細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序的製作方法
2023-08-06 00:17:11
細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種細胞計數方法，在細胞培養中，即使在細胞密集而形成立體的細胞團時，也能夠不打散該細胞團而準確地計數培養細胞數。該方法如下：取得培養細胞的圖像，並由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，分別依據細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，計算細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數。
【專利說明】細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序
【技術領域】
[0001]本發明涉及計數細胞的方法，特別涉及用於在培養浮遊細胞時，不損害增殖效率而準確地計數培養中的細胞數的細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序。
【背景技術】
[0002]近年，在藥品生產、基因治療、再生醫療、免疫療法等領域中，要求在人工環境下高效地大量培養細胞、組織、微生物等。
[0003]當這樣大量培養細胞時，有必要在培養浮遊細胞時計數培養中的細胞數，掌握細胞數隨時間的變化、增殖效率的變化。但是，對於準確地計數培養中的細胞數，一直以來存在各種各樣的問題。
[0004]即，在浮遊細胞的增殖中，存在細胞立體地集合而形成的細胞團和獨自分離的單獨細胞。
[0005]一直以來，進行如下的方法:從上方或下方拍攝這些培養細胞，依據所得圖像中的培養細胞的投影面積，通過用細胞團的投影面積除以每一個的平均細胞面積，從而計數細胞數。
[0006]但是，由於細胞團是立體的，因此按照這樣得到的細胞數被計數為少於細胞團的實際細胞數。另外，在單獨細胞呈平面密集連接時，通過用單獨細胞的投影面積除以每一個的平均細胞面積而得到的細胞數被計數為多於單獨細胞的實際細胞數。因此存在如下問題，依據培養細胞的投影面積計數的細胞數不是準確的值。
[0007]另一方面，為了得到準確的細胞數，也考慮將細胞團完全打散並計數。
[0008]但是，通常存在細胞團的過於打散而招致細胞的擴增效率降低這一進一步的問題。因此，一直以來在培養過程中不能進行準確的計數，僅在細胞回收時能夠進行準確的計數。
[0009]在此，作為計數培養細胞的細胞數的現有方法，可以列舉例如專利文獻I中記載的細胞數計量方法。在該方法中，取得存在於培養容器內的培養細胞的觀察圖像，在取得的觀察圖像內計算培養細胞所佔有的面積比率作為佔有面積率，根據計算的佔有面積率和規定的關係式計算存在於培養容器內的培養細胞的細胞數。
[0010]現有技術文獻
[0011]專利文獻
[0012]專利文獻1:日本特開2007 - 124913號公報
【發明內容】
[0013]發明所要解決的課題
[0014]但是，由於該方法是根據佔有面積率計算細胞數的方法，因此如上所述，不能夠進行準確的計數。另一方面，為了進行準確的計數，若將細胞團打散，則招致增殖效率的降低。
[0015]本發明是鑑於上述情況而完成的，目的在於提供即使存在細胞團也能夠不將其打散而準確地計數細胞數的細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序，該方法如下:取得培養中的培養細胞的圖像，並由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，對細胞團的圖像和單獨細胞的圖像分別進行圖像處理，分別計算細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數。
[0016]用於解決課題的方法
[0017]為了達成上述目的，本發明的細胞計數方法是計數培養細胞的方法，其中，取得培養中的培養細胞的圖像，由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，分別依據細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，計算細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數。
[0018]另外，本發明的細胞計數裝置是用於計數培養細胞的細胞計數裝置，其具備:取得培養中的培養細胞的圖像的單元、由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像的單元、和分別依據細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，計算細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數的單元。
[0019]另外，本發明的細胞計數程序是用於計數培養細胞的細胞計數程序，其使計算機執行以下內容:輸入培養中的培養細胞的圖像，由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，分別依據細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，計算細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數。
[0020]發明效果
[0021]根據本發明， 能夠不損害增殖效率而準確地計數培養中的細胞數。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是表示從培養容器的底面方向拍攝在培養容器中培養中的浮遊細胞而得到的圖像的圖。
[0023]圖2是表示從培養容器的底面方向拍攝在培養容器中培養中的浮遊細胞而得到的圖像中的細胞的投影面積的圖。
[0024]圖3是使用從培養容器的底面方向拍攝在培養容器中培養中的浮遊細胞而得到的圖像，將單獨細胞和細胞團進行分離，表示細胞團的投影面積的圖。
[0025]圖4是使用從培養容器的底面方向拍攝在培養容器中培養中的浮遊細胞而得到的圖像，將單獨細胞和細胞團進行分離，表示單獨細胞的投影面積的圖。
[0026]圖5是表示培養中的浮遊細胞中的單獨細胞的直徑變化的圖。
[0027]圖6是表示培養中的浮遊細胞中的細胞團的體積的校正係數的圖。
[0028]圖7是表示本發明的細胞計數裝置的構成的模塊圖。
[0029]圖8是表示通過本發明的細胞計數裝置執行的細胞計數程序的處理順序的流程圖。
[0030]圖9是表示對基於本發明的細胞計數方法和現有的細胞計數方法的在培養容器中培養中的浮遊細胞的計數結果進行比較的圖。
【具體實施方式】
[0031]下面對於本發明的細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序的優選實施方式，參照附圖進行說明。
[0032][細胞計數方法]
[0033]首先，對於本實施方式的細胞計數方法，參照圖1~圖6進行說明。
[0034]本實施方式的細胞計數方法是計數培養容器中的培養細胞數的方法，只要是如下的方法即可:取得培養容器中的規定的區域的圖像，由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，對細胞團的圖像和單獨細胞的圖像分別進行圖像處理，分別計算細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數。並不限定於實施方式和實施例的具體構成，可以成為具備例如以下的工序的方法。
[0035](A)培養細胞的圖像的取得
[0036]首先，拍攝培養容器中的規定的區域，取得圖像。具體例如從透明的培養容器的上方照射光，從下方經由顯微鏡利用相機自動地拍攝培養細胞，從而能夠取得培養容器中的規定的區域的圖像。下面有時將該圖像稱為「觀察圖像」。圖1表示按照這樣得到的拍攝培養容器中的浮遊細胞而得到的觀察圖像。在該圖中示出了細胞團1、單獨細胞2存在於培養液3中的樣態。
[0037]需要說明的是，可以僅拍攝培養容器中的規定的區域，將該區域中的細胞數計數後，依據該區域相對於培養容器整體的比例計算培養容器整體的培養細胞數。
[0038]在此，以往，使用該觀察圖像製成如圖2中所示的細胞的投影面積圖像，用細胞的投影面積11除以每一個細胞的平均面積來計算細胞數。但是，對於用這樣的方法得到的細胞數而言，由於細胞團I是立體的，因此與細胞團I對應的部分變得少於實際的細胞數。另外，關於與單獨細胞2對應的部分，單獨細胞2平面地連接的部分也包含於細胞投影面積11中，其結果是被計數為多於實際的細胞數。因此，在這樣的現有方法中不能夠準確地計數培養細胞數。
[0039](B)細胞團與單獨細胞的圖像分離
[0040]接著，將觀察圖像中的細胞團I和單獨細胞2的圖像進行分離，分別製成細胞團的圖像和單獨細胞的圖像。
[0041]具體地，首先如圖3所示，製成僅表示細胞團I的細胞投影面積21的細胞團的圖像。然後，使用該細胞團的圖像，計量細胞團I的細胞投影面積21。
[0042]另外，如圖4所示，從觀察圖像刪去細胞團1，製成單獨細胞的圖像。然後，使用該單獨細胞的圖像，以能夠將單獨細胞2分別計數的方式將單獨細胞2以圓形近似從而進行將它們分別區分的圓形近似處理。由此，在單獨細胞的圖像中示出進行了圓形近似的單獨細胞22。然後，使用該單獨細胞的圖像計量單獨細胞2的個數，並且計量單獨細胞2的平均面積。
[0043]在此，如圖5所示，有時培養中的培養細胞的大小根據培養時間而變化。在該圖中表示了將人的淋巴球細胞增殖時的細胞直徑的變化。
[0044]如該圖所示，在培養的初期，培養細胞的直徑逐漸增加，但在經過一定時間後反而能夠看到直徑變小的傾向。因此，由於單獨細胞的平均面積根據觀察時間而變化，如上所述，優選在計數培養細胞之時，計量單獨細胞的平均面積。
[0045]另一方面，例如某種腫瘤細胞，根據培養細胞的種類，也有在培養中的大小几乎不變化的細胞。在這樣的培養細胞的情況下，沒有必要在計數培養細胞之時計量單獨細胞的平均面積。即，單獨細胞的平均面積用於後述的細胞團的細胞數的計算，這樣的培養細胞的情況下，也優選代替計量平均面積而預先設定單獨細胞的體積，將其使用於培養細胞的計數。
[0046](C)細胞團的體積的計算
[0047]接著，使用依據細胞團的圖像得到的細胞投影面積21，以球形計算細胞團I的體積。並且，使用校正係數修正按照這樣計算的細胞團I的球形的體積。具體地，用該球形的體積除以校正係數，能夠得到更接近實際值的細胞團I的體積。
[0048]在圖6中示出了表示細胞團的投影面積與校正係數的關係的圖。在該圖中繪製了細胞團的投影面積與實際測定的細胞團的體積的關係，依據於此，將細胞團的投影面積與校正係數的關係表示於式中。即，在本實施方式中，確定校正係數的式子如下。
[0049][校正係數]=1.1003 X [細胞團的投影面積(XlO-5Cm2)] — 0.1885
[0050]其中，細胞團的投影面積不足1.0802X 10_5cm2時，校正係數為I。
[0051]將細胞團的體積按照這樣進行修正的原因如下:在細胞團小時以幾乎球形的狀態存在，而隨著細胞團變大，細胞團沿縱向坍塌，縱斷面成為橢圓形的形狀。即，由於隨著細胞投影面積變大，細胞團進一步呈沿縱向坍塌的形狀，因此將其通過校正係數進行修正。需要說明的是，校正係數有時根據細胞的種類、培養條件而不同，因此希望根據這些而預先確定。
[0052](D)細胞團的細胞數的計算
[0053]接著，用修正而得到的細胞團I的體積除以單獨細胞2的體積，計算細胞團I的細胞數。單獨細胞2的體積可以依據單獨細胞2的平均面積計算。
[0054](E)培養細胞的細胞數的計算
[0055]如上，能夠得到單獨細胞2的細胞數和細胞團I的細胞數，將它們相加，可以計算觀察圖像的區域中的細胞數。並且，通過用得到的細胞數乘以培養液的體積相對於觀察圖像的區域的比率，能夠計算培養細胞的細胞數。
[0056][細胞計數裝置和細胞計數程序]
[0057]接著，對於本實施方式的細胞計數裝置和細胞計數程序，參照圖7~圖8進行說明。圖7是表示本發明的一個實施方式的細胞計數裝置的構成的模塊圖，圖8是表示通過該細胞計數裝置執行的細胞計數程序的處理順序的流程圖。
[0058]首先，如圖7所示，本實施方式的細胞計數裝置100具備圖像輸入單元101、圖像記憶單元102、圖像分離單元103、單獨細胞計量單元104、細胞團體積計算單元105、細胞團細胞數計算單元106和細胞數輸出單元107。該細胞計數裝置100可以使用智慧型手機、平板電腦、個人電腦、工作站、伺服器等各種計算機來構成，上述各構成可以由計算機的CPU和內存等構成。另外，也可以作為具備各構成的專用的計數裝置來構成。
[0059]圖像輸入單元101輸入用相機自動拍攝培養中的培養細胞而得到的圖像(觀察圖像)，記憶於圖像記憶單元102。
[0060]圖像分離單元103對觀察圖像中的細胞團和單獨細胞進行分離，製成細胞團圖像和單獨細胞圖像，分別記憶於圖像記憶單元102。
[0061]單獨細胞計量單元104使用單獨細胞圖像進行單獨細胞的圓形近似，並計量單獨細胞數。另外，單獨細胞計量單元104還計量單獨細胞的平均面積。
[0062]細胞團體積計算單元105使用細胞團圖像,計量細胞團的投影面積。另外,細胞團體積計算單元105依據細胞團的投影面積以球形計算細胞團的體積。還有，細胞團體積計算單元105對計算的球形的體積使用校正係數，計算修正後的細胞團的體積。
[0063]細胞團細胞數計算單元106用通過細胞團細胞數計算單元105計算的細胞團的體積除以單獨細胞的體積，計算細胞團的細胞數。此時，細胞團細胞數計算單元106依據通過單獨細胞計量單元104計量的單獨細胞的平均面積計算單獨細胞的體積。
[0064]細胞數輸出單元107計算單獨細胞的細胞數與細胞團的細胞數之和作為觀察圖像上的區域中的細胞數，所述單獨細胞的細胞數通過單獨細胞計量單元104計數,所述細胞團的細胞數通過細胞團細胞數計算單元106計算。另外,細胞數輸出單元107通過對該觀察圖像上的區域中的細胞數乘以培養液的體積相對於觀察圖像上的區域的比率，由此能夠計算培養液中的細胞數。
[0065]並且，細胞數輸出單元107將觀察圖像上的區域中的細胞數和/或培養液中的細胞數輸出至連接於細胞計數裝置100的顯示器等顯示裝置(未圖示)。
[0066]接著，對於細胞計數裝置100的處理順序，參照圖8進行說明。該圖是表示通過本發明的一個實施方式的細胞計數裝置100執行的細胞計數程序的處理順序的流程圖。SP，本實施方式的細胞計數程序使計算機等細胞計數裝置100執行如下的處理。
[0067]首先，細胞計數裝置100的圖像輸入單元101輸入由相機拍攝的觀察圖像，將該圖像記憶於圖像記憶單元102 (步驟10)。
[0068]接著，細胞計數裝置100的圖像分離單元13使用觀察圖像，將細胞團I和單獨細胞2的圖像進行分離，製成細胞團的圖像和單獨細胞的圖像，將這些圖像記憶於圖像記憶單元102 (步驟11)。
[0069] 接著，細胞計數裝置100的單獨細胞計量單元104使用單獨細胞的圖像進行單獨細胞的圓形近似，並計量單獨細胞數。另外，計量單獨細胞的平均面積(步驟12)。
[0070]另外，細胞計數裝置100的細胞團體積計算單元105使用細胞團的圖像計量細胞團的投影面積，並使用該投影面積計算將細胞團假定為球形時的體積(步驟13)。
[0071]然後，該細胞團體積計算單元105將計算的球形的體積進行修正，計算更接近實際的細胞團的體積(步驟14)。
[0072]接著，細胞計數裝置100的細胞團細胞數計算單元106用細胞團的體積除以單獨細胞的體積，由此計算觀察圖像上的區域中的細胞團的細胞數(步驟15)。
[0073]根據以上，能夠分別更準確地計算細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數，因此能夠進一步準確地掌握培養細胞的細胞數。
[0074]最後，細胞計數裝置100的細胞數輸出單元107將細胞團的細胞數和單獨細胞的細胞數進行合計，計算觀察圖像上的區域中的細胞數。另外，將得到的細胞數換算為培養容器整體的細胞數。然後，細胞數輸出單元107將培養容器中的細胞數等輸出於顯示裝置(步驟 16)。
[0075]按照以上說明，以往，特別是若形成一定以上的尺寸的細胞團，則不能夠準確地計數細胞數，因此存在只能實質上在培養後進行計數的問題。
[0076]但是，根據本實施方式變得能夠準確地計數細胞團的細胞數。另外，對於單獨細胞，與現有相比較能夠更準確地計數。因此，能夠進一步準確地掌握培養中的細胞數。
[0077]另外，其結果是能夠記錄細胞增殖歷程，能夠掌握培養中的細胞的狀態。
[0078]還有，通過本實施方式的細胞計數裝置能夠掌握培養中的細胞數，因此能夠消除目測觀察導致的偏差，能夠更準確地進行繼代培養時機的判斷。
[0079]實施例
[0080](實施例1)
[0081]使用上述的實施方式的細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序，將培養容器中的培養細胞進行計數。
[0082]具體地，作為培養容器，使用LLDPE制培養袋(厚度100 μ m,尺寸230 X 620mm)。對於培養基，使用AlyS505N — 7 (細胞科學研究所)，作為接種細胞，接種人末梢血單核球細胞
6.4X 16個細胞。然後，在培養開始66小時後、104小時後、174小時後、222小時後、234小時後，計數培養細胞數。
[0083]其結果是，通過實施例1計算的細胞數如圖9所示，分別為1.60X 108個細胞、4.07 X 18個細胞、8.41 X 18個細胞、1.16 X 19個細胞、1.19 X 19個細胞。
[0084](比較例I)
[0085]使用與實施例1中使用的相同的培養容器和培養細胞，在與實施例1相同的時機，通過現有的方法計數培養細胞。即，使用拍攝培養容器中的規定的區域而得到的培養細胞的觀察圖像，取得細胞的投影面積圖像。並且計量細胞的投影面積，用得到的投影面積除以一個細胞的平均面積，計算細胞數。
[0086]其結果是，通過比較例I計算的細胞數如圖9所示，分別為1.12X108個細胞、
3.79 X 18個細胞、4.34 X 18個細胞、1.08 X 19個細胞、1.1lXlO9個細胞。
[0087](參考例I)
[0088]以與實施例1相同的條件培養細胞，在計數培養細胞時，將細胞團打散，全部成為單獨細胞後進行計數。此時，使用拍攝培養容器中的規定的區域而得到的觀察圖像，將單獨細胞進行圓形近似，並計量細胞數。
[0089]需要說明的是，在每個計數時機分別準備培養容器，且分別僅用於一次計數。因此認為，在本參考例中不存在將細胞團打散導致的培養效率的降低的影響，並且在各自的計數時機內能夠得到接近較真實的細胞數的準確計數結果。
[0090]其結果是，通過參考例I計算的細胞數如圖9所示，分別為1.45X 18個細胞、
4.34X 18個細胞、8.48 X 18個細胞、1.25 X 19個細胞、1.24X 19個細胞。
[0091]如上可知，在比較例I中示出的現有的細胞計數方法中計數值不穩定，不能夠進行準確的計數。例如，174小時後的計數值與實施例1和參考例I的結果相比明顯變低。其原因被認為是由於培養細胞的細胞團變大。
[0092]與此相對，可知，根據實施例1中示出的本實施方式的細胞計數方法、細胞計數裝置和細胞計數程序，即使不將細胞團打散而計數細胞數，也能夠進行與參考例I中示出的將細胞團打散而全部成為單獨細胞後進行計數的情況大致相同的準確計數。
[0093]本發明並不現定於以上的實施方式、實施例，自不必說在本發明的範圍內可以進行各種變更實施。
[0094]例如，在上述實施方式中，在僅計量細胞團的細胞投影面積之後計量單獨細胞數和平均面積，但也可以交換它們的順序。另外，可以進行將校正係數根據細胞數、培養條件進行變更等適當更改。
[0095]產業上的可利用性
[0096] 本發明在有必要培養大量的細胞的生物醫藥、再生醫療、免疫療法等的領域，能夠優選地利用。
【權利要求】
1.一種細胞計數方法，其是計數培養細胞的方法，其特徵在於， 取得所述培養細胞的圖像， 由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像， 分別依據所述細胞團的圖像和所述單獨細胞的圖像，計算所述細胞團的細胞數和所述單獨細胞的細胞數。
2.根據權利要求1所述的細胞計數方法，其特徵在於， 依據所述單獨細胞的圖像進行單獨細胞的圓形近似，並計算所述單獨細胞的細胞數和平均面積。
3.根據權利要求2所述的細胞計數方法，其特徵在於， 依據所述細胞團的投影面積計算所述細胞團的體積， 依據所述單獨細胞的平均面積計算所述單獨細胞的體積， 通過所述細胞團的體積除以所述單獨細胞的體積，計算所述細胞團的細胞數。
4.根據權利要求1或2所述的細胞計數方法，其特徵在於， 預先設定所述單獨細胞的體積， 依據所述細胞團的投影面積計算所述細胞團的體積， 通過所述細胞團的體積除以預先設定的所述單獨細胞的體積，計算所述細胞團的細胞數。
5.根據權利要求3或4所述的細胞計數方法，其特徵在於， 所述細胞團的體積是以球狀計算細胞團的體積後乘以校正係數而計算的。
6.一種細胞計數裝置，其是用於計數培養細胞的細胞計數裝置，其特徵在於，具備: 取得所述培養細胞的圖像的單元、 由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像的單元、和 分別依據所述細胞團的圖像和所述單獨細胞的圖像，計算所述細胞團的細胞數和所述單獨細胞的細胞數的單元。
7.一種細胞計數程序，其是用於計數培養細胞的細胞計數程序，其特徵在於，使計算機執行以下內容: 輸入所述培養細胞的圖像， 由該圖像分離細胞團的圖像和單獨細胞的圖像， 分別依據所述細胞團的圖像和所述單獨細胞的圖像，計算所述細胞團的細胞數和所述單獨細胞的細胞數。
【文檔編號】G06T7/60GK104080922SQ201380007099
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年1月22日 優先權日:2012年1月31日
【發明者】國則正弘, 末永亮, 太田恭平 申請人:東洋制罐集團控股株式會社