kg，隨機分成7組，每組25隻，單籠飼養。A、B、C組為甲碸黴素試驗組，D、E、F組為氟苯尼考試驗組，G組為空白對照組。給藥前分別稱重、編號。試驗前預飼1周，飼餵不含任何抗菌藥物的全價飼料，自由飲水。1.2給藥劑量、途徑及樣品採集各試驗組產蛋雞投藥劑量如表l所示。給藥前先將甲碸黴素和氟苯尼考灌注於空心膠囊中，然後分別直接投入到雞的嗉囊中。試驗組每天給藥一次，給藥時間均在上午8:00-9:00，連續5d，自給藥日起至停藥後15d內收集每天的雞蛋。表l給藥方案甲諷黴素(Thiamhenicol)氟苯尼考(Forfenicol)對照組組別A組B組C組D組E組F組G組藥量(mg/kg.b.w)10.020.050.025.050.0100.00.02(1)本發明提取、淨化與濃縮步驟①用勻槳機將雞蛋製成勻槳；②準確稱取2.0-3.0g雞蛋勻漿樣品，放於30-50mL具塞離心管中；③加入1-1.5mL30%-50%乙腈溶液置漩渦混合器上混勻；④加入4-6mL乙酸乙酯-乙腈-氨水(49:49:2，V/V)，旋渦振蕩混勻1-2min，再用超聲波振蕩萃取15min;⑤6000-8000r/min離心10-15min，上清液轉移至20_25mL玻璃管中；⑥重複提取3-4次，合併上清液；⑦在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；⑧加入1.OmL-l.5mL乙腈溶解，渦旋振蕩混勻1-2min;⑨加3.0-5.OmL飽和正己烷(用純乙腈飽和)脫脂，棄去上層正己烷，重複脫脂2次；在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；冷凍保存；上機前用1.OmL30%_35%乙腈溶解，轉移至1.5mL離心管中；⑩12000-13400r/min離心15分鐘，上清液經0.22ym濾膜過濾，濾液供HPLC測定。(2)乙腈提取、淨化與濃縮步驟①用勻槳機將雞蛋製成勻槳；②準確稱取2.0g雞蛋勻漿樣品，放於50mL具塞離心管中；4③加入lmL35%乙腈溶液置漩渦混合器上混勻；加入4mL乙腈，渦旋振蕩混勻l-2min，再用超聲波振蕩萃取15min;⑤6000-8000r/min離心10-15min，上清液轉移至25mL玻璃管中；⑥重複提取3-4次，合併上清液；⑦在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；⑧加入1.OmL乙腈溶解，旋渦振蕩混勻1-2min;⑨加3.OmL飽和正己烷(用純乙腈飽和)脫脂，棄去上層正己烷，重複脫脂2次；在35-55t:水浴中，用氮氣吹乾；冷凍保存；上機前用1.OmL35%乙腈溶解，轉移至1.5mL離心管中；12000-13400r/min離心15分鐘，上清液經0.22ym濾膜過濾，濾液供HPLC測定。(3)丙酮提取、淨化與濃縮步驟①用勻槳機將雞蛋製成勻槳；②用勻槳機將雞蛋製成勻槳；③準確稱取2.0g雞蛋勻漿樣品，放於50mL具塞離心管中；加入2mLpH7.0的磷酸鹽緩衝液，旋渦振蕩混勻1-2min;⑤加入4mL丙酮旋渦振蕩混勻1-2min，再用超聲波振蕩萃取15min;⑥6000-8000r/min離心5min;⑦將溶液轉移到另一支15mL離心管中；⑧再向溶液中加入3mL二氯甲烷，旋渦振蕩混勻lmin，再用超聲波振蕩萃取15minj⑨6000-8000r/min離心5min;⑩棄去上層水相，置45t:氮吹儀上吹乾；(11)用lmL35%乙腈溶解殘渣，渦旋振蕩混勻lmin;(12)加入3mL正己烷(用純丙酮飽和)渦旋振蕩混勻lmin，脫脂，棄去上層正己烷，重複脫脂2次；(13)水相轉移至1.5mL離心管，上清液經0.22ym濾膜過濾，濾液供HPLC測定。3回收率的測定3.Og勻漿後的空白雞蛋勻漿液，置50mL聚丙烯離心管中，添加不同濃度的標準工作液，使得空白空白蛋液中甲碸黴素添加量分別為0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg;氟苯尼考添加量分別為0.015mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg;氟苯尼考胺添加量分別為0.005mg/kg、0.05mg/kg、0.50mg/kg。每個添加量設6個平行，經上述樣品的提取、淨化和濃縮後，進樣80iiL作HPLC檢領U。HPLC檢測條件色譜柱為C18，5iim，250mmX4.6mm;流動相為乙腈NaH2P04溶液(0.01mol/L，含0.005mol/L十二烷基硫酸鈉和0.10%三乙胺)=3035:7065(V/V)，用85%H3P04調pH至4.5-4.8;螢光檢測器，激發波長225nm，發射波長285nm;流速1.01.2mL/min;柱溫2530°C。根據峰面積計算添加回收率。本發明方法提取樣品的結果見表2。乙腈、丙酮提取樣品的結果見表3、表4。表2雞蛋中甲碸黴素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及變異係數(n=6)5tableseeoriginaldocumentpage6表4雞蛋中甲碸黴素(TAP)、氟苯尼考(FF)和氟苯尼考(FFA)的添加回收率及變異係數(n=6)tableseeoriginaldocumentpage64精密度的測定將檢測回收率剩餘的樣品按藥物濃度高低分別混合成3份，得到高、中、低三種藥物濃度的樣品，在同日內6次重複測定高、中、低三種藥物濃度的樣品，求得日內(批內)精密度。在一周內不同日6次重複測定高、中、低三種藥物濃度的樣品，密度。其結果見表2。權利要求一種同時從雞蛋中提取甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的方法，其特徵在於，將雞蛋製成勻漿後，加入30％-50％乙腈溶液中混勻，再用體積比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所說的用乙酸乙酯-乙腈-氨水提取是用乙酸乙酯_乙腈_氨水振蕩萃取，離心，將上清液移出，重複萃取3-4次，合併上清液，即得提取液。3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，提取液在氮吹儀上吹乾，用乙腈溶解殘渣，再用經純乙腈飽和的正己烷重複去脂，然後氮吹儀上再次吹乾，用30%_35%乙腈溶液溶解殘渣，離心，過濾，得濾液，即濃縮液。全文摘要本發明涉及一種從雞蛋中同時提取甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺的方法。該方法具體是將雞蛋製成勻漿後，加入30％-50％乙腈溶液中混勻，再用體積比49∶49∶2的乙酸乙酯-乙腈-氨水提取，提取液再經飽和正己烷脫脂，最後用氮吹儀吹乾。採用本發明方法能將雞蛋中的甲碸黴素、氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺同時提取出來，簡單、方便、快速，回收率高。文檔編號C07C317/32GK101747246SQ20091026444公開日2010年6月23日申請日期2009年12月22日優先權日2009年12月22日發明者姚宜林,徐東,李洋靜,裴燕,謝愷舟,謝星,陳書琴申請人:揚州大學