溶血劑及應用的製作方法

2023-08-05 20:16:26 2

本發明涉及體外診斷試劑技術領域，具體涉及溶血劑及其應用。

背景技術：

體外診斷試劑是指可單獨使用或與儀器、器具、設備或系統組合使用,在疾病的預防、診斷、治療監測、預後觀察、健康狀態評價以及遺傳性疾病的預測過程中,用於對人體樣本(各種體液、細胞、組織樣本等)進行體外檢測的試劑、試劑盒、校準品(物)、質控品(物)等。隨著臨床體外診斷技術的研究和發展，體外診斷使用最多最重要的人體樣本類型當屬門診全血。全血成分相當豐富，除血常規檢測細胞等有形成分外，還含血清和血漿中的其他所有化學成分，為避免紅細胞、白細胞等對檢測的影響，在進行全血中的化學成分測試前，需要將全血進行快速有效溶解，因此溶血劑的效率和作用將對後續樣本的檢測起到非常關鍵的作用。

C-反應蛋白(CRP)是相對分子質量為115～140KD的血清β球蛋白，因最早發現其和肺炎球菌的C多糖相結合而得名(1930年)，是由5個相同的亞單位以非共價鍵結合而成的環狀五球體。CRP半壽期約15h，正常人CRP的濃度很低(0.068～8.2mg/L)，但在組織損傷、急性感染發生後6～8h開始升高,24～48h達峰值，可達正常值的幾百倍甚至上千倍，升高幅度與感染程度成正比，炎症治癒後濃度迅速下降，7～12天可恢復正常水平。CRP持續增高提示機體存在慢性炎症或自身免疫疾病，CRP在病毒感染時不會升高，其變化不受病人的個體差異、機體狀態和治療藥物的影響。近年來研究證明，CRP具有與IgG和補體相似的調理和凝集作用，促進巨噬細胞的吞噬，刺激單核細胞表面的組織因子表達及其它免疫調節功能。CRP在炎症或組織損傷時皆可升高，但CRP與其他蛋白升高(2～3倍)不同，可升高100～1000倍，儘管為非特異性的，但對於細菌感染、各種炎症過程及組織壞死與損傷及其恢復期的篩檢、監測、病情評估與療效判斷，都有重要的價值。

以往CRP的檢測主要基於生化分析儀或特定蛋白儀上針對血清進行檢測，隨著研究的進展和發現CRP在細菌和病毒感染表現差異的重要臨床價值，以靜脈全血或者末梢血作為樣本進行CRP的檢測就顯得異常迫切和重要。

然而，目前還沒有能夠同時滿足對血清、血漿和全血(靜脈和末梢)的C-反應蛋白檢測且不影響後續免疫比濁反應的速度的溶血劑。

技術實現要素：

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在於提出一種能夠同時滿足對血清、血漿和全血(靜脈和末梢)的C-反應蛋白檢測且不影響後續免疫比濁反應的速度的溶血劑。

需要說明的是，本發明是基於發明人的下列發現而完成的：

發明人研究發現，CRP(體C-反應蛋白)是人體在感染發生後的極性相反應蛋白，早期臨床上幾乎均是針對人體血清樣本進行測試，最近幾年由於研發發現CRP對病毒感染和對細菌感染的升高水平差異性表現而發展為與血常規測試配合針對全血樣本進行測試。但由於血清是採用自然凝固或加入促凝劑或分離膠並經離心除去纖維蛋白及血液有形成分的均一性樣本，與含有紅細胞、白細胞、血小板等有形成分的未經任何處理的全血有很大的差異。全血樣本和血清樣本的測定過程本質都是人體C-反應蛋白與對應的CRP抗體發生免疫結合從而產生沉澱的反應，兩者的差異在於是否存在溶血的過程。而全血C-反應蛋白的檢測，由於全血成分複雜，需溶血過程，影響因素較多。

血清樣本均一、幹擾成分少，無需溶血過程，目前針對血清的CRP檢測試劑盒中，試劑1成分簡單，主要是一些緩衝鹽溶液，起到穩定反應體系的作用即可，加入試劑2乳膠抗體即可產生反應。通常稱為一步法完成測試。

對於全血樣本，溶血本身是一個很簡單的過程，關鍵在於如需要快速溶血，比如10s以內，則需要加入足夠濃度的能快速破壞血液細胞並溶解細胞壁上的脂類等成分的表面活性劑，表面活性劑強度不足(親水親油平衡值低)則溶血慢或者不充分，表面活性劑過強，則會通過破壞後續加入的CRP乳膠抗體(其本質是膠體溶液)的水化層從而破壞反應體系的穩定性(表現為加入試劑2乳膠抗體後吸光值下降從而反應信號為負，或者為加入試劑2乳膠抗體後測試水空白時吸光值異常升高，產生強烈的本地反應導致正常樣本反應信號低於水空白)，影響反應的特異性和反應速度。由於全血樣本溶血劑對後續反應的幹擾問題，當前市面上的全血CRP檢測試劑幾乎均為兩步法，即第一步先加稀釋液(溶血劑)對全血樣本進行溶血，然後時第二步再取溶血後的樣本進行反應，這樣由於稀釋過程和反應過程分開，加入的稀釋液樣本體積遠小於一步法中需加入的試劑1體積，所以對後續免疫比濁反應影響小；如測試血清樣本則不需要第一步樣本稀釋(溶血)過程。部分廠家直接註冊兩種試劑盒，一種只適用於血清樣本，一種只適用於全血樣本。因而，目前市場在用尤其是國產的C-反應蛋白(CRP)檢測試劑盒，基本是血清/血漿檢測和全血檢測試劑分開，即採用不同試劑，這樣無論是對於企業還是臨床檢測實驗室，既不方便也增加了成本負擔。

但是，同一種試劑要同時滿足對血清、血漿和全血(靜脈和末梢)的檢測且不影響後續免疫比濁反應的速度，具有一定難度。因而，發明人繼續進行了一系列的實驗探索和研究，以期尋找出一種能夠對全血進行快速有效溶解，並能夠同時滿足對血清、血漿和全血(靜脈和末梢)的C-反應蛋白檢測且不影響後續免疫比濁反應的速度的溶血劑。從而，最終得到了本發明的溶血劑。本發明的溶血劑，含有多種表面活性劑及緩衝成分，可以在很短的時間內完成溶血(對靜脈全血和末梢血)過程，並直接加入試劑2(乳膠CRP抗體)進行反應，無需樣本稀釋(溶血)過程，免疫比濁反應進程不受影響；溶血劑對血清、血漿無影響，即血清和血漿可以同全血一樣與乳膠CRP抗體順利產生免疫比濁反應，從而能夠實現針對血清、血漿、全血均一步法完成測試過程。

因而，在本發明的一個方面，本發明提供了一種溶血劑。根據本發明的實施例，該溶血劑包含：表面活性劑；聚乙二醇；乙二胺四乙酸鈉鹽；以及水。如前所述，目前市售的C-反應蛋白(CRP)檢測試劑盒分為適用於血清和全血兩種，通用性較差，而本發明的溶血劑能夠同時滿足對血清、血漿和全血(靜脈和末梢)的C-反應蛋白檢測且不影響後續免疫比濁反應的速度。從而，將本發明的溶血劑用於C-反應蛋白(CRP)檢測，能夠有效解決同一種試劑適用於與多種臨床樣本的兼容性問題，可分別臨床使用需求，並減少成本。並且，根據本發明的實施例，本發明的溶血劑能夠對全血進行快速有效溶解。

根據本發明的實施例，所述溶血劑的pH值為6.0～8.0。

根據本發明的實施例，所述表面活性劑為選自十二烷基硫酸鈉、十四烷基三甲基氯化銨和甜菜鹼的至少一種。

根據本發明的實施例，當所述表面活性劑為選自十二烷基硫酸鈉和十四烷基三甲基氯化銨的至少一種時，在所述溶血劑中，所述表面活性劑的質量-體積濃度為0.1‰～1‰；當所述表面活性劑為甜菜鹼時，在所述溶血劑中，所述表面活性劑的質量-體積濃度為0.01％～0.1％。

根據本發明的實施例，所述聚乙二醇的分子量範圍為8000-20000。

根據本發明的實施例，在所述溶血劑中，所述聚乙二醇的質量-體積濃度為0.4％～1％。

根據本發明的實施例，在所述溶血劑中，所述乙二胺四乙酸鈉鹽的質量-體積濃度為1‰～5‰。

其中，在本文中所述的「質量-體積濃度」＝溶質的質量數(克)/溶液的體積(升)，即1‰＝1克/升。

發明人驚奇地發現，在本發明的溶血劑中，表面活性劑，特別是十二烷基硫酸鈉、十四烷基三甲基氯化銨或者甜菜鹼；聚乙二醇，特別是分子量8000-20000的聚乙二醇；這幾個組分的配伍，可以高效快速溶血並保證後續免疫比濁反應的順利快速進行。含有質量-體積濃度為0.1‰～1‰的十二烷基硫酸鈉或者十四烷基三甲基氯化銨、質量-體積濃度為0.4％～1％的聚乙二醇8000-2000、質量-體積濃度為1‰～5‰的二胺四乙酸鈉、且pH為6.0-8.0的C-反應蛋白(CRP)檢測用溶血劑性能完全滿足商品化的要求，尤其是能夠同時滿足對血清、血漿和全血(靜脈和末梢)的C-反應蛋白檢測且不影響後續免疫比濁反應的速度。

在本發明的另一方面，本發明提供了前面所述的溶血劑在檢測血液樣本的C-反應蛋白中的用途。根據本發明的實施例，將本發明溶血劑與全血樣本混合孵育，然後加入C-反應蛋白(CRP)抗體膠乳試劑混合後孵育，然後按照常規方法，檢測加入膠乳試劑前後混合物在700nm波長下的吸光值的差值，基於該差值與CRP的濃度成正比，通過與對應的標準曲線比較即可得到樣本的C-反應蛋白檢測結果。

根據本發明的實施例，所述血液樣本為靜脈血或末梢血。

根據本發明的一些具體示例，所述血液樣本為選自血清、血漿和全血的至少一種，優選全血。

在本發明的又一方面，本發明還提供了一種檢測血液樣本的C-反應蛋白的方法。根據本發明的實施例，該方法為利用前面所述的溶血劑檢測所述血液樣本的C-反應蛋白。如前所述，該方法通過將本發明溶血劑與血液樣本混合孵育，然後加入C-反應蛋白(CRP)抗體膠乳試劑混合後孵育，然後按照常規方法，檢測加入膠乳試劑前後混合物在700nm波長下的吸光值的差值，進而，基於該差值與CRP的濃度成正比，通過與對應的標準曲線比較即可得到樣本的C-反應蛋白檢測結果。

根據本發明的實施例，所述方法包括以下步驟：將所述溶血劑與所述血液樣本混合併進行第一孵育，以便獲得第一孵育混合物；獲得所述第一孵育混合物700nm波長下的吸光值A1；將所述第一孵育混合物與C-反應蛋白抗體膠乳試劑混合併進行第二孵育，以便獲得第二孵育混合物；獲得所述第二孵育混合物700nm波長下的吸光值A2；以及基於A1和A2確定所述血液樣本中C-反應蛋白的濃度。由此，能夠快速有效地得到樣本的C-反應蛋白檢測結果，且成本低，而結果準確可靠，重複性好。

根據本發明的實施例，所述血液樣本為靜脈血或末梢血。

根據本發明的一些實施例，所述血液樣本為選自血清、血漿和全血的至少一種，優選全血。

根據本發明的實施例，按照150:1～25:1的體積比，將所述溶血劑與所述血液樣本混合。由此，溶血效率高、效果好。

根據本發明的實施例，於37℃下進行所述第一孵育1分鐘。由此，溶血效率高、效果好。

根據本發明的實施例，所述C-反應蛋白抗體膠乳試劑的體積與所述溶血劑相同。

根據本發明的實施例，於37℃下進行所述第二孵育2分鐘。

根據本發明的實施例，基於A1和A2確定所述血液樣本中C-反應蛋白的濃度，包括：

基於A1和A2，確定ΔA，其中ΔA＝A2-A1；以及

基於預定標準曲線和ΔA，確定所述血液樣本中C-反應蛋白的濃度，其中所述預定標準曲線為所述C-反應蛋白抗體膠乳試劑對C-反應蛋白校準品的正比曲線。

其中，ΔA即為所述第一孵育混合物700nm波長下的吸光值A1和所述第二混合物700nm波長下的吸光值A2的差值，即ΔA＝A2-A1。所述預定標準曲線是利用本發明的溶血劑配合測定時採用的CRP膠乳抗體試劑對C-反應蛋白(CRP)校準品而建立的。ΔA與CRP的濃度成正比。

此外，還需要說明的是，根據本發明的實施例，與現有技術相比，本發明具有下列優點的至少之一：

1)對靜脈全血和末梢血的溶血效率高，10秒內可完全溶解；

2)不影后續免疫比濁反應進程，反應信號高，靈敏度好，檢測CRP可低至0.1mg/L；

3)同時適用於血清、各種抗凝血漿，一種試劑可應用於多種設備和臨床科室；

4)測試方法簡單快捷，綜合比較，使用本發明方法的溶血劑進行C-反應蛋白檢測的較市面普遍使用的CRP檢測試劑具有明顯優勢。

本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

附圖說明

本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1為根據本發明實施例的溶血劑對靜脈全血的溶血示意圖；

圖2為根據本發明實施例的溶血劑對末梢血的溶血示意圖；

圖3為根據本發明實施例的檢測血液樣本的C-反應蛋白的方法的流程示意圖；

圖4為根據本發明的實施例，使用本發明的溶血劑配合CRP膠乳抗體試劑對C-反應蛋白(CRP)校準品建立的校準曲線示意圖；以及

圖5為根據本發明的實施例，本發明全血C-反應蛋白(CRP)測定方法與已上市試劑(對照)的方法學對比一致性示意圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。實施例中未註明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。

實施例1

按照以下流程配製溶血劑：

1、表面活性劑母液配製：稱取十二烷基硫酸鈉(SDS)0.34g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解，用1mol/L鹽酸調pH為7.25。

2、聚乙二醇母液配製：稱取聚乙二醇8000(PEG8000)11.3g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解。

3、乙二胺四乙酸(EDTA)鈉鹽緩衝液配製：稱取乙二胺四乙酸二鈉聚0.34g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解，用1mol/L鹽酸調pH為7.25。

4、將表面活性劑母液、聚乙二醇母液、乙二胺四乙酸鈉緩衝液按1:3:30進行充分混合，得到本發明的全血C-反應蛋白(CRP)檢測用溶血劑。

實施例2

按照以下流程配製溶血劑：

1、表面活性劑母液配製：稱取十四烷基三甲基氯化銨(TTAC)1.0g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解，用1mol/L鹽酸調pH為6.80。

2、聚乙二醇母液配製：稱取聚乙二醇20000(PEG20000)4.5g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解。

3、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)鹽緩衝液配製：稱取乙二胺四乙酸二鈉聚0.56g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解，用1mol/L鹽酸調pH為6.80。

4、將表面活性劑母液、聚乙二醇母液、乙二胺四乙酸鈉緩衝液按1:3:30進行充分混合，得到本發明的全血C-反應蛋白(CRP)檢測用溶血劑。

實施例3

按照以下流程配製溶血劑：

1、表面活性劑母液配製：稱取甜菜鹼3.4g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解，用1mol/L鹽酸調pH為6.0。

2、聚乙二醇母液配製：稱取聚乙二醇10000(PEG10000)10.0g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解。

3、乙二胺四乙酸鈉(EDTA)鹽緩衝液配製：稱取乙二胺四乙酸二鈉聚0.11g，加入100ml純化水，攪拌使其充分溶解，用1mol/L鹽酸調pH為6.0。

4、將表面活性劑母液、聚乙二醇母液、乙二胺四乙酸鈉緩衝液按1:3:30進行充分混合，得到本發明的全血C-反應蛋白(CRP)檢測用溶血劑。

實施例4溶血劑的溶血效果檢測

隨機抽取7份新鮮血常規檢測用靜脈全血和3份新鮮末梢全血作為樣本，分別利用實施例1-3配製獲得的本發明的溶血劑，按溶血劑與血液樣本體積比50:1的比例混合，上機檢測700nm波長下的吸光值變化(檢測採用錦瑞PA50特定蛋白儀進行)，靜脈全血和末梢全血的反應信號變化過程示意如圖1和圖2。

如圖1-2所示，針對靜脈全血和末梢全血，溶血劑均能在約10秒時間內(圖中一個讀點為12秒)有效完全溶解並達到平衡，後續免疫比濁反應未受到影響。

實施例5C-反應蛋白(CRP)的測定

利用實施例1-3配製獲得的本發明的溶血劑，參照圖3所示的方法，分別測定待測血液樣本中的C-反應蛋白，具體步驟如下：

1、校準曲線建立

利用本發明的溶血劑配合某品牌CRP膠乳抗體試劑對該公司可溯源至國際參考物CRM470的CRP校準品進行定標(溶血劑：樣本：膠乳抗體試劑的體積比＝50:1:50)，所得標準曲線如圖4。該標準曲線即為所述C-反應蛋白抗體膠乳試劑對C-反應蛋白校準品的正比曲線。

圖4中校準曲線光滑，各點反應信號區分明顯，校準曲線建立成功。

2、血C-反應蛋白(CRP)檢測用溶血劑準確性檢測：

選取不同濃度分布的20份新鮮血清和20份新鮮全血與已經上市的分別檢測血清和全血的試劑盒進行方法學對比測試。

其中，血清CRP測試試劑盒(對比試劑1)：R1為緩衝液，R2為CRP乳膠抗體，廠家為日本Denka Seiken，R1貨號600967；全血CRP測試試劑盒(對比試劑2)：廠家為深圳邁瑞，包括溶血劑和CRP乳膠試劑兩個獨立的試劑盒，溶血劑貨號為105-004856-00，CRP乳膠試劑盒貨號為105-0048860-00。

對照(對比試劑1和對比試劑2)採用其試劑盒對應的流程進行操作。

針對實施例1-3配製獲得的本發明的溶血劑，如前所述，測定流程參照圖2所示，具體如下：

將溶血劑與血液樣本混合，並於37℃下進行第一孵育1分鐘，以便獲得第一孵育混合物；

獲得所述第一孵育混合物700nm波長下的吸光值A1；

將所述第一孵育混合物與C-反應蛋白抗體膠乳試劑混合，並於37℃下進行第二孵育2分鐘，以便獲得第二孵育混合物；

獲得所述第二孵育混合物700nm波長下的吸光值A2；

基於A1和A2，確定ΔA，其中ΔA＝A2-A1；以及

基於前述確定的標準曲線和ΔA，確定所述血液樣本中C-反應蛋白的濃度(ΔA與CRP的濃度成正比)。

其中，溶血劑：樣本：膠乳抗體試劑的體積比＝50:1:50。

以實施例1的溶血劑的結果為例，40份樣本的結果如表1，結果一致性示意圖如圖5所示。

表1C-反應蛋白(CRP)檢測結果

由表1和圖5的結果可知，本發明中實例1和實例2所述的溶血劑對血清和全血樣本的反應及作用與對比試劑表現一致性非常好。

實施例6

參照實施例1的方法流程，按下表2的成分組成分別配製系列溶血劑。

表2溶血劑成分組合及上機比例

即得本發明的溶血劑：試劑1-4。

然後，參照實施例5的CRP測定方法，分別對試劑1-4(對照如表2所示)進行定標和測試10組同一病人來源的全血樣本，測試結果如表3。

表3

由表3可知，本發明的溶血劑的各組分組合，測試全血C-反應蛋白結果差異不大，除0.5以下的低值外，其他差異均在10％以內，說明本發明的各組合的溶血劑均可達到相同的溶血效果。

在本說明書的描述中，參考術語「一個實施例」、「一些實施例」、「示例」、「具體示例」、或「一些示例」等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特徵、結構、材料或者特點包含於本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特徵、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。

儘管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由權利要求及其等同物限定。