人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒及其構建、製備病毒樣顆粒方法與流程
2023-08-05 17:16:46 1
本發明涉及基因工程
技術領域：
，具體涉及人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒及其構建、製備病毒樣顆粒方法。
背景技術：
：在過去的30年裡，杆狀病毒表達載體系統BEVS從未實現的概念轉變成重組蛋白生產的必要系統。由於杆狀病毒結構簡單、生物工藝放大明確、重組抗原的表達水平高、有能力生產複雜蛋白結構，現在BEVS系統被廣泛視為疫苗生產的強有力工具；而且已經用於7種疫苗、1種癌症免疫治療重組蛋白(Provenge)和1種基因治療產品(Glybera)的商品化生產中。這些獨特的優勢使BEVS成為生產VLP疫苗的理想載體，目前一些基於BEVS的病毒樣顆粒VLP疫苗已經進入臨床試驗(CHIKVVLP)。現有的常規做法是將人乳頭瘤病毒HPV18L1蛋白基因克隆到病毒載體上，但通常具有以下缺點：只有單拷貝，蛋白表達量很低，製備出的病毒樣顆粒量也不大。技術實現要素：針對現有技術中的上述問題，本發明的主要目的在於提供人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒及其構建、製備病毒樣顆粒方法，所述方法製備的人類乳頭瘤病毒(HPV)病毒樣顆粒產量高，活性好。為了達到上述目的，本發明採用如下技術方案：人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒，是將人乳頭瘤病毒18型L1基因序列經酶切後得到的兩段基因插入到表達載體中構建而成，所述人乳頭瘤病毒18型L1基因序列根據昆蟲細胞偏愛密碼子優化，所述優化後的人乳頭瘤病毒18型L1基因序列如SEQIDNO:1所示。人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒的構建方法，所述方法包括如下步驟：(1)根據昆蟲細胞偏愛密碼子對野生型HPV18L1胺基酸序列進行密碼子優化，對優化後的含所述HPV18L1基因的兩段序列分別進行雙酶切後得到兩段基因，將所述兩段基因分別克隆到質粒pUC57中，分別命名為pUC57-HPV18L1-1和pUC57-HPV18L1-2；(2)酶切所述pUC57-HPV18L1-1和pFastBacDUAL，回收HPV18L1基因和pFastBacDUAL片段，並將兩片段連接，轉化，篩選，獲得重組質粒pL1；(3)酶切所述pUC57-HPV18L1-2和所述質粒pL1，回收HPV18L1片段和pL1，將兩片段連接，轉化，獲得重組轉移質粒pHPV18L1-DUAL；(4)將所述重組轉移質粒pHPV18L1-DUAL轉化含有AcBacmid及helper質粒的DH10B大腸桿菌中，篩選白色陽性菌落，測序驗證，得到重組質粒AcHPV18L1。作為進一步的優選，所述步驟(1)中，所述酶切的位點分別在所述HPV18L1基因序列的上、下遊，所述上遊採用EcoRI/HindIII酶切位點，所述下遊採用XhoI/KpnI酶切位點。作為進一步的優選，所述步驟(2)和(3)中，所述轉化為轉化DH5α受體菌，所述篩選為慶大黴素和氨苄青黴素雙抗篩選。作為進一步的優選，所述步驟(4)中，所述篩選為在含有IPTG/X-gal以及Kan、Gen、Tet抗生素的LB固體平板中篩選白色陽性菌落。人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒製備病毒樣顆粒方法，所述方法包括如下步驟：a)用所述重組質粒構建重組杆狀病毒；以及b)用所述重組杆狀病毒感染昆蟲細胞，表達所述人乳頭瘤病毒18型主要衣殼蛋白，形成病毒樣顆粒。作為進一步的優選，所述昆蟲細胞為Sf9細胞。作為進一步的優選，所述方法還包括：純化所述病毒樣顆粒。作為進一步的優選，所述病毒樣顆粒的形成方法包括：1)用培養液培養HighFiveTn5細胞，將所述重組杆狀病毒在所述培養液中接種，置於搖床懸浮培養；2)將懸浮培養後的細胞懸液離心，棄上清；3)用預冷的PBS(磷酸緩衝鹽溶液)復懸步驟2)的細胞沉澱，混勻後離心，棄掉上清，清洗；4)用預冷的PBS復懸步驟3)的細胞沉澱，超聲破碎細胞；5)離心步驟(4)細胞，取上清，除去大細胞碎片；6)將步驟5)的上清加入蔗糖溶液，離心，棄上清，沉澱加預冷的PBS過夜復懸並吹打均勻；7)將步驟6)復懸的樣品與氯化銫溶液等體積混勻，離心；分層收集樣品，取樣進行免疫印跡檢測為病毒樣顆粒的樣品；作為進一步的優選，所述步驟1)中，所述細胞密度為1.5×106cells/mL。作為進一步優選，所述蔗糖溶液為40％質量分數的蔗糖水溶液，所述氯化銫溶液為80％質量分數的氯化銫溶液。本發明的有益效果是：1、本發明密碼子優化是根據昆蟲細胞的tRNA的使用頻率，選用高頻使用的密碼子來表達人乳頭瘤病毒18亞型L1基因，由此更適應昆蟲細胞表達；另外，本發明將優化後的人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列酶切後得到兩段基因，使用載體構建雙拷貝HPVL1基因，轉錄出的mRNA是雙份的，表達量也增大，由此製備出的病毒樣顆粒產量增加。2、本發明的表達方法顯著提高了病毒樣顆粒的產量，且產品性質均一、穩定。附圖說明圖1a為本發明實施例1中結合到重組蛋白上抗體的螢光素的螢光示意圖。圖1b為對比例中結合到重組蛋白上抗體的螢光素的螢光示意圖。圖2為本發明實施例1基因雙拷貝組與對比例原始序列組的表達量對比示意圖。圖3為本發明實施例1HPV18病毒樣顆粒的負染電鏡檢測觀察圖。具體實施方式本發明通過提供一種人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒及其構建、製備病毒樣顆粒方法，解決了現有技術中製備的病毒樣顆粒量少的問題。為了解決上述問題，本發明實施例的主要思路是：人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒，是將人乳頭瘤病毒18型L1基因序列經酶切後得到的兩段基因插入到表達載體中構建而成，所述人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列根據昆蟲細胞偏愛密碼子優化，所述優化後的人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列如SEQIDNO:1所示。再用所述重組質粒構建重組杆狀病毒；以及用所述重組杆狀病毒感染昆蟲細胞，表達所述人乳頭瘤病毒18型衣殼蛋白，形成病毒樣顆粒。本發明使用載體構建雙拷貝HPVL1基因，轉錄出的mRNA是雙份的，表達量也增大，由此製備出的人類乳頭瘤病毒(HPV)病毒樣顆粒產量高，活性好。本發明實施例在不改變野生型HPV18L1胺基酸序列的前提下，將每個胺基酸的密碼子替換成昆蟲細胞中使用頻率最高或次高的，同時避免局部出現連續多個的GC、AT，並保證G+C含量在30％-70％之間。為了讓本發明之上述和其它目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉數實施例，來說明本發明所述之人乳頭瘤病毒18型的重組質粒及其構建、製備病毒樣顆粒方法。實施例1密碼子優化在不改變野生型HPV18L1胺基酸序列的前提下，將每個胺基酸的密碼子替換成昆蟲細胞中使用頻率最高或次高的，同時避免局部出現連續多個的GC、AT，並保證G+C含量在30％-70％之間。最後在這段基因上下遊分別加上EcoRI/HindIII和XhoI/KpnI酶切位點，將上述兩段基因分別克隆到質粒pUC57中，分別命名為pUC57-HPV18L1-1和pUC57-HPV18L1-2。密碼子優化及全基因合成均在武漢金開瑞完成。如序列表1所示。載體構建用EcoRI/HindIII酶切pUC57-HPV18L1-1和pFastBacDUAL，瓊脂糖凝膠電泳後用膠回收試劑盒回收HPV18L1基因和pFastBacDUAL片段，連接，轉化DH5α受體菌，經慶大黴素和氨苄青黴素雙抗篩選，獲得重組質粒pL1。同時用XhoI/KpnI酶切pUC57-HPV18L1-2和質粒pL1，回收，回收HPV18L1片段和pL1，連接，轉化DH5α，獲得克隆pHPV18L1-DUAL，克隆提取質粒備用。Bacmid製備將重組轉移質粒pHPV18L1-DUAL轉化含有AcBacmid及helper質粒的DH10B大腸桿菌中，在含有IPTG/X-gal以及Kan、Gen、Tet抗生素的LB固體平板中篩選白色陽性菌落。陽性菌落用mini-attTn7位點外的M13上下遊引物進行PCR鑑定。PCR產物理論值為5.5kb，包括引物之間的mini-attTn7位點、轉座上去的pFastBacDUAL自身片段以及HPV18L1基因。PCR鑑定結果表明目的基因已經正確轉座到Bacmid上，重組Bacmid命名為AcHPV18L1。Bacmid轉染1)取10μL鑑定正確的重組Bacmid加入至100μL無血清培養基中並混勻；2)取10μLCellfectinReagent加入至100μL無血清培養基中並上下顛倒5-10次混勻；將上述兩種液體輕輕混合，室溫放置30min；3)將Sf9細胞以5×105cells/mL密度接種細胞至6孔板，每孔2mL，28℃貼附1h；4)取2mL無血清培養基清洗細胞表面，並吸棄；5)每孔加入800μL無血清培養基，再加入含有重組Bacmid和CellfectinReagent的混合液並輕輕旋轉六孔板混勻；另一孔細胞加空Bacmid及CellfectinReagent所用稀釋液作為陰性對照；6)28℃培養箱中靜置培養4h；7)上述兩孔分別吸棄上清並加入2mL細胞維持液，28℃培養箱中繼續靜置培養72h；8)顯微鏡下觀察實驗孔細胞變大變圓，胞核變大，部分細胞出現空泡且顆粒增多的病變現象後，收穫上清液至無菌1.5mLEP管中，500g離心10min，取上清至一新無菌EP管，並小量分裝，此即為重組杆狀病毒，分別命名為rBacmidHPV18L1WT、rBacmidHPV18L1-DUAL。置於-70℃冰箱避光保存。重組杆狀病毒製備1)取0.1mL第一代重組杆狀病毒rBacmidHPV18L1-DUAL稀釋於5mL的完全培養基中，加入T25瓶長滿約70-80％處於對數生長期的Sf9細胞中。輕輕混勻，使病毒液均勻分布；28℃培養；2)鏡下見細胞核變大，充滿整個細胞，細胞折光率發生變化，部分細胞內出現空泡且顆粒增多，並且開始有細胞出現裂解時，收穫病毒；3)吸出培養上清，500g離心10min，吸取上清分裝於無菌凍存管中，1mL/管，此即為含重組病毒的P2代毒種；4)以同樣操作製備重組杆狀病毒的P3代毒種。病毒樣顆粒的大量製備1)培養HighFiveTn5細胞，當細胞密度約為1.5×106cells/mL時，將HPV18重組杆狀病毒以每100mL培養液接種3mL病毒液的比例接種，置於27℃搖床懸浮培養；2)第四天時收穫細胞，將細胞懸液於4℃4000rpm離心30min，棄上清；3)用預冷的PBS復懸細胞沉澱，混勻後於4℃4000rpm離心10min，棄掉上清，共洗兩遍；4)將細胞用20mL預冷的PBS復懸，用超聲破碎儀冰浴條件下以200W13s/次×30次不連續超聲破碎細胞；5)4℃12000rpm,1h離心取上清，以除去大細胞碎片；6)將上清加入40％的蔗糖之上，4℃30000rpm離心3h，棄上清，沉澱加1mL預冷的PBS過夜復懸並吹打均勻；7)將復懸的樣品與80％氯化銫等體積混勻，4℃40000rpm離心20h；分層收集樣品1mL/層加至EP管中，取樣進行免疫印跡檢測；8)將免疫印跡實驗證實為病毒樣顆粒的樣品，置於超速離心管中，加滿PBS並混勻，4℃30000rpm離心3h以置換氯化銫，沉澱用2mLPBS復懸，即得到初步純化的樣品。對比例密碼子優化在野生型HPV18L1在這段基因上下遊分別加上EcoRI/HindIII酶切位點，將上述基因克隆到質粒pUC57中，分別命名為pUC57-HPV18L1-wt。全基因合成在武漢金開瑞完成。載體構建用EcoRI/HindIII酶切pUC57-HPV18L1-wt和pFastBac1，瓊脂糖凝膠電泳後用膠回收試劑盒回收HPV18L1-wt基因和pFastBac1片段，連接，轉化DH5α受體菌，經慶大黴素和氨苄青黴素雙抗篩選，獲得克隆pHPV18L1-wt，克隆提取質粒備用Bacmid製備將重組轉移質粒pHPV18L1-wt轉化含有AcBacmid及helper質粒的DH10B大腸桿菌中，在含有IPTG/X-gal以及Kan、Gen、Tet抗生素的LB固體平板中篩選白色陽性菌落。陽性菌落用mini-attTn7位點外的M13上下遊引物進行PCR鑑定。PCR產物理論值為5.5kb，包括引物之間的mini-attTn7位點、轉座上去的pFastBac1自身片段以及HPV18L1-wt基因。PCR鑑定結果表明目的基因已經正確轉座到Bacmid上，重組Bacmid命名為AcHPV18L1-wt。Bacmid轉染1)取10μL鑑定正確的重組Bacmid加入至100μL無血清培養基中並混勻；2)取10μLCellfectinReagent加入至100μL無血清培養基中並上下顛倒5-10次混勻；將上述兩種液體輕輕混合，室溫放置30min；3)將Sf9細胞以5×105cells/mL密度接種細胞至6孔板，每孔2mL，28℃貼附1h；4)取2mL無血清培養基清洗細胞表面，並吸棄；5)每孔加入800μL無血清培養基，再加入含有重組Bacmid和CellfectinReagent的混合液並輕輕旋轉六孔板混勻；另一孔細胞加空Bacmid及CellfectinReagent所用稀釋液作為陰性對照；6)28℃培養箱中靜置培養4h；7)上述兩孔分別吸棄上清並加入2mL細胞維持液，28℃培養箱中繼續靜置培養72h；8)顯微鏡下觀察實驗孔細胞變大變圓，胞核變大，部分細胞出現空泡且顆粒增多的病變現象後，收穫上清液至無菌1.5mLEP管中，500g離心10min，取上清至一新無菌EP管，並小量分裝，此即為重組杆狀病毒，分別命名為rBacmidHPV18L1WT。置於-70℃冰箱避光保存。餘下重組蛋白製備步驟同實施例1。下述提供若干實驗例，以證實本發明實施例的優點及效果，具體如下：實驗例一病毒樣顆粒表達量1.免疫螢光檢測目的蛋白將本發明實施例1的P3代重組杆狀病毒以MOI＝5接種於生產狀態良好的sf9細胞，27℃，培養48h，同時以對比例的野毒株為陰性對照組。以4％多聚甲醛固定細胞，室溫放置30min；透化封閉：1)棄去4％多聚甲醛，以0.01MPBS洗細胞3次，500μL/孔，每次5min；2)加入透化封閉液，200μL/孔，室溫靜置30min；HPV18L1鼠源單抗做為一抗，羊抗鼠Alexa-488作為二抗，螢光顯微鏡下檢測，接種六組不同重組杆狀病毒的實驗組48h後，在相同細胞數目情況下，可見較多的綠色螢光且各組與原始序列有差異，陰性對照組則看不到螢光。初步判斷，本發明實施例1雙拷貝組的螢光數多於對比例原始序列組螢光數。見圖1a和1b的對比。2.ELISA法檢測目的蛋白表達量在6孔板裡培養適合濃度的sf9細胞(1×106/孔)，用第三代重組杆狀病毒感染細胞，選取每組最佳MOI值＝5，表達時間為96小時，每個樣品做6個復孔，另設置未感染的sf9細胞作為陰性對照。1)樣品處理:取六孔板內的細胞，用PBS洗三次，用PBS液反覆吹至懸浮後離心，收集細胞，用500μLPBS液懸浮，反覆凍融3次，使細胞破碎，4℃，12000rpm，離心10min。2)取上述上清，用PBS遞倍稀釋至合適濃度，以同樣稀釋度的樣品，加入酶標板中，每孔100μL，37℃包被2h。3)洗板3次，用含1％BSA的PBS溶液封閉1h。4)洗板3次，加入含0.1％BSA的PBS稀釋500倍HPV18L1單抗，每孔100μL，室溫反應2h。5)洗板3次，加入用0.1％BSA的PBS稀釋5000倍的HRP一羊抗小鼠IgG，每孔100μL,室溫反應2h。6)洗板4次，加入顯色底物A和顯色底物B各50μL，37℃孵育10分鐘，加入100μL硫酸(2M)終止反應。7)酶標儀上450nm、570nm波長下讀取光密度值。ELISA法檢測細胞內HPV18L1蛋白含量。通過預實驗摸索合適的包被濃度1μg/mL，包被體積為100μL，結果如表1所示。A列為對比例原始序列組，F為本發明實施例1基因雙拷貝組。表1AF10.5671.64520.5841.65230.5681.58640.5591.66650.5691.65960.5161.568再根據表1中各組的平均值作柱狀圖，如圖2所示，本發明實施例1基因雙拷貝組相對於對比例原始序列組，目的蛋白提高了1.5-2倍。實驗例二病毒樣顆粒驗證和免疫原性分析1.電鏡檢測1)將樣品混勻後取1滴，滴加到銅網上，1min後用濾紙沿銅網邊緣吸乾；2)在樣品上滴加1滴磷鎢酸染色液(用蒸餾水配成2％的磷鎢酸溶液，以1mol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀調整pH6.8，濾過後置4℃，可長期使用)；3)90s後用濾紙沿銅網邊緣吸乾；4)將製備好的負染色樣品送往中科院武漢病毒研究所，電子顯微鏡觀測並照像。圖3為負染電鏡檢測觀察的本發明實施例1得到的HPV18病毒樣顆粒。2.ELISA檢測IgG抗體表2中BALB/c小鼠免疫程序如下：於第0d、14d、28d小鼠眼眶採血，第35d將小鼠眼眶採血後處死，血清於37℃水浴中孵育1h，4℃過夜，次日4℃，7000rpm，離心10min取上層血清，凍存於-70℃冰箱中待用。a.抗原包被1)將Merck公司的HPV18VLPs稀釋為2μg/mL，100μL/孔加到96孔板，4℃下孵育過夜；2)倒掉包被液，用洗液洗去未結合的抗原，洗滌3-5次。加入封閉液(200μL/孔)，4℃下孵育過夜或者37℃下放置1-2小時；3)倒掉封閉液，乾燥箱中37℃烤乾(3-4小時)，分裝於密封袋，4℃保存。b.血清抗體效價檢測1)用樣品稀釋液將待檢測血清倍比稀釋(1:100-1:1000,000)，混勻後100μL/孔加到包被有抗原的96孔板，37℃孵育1小時。2)洗板機上用洗液洗滌5次，洗去未結合的抗體，加入HRP-羊抗小鼠IgG(1:4,000)，37℃孵育30分鐘。3)洗板機上用洗液洗滌5次，加入顯色底物A和顯色底物B各50μL，37℃孵育10分鐘，加入100μL2M硫酸終止反應。4)酶標儀上450nm波長下讀取光密度值。OD450值≥2倍平均空白OD值±3SD判為陽性。c.抗血清檢測結果將對照組、低劑量組(4μg)、中劑量組(8μg)和高劑量(18μg)組分別於第0、14d、28d和35d小鼠眼眶採血，樣品處理後進行ELISA試驗。小鼠IgG抗體水平檢測在不同劑量組抗體水平隨免疫劑量升高而升高，隨免疫時間延長而逐漸升高，高劑量組第5周抗體滴度達到最高值(GMT，15000-20000)。3.抗體中和活性實驗將含有重組杆狀病毒rBacmidHPV18L1-DUAL的Sf9細胞培養上清用PBS一倍稀釋後孵育6孔培養板中哺乳動物細胞293FT(1×106/well)，600g水平離心1h後更換為DMEM完全培養基，37℃培養2h後加入CsCl密度梯度離心純化的pN31-EGFP質粒和脂質體lipofectMINE2000的混合物，12h後換液，48h後收集細胞，用反覆凍融的方法收集細胞的裂解上清，為假病毒。1)將293FT細胞鋪於96孔板中，每孔細胞1.5×104cells/100μL，37℃，5％CO2細胞培養箱中培養5h；2)用DMEM中和培養基將假病毒分別按照MOI＝0.01進行稀釋；3)用DMEM中和培養基將待測血清作系列稀釋，以1：1000為起始稀釋度做2倍倍比稀釋，稀釋10個梯度；4)在96孔稀釋板上，每孔加入60μL抗血清稀釋液及60μL假病毒稀釋液，假病毒液和血清混勻後每種組均做雙復孔，同時設陰性對照孔為中和培養基組、空白對照為培養基組；5)將稀釋板置於冰上孵育1h；6)從稀釋板各孔中吸取100μL的假病毒抗血清混合物，加入鋪好細胞的培養板相應孔內，混合均勻；7)將96孔細胞培養板置於37℃，5％CO2的孵箱中培養72h；8)將消化後的細胞製成細胞懸液，500g離心10min棄上清，用含5％胎牛血清的多聚甲醛重新懸浮。經200目的尼龍網過濾後，使用流式細胞儀進行檢測，計算感染抑制率。公式如下：感染抑制率(％)＝(陰性對照組的螢光細胞比值－血清組的螢光細胞比值)/陰性對照組的螢光細胞比值×100％。本發明實施例1雙拷貝組純化樣品免疫動物後中和抗體結果顯示，HPV18L1VLPs高劑量(16μg)組有較好的抗體滴度並能產生中和抗體。4.免疫原性分析-細胞免疫a.小鼠免疫取加強免疫後第7天(即5周)的小鼠，分離脾單個核細胞，調整細胞密度3.5×106cells/mL，即為淋巴細胞懸液，進行共刺激培養：1)將每隻小鼠分離的脾淋巴細胞加入到24孔板中，每孔加1mL；2)實驗組、陰性對照組各加2μg的Merck苗共培養；PMA做陽性對照；3)將24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中共培養72h。b.脾單個核細胞分離1)取加強免疫後第7天(即5周)的小鼠，摘眼球取血，拉頸處死，75％乙醇浸泡5分鐘；2)無菌操作下剪開腹部皮膚，暴露腹膜，於脾臟處剪開腹膜，取出脾臟，除去脂肪及結締組織，剪成數段，放入盛有約2mL無血清小鼠淋巴細胞培養液的研磨管中；3)將研磨液滴加到200目的尼龍網上，篩網濾過液轉移到已加入5mL淋巴細胞分離液的15mL離心管中；4)常溫800g，離心30min；5)離心後在1640培養基和淋巴細胞分離液層之間可以清晰的看到一層灰白色的細胞，吸出該層細胞至新的15mL離心管中。離心管內加入10mL1640培養基，充分混勻，800g離心10min；6)棄去上清，使用1640培養基重懸沉澱細胞，細胞計數，調整細胞密度3.5×106cells/mL，即為淋巴細胞懸液，備用。c.共刺激培養1)將每隻小鼠分離的脾淋巴細胞加入到24孔板中，每孔加1mL；2)實驗組、陰性對照組各加2μg的Merck苗共培養；PMA做陽性對照；3)將24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中共培養72h。d.ELISA方法檢測細胞因子細胞因子測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10測定：實驗於24孔反應板進行，每孔加入脾淋巴細胞4×106個，終體積為2mL，實驗孔加VLP溶液20μL(終濃度為10μg/mL)，陽性對照孔加ConA溶液20μL(終濃度為25μg/m1)，陰性對照孔以1640培養基代替，每個處理設3個重複，37℃孵育，72h吸取培養上清，離心，上清用於細胞因子測定。雙抗體夾心ELISA法測定測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10，操作按試劑盒說明書進行。分離各組小鼠的脾淋巴細胞，將每隻小鼠分離所得的細胞調整為3.6×106cells/mL，每組加入2μgMerck苗共培養72h後收穫，根據細胞因子檢測試劑盒操作檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。結果顯示，實驗組的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-4各細胞因子指標均顯著高於對照組。上述本申請實施例中的技術方案，至少具有如下的技術效果或優點：1、本發明密碼子優化是根據昆蟲細胞的tRNA的使用頻率，選用高頻使用的密碼子來表達人乳頭瘤病毒18型L1基因，由此更適應昆蟲細胞表達；另外，本發明將優化後的人乳頭瘤病毒18亞型L1基因序列酶切後得到兩段基因，使用載體構建雙拷貝HPVL1基因，轉錄出的mRNA是雙份的，表達量也增大，由此製備出的病毒樣顆粒產量增加。2、本發明的表達方法顯著提高了病毒樣顆粒的產量，且產品性質均一、穩定。儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。SEQUENCELISTING武漢華美生物工程有限公司人乳頭瘤病毒18型L1基因的重組質粒及其構建、製備病毒樣顆粒方法20161PatentInversion3.311518DNAHumanpapillomavirustype161atgtctttgtggttgccatctgaggctactgtttacttgccaccagttccagtttctaag60gttgtttctactgacgagtacgttgctagaactaacatttactaccacgctggtacttct120agattgttggctgttggtcacccatacttcccaattaagaagccaaacaacaacaagatt180ttggttccaaaggtttctggtttgcaatacagagttttcagaatccacttgccagaccca240aacaagttcggtttcccagacacttctttctacaacccagacactcaaagattggtttgg300gcttgtgttggtgttgaggttggtagaggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcac360ccattgttgaacaagttggacgacactgagaacgcttctgcttacgctgctaacgctggt420gttgacaacagagagtgtatttctatggactacaagcaaactcaattgtgtttgattggt480tgtaagccaccaattggtgagcactggggtaagggttctccatgtactaacgttgctgtt540aacccaggtgactgtccaccattggagttgattaacactgttattcaagacggtgacatg600gttcacactggtttcggtgctatggacttcactactttgcaagctaacaagtctgaggtt660ccattggacatttgtacttctatttgtaagtacccagactacattaagatggtttctgag720ccatacggtgactctttgttcttctacttgagaagagagcaaatgttcgttagacacttg780ttcaacagagctggtactgttggtgagaacgttccagacgacttgtacattaagggttct840ggttctactgctaacttggcttcttctaactacttcccaactccatctggttctatggtt900acttctgacgctcaaattttcaacaagccatactggttgcaaagagctcaaggtcacaac960aacggtatttgttggggtaaccaattgttcgttactgttgttgacactactagatccact1020aacatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgagactacttacaagaacactaacttc1080aaggagtacttgagacacggtgaggagtacgacttgcaattcattttccaattgtgtaag1140attactttgactgctgacgttatgacttacattcactctatgaactctactattttggag1200gactggaacttcggtttgcaaccaccaccaggtggtactttggaggacacttacagattc1260gttactcaagctattgcttgtcaaaagcacactccaccagctccaaaggaggacgaccca1320ttgaagaagtacactttctgggaggttaacttgaaggagaagttctctgctgacttggac1380caattcccattgggtagaaagttcttgttgcaagctggtttgaaggctaagccaaagttc1440actttgggtaagagaaaggctactccaactacttcttctacttctactactgctaagaga1500aagaagagaaagttgtaa1518當前第1頁1 2 3