抗微生物多肽的製作方法

2023-08-05 14:47:06 1

專利名稱：抗微生物多肽的製作方法
背景近年來，抗微生物劑的種類大量增加，然而抗性病原性微生物也平行增加。現在認識到抗性針對所有可臨床用抗微生物劑。醫學界對抗微生物抗性的反應是應用以前沒有應用的針對抗性細菌的新的或備選抗生素。此方法需要持續研發新抗生素，作為可抑制或避開細菌抗性機制的現有化合物的修飾或作為化合物組合。
本發明的目的是提供具有改善抗微生物活性的新多肽及編碼所述多肽的多核苷酸。
概述本發明第一方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含如下胺基酸序列或其具有抗微生物活性的至少19個胺基酸的片段G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X1＝L或R； X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F； X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E； X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R； X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；X13＝Q、R、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L； X17＝R、H、Q或P； X18＝I或K。
本發明另一方面涉及具有抗微生物活性的多肽，其包含與以下胺基酸序列至多有兩個胺基酸不同的胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z其中X1＝L或R； X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R； X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L； X17＝R、H、Q或P； X18＝I或K。
本發明第二方面涉及具有編碼本發明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。
本發明第三方面涉及包含核苷酸序列的核酸構建體，所述核苷酸序列編碼本發明的多肽，所述核苷酸序列有效連接指導在合適宿主中產生所述多肽的一種或多種控制序列有效連接。
本發明第四方面涉及包含本發明的核酸構建體的重組表達載體。
本發明第五方面涉及包含本發明的核酸構建體的重組宿主細胞。
本發明第六方面涉及用於產生本發明的多肽的方法，該方法包含(a)在有益於產生所述多肽的條件下培養本發明的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。
本發明的其它方面將從以下描述及所附的權利要求書中是顯然的。
定義在進一步詳細討論本發明之前，首先對以下術語及慣用語進行定義抗微生物活性術語「抗微生物活性」文中定義為能殺死或抑制微生物細胞生長的活性。在本發明的上下文中，術語「抗微生物」欲表示殺細菌和/或制細菌作用和/或殺真菌和/或制真菌作用和/或殺病毒作用，其中術語「殺細菌」理解為能殺死細菌細胞。術語「制細菌」理解為能抑制細菌生長，即抑制生長的細菌細胞。術語「殺真菌」理解為能殺死真菌細胞。術語「制真菌」理解為能抑制真菌生長，即抑制生長的真菌細胞。術語「殺病毒」理解為能滅活病毒。術語「微生物細胞」表示細菌或真菌細胞(包括酵母)。
在本發明上下文中，術語「抑制微生物細胞生長」欲表示細胞處於非生長狀態，即它們不能增殖。
對於本發明，抗微生物活性可根據Lehrer等人，Journal ofImmunological Methods，第137(2)卷，第167-174頁(1991)中描述的方法確定。
在具有抗微生物活性多肽的25％(w/w)的水溶液中，優選10％(w/w)的水溶液中；更優選5％(w/w)的水溶液中；甚至更優選1％(w/w)的水溶液中；最優選0.5％(w/w)的水溶液中；且特別是0.1％(w/w)的水溶液中於20℃孵育8小時後(優選4小時後，更優選2小時後，最優選1小時後，且特別是30分鐘後，)，具有抗微生物活性多肽可能夠將大腸桿菌(Escherichia coli)(DSM 1576)活細胞數降低至1/100。
在微生物生長培養基中，加入1000ppm濃度時，優選加入500ppm濃度時，更優選加入250ppm濃度時，甚至更優選加入100ppm濃度時；最優選加入50ppm濃度時，特別是當加入25ppm濃度時，具有抗微生物活性多肽於25℃孵育24小時也能夠抑制大腸桿菌(DSM 1576)的生長暈。
在具有抗微生物活性多肽的25％(w/w)的水溶液中，優選10％(w/w)的水溶液中；更優選5％(w/w)的水溶液中；甚至更優選1％(w/w)的水溶液中；最優選0.5％(w/w)的水溶液中；且特別是0.1％(w/w)的水溶液中，於20℃孵育8小時後(優選4小時後，更優選2小時後，最優選1小時後，且特別是30分鐘後，)，能夠將枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)(ATCC 6633)的活細胞數降低至1/100。
在微生物生長培養基中，加入1000ppm濃度時，優選加入500ppm濃度時，更優選加入250ppm濃度時，甚至更優選加入100ppm濃度時；最優選加入50ppm濃度時，且特別是當加入25ppm濃度時，具有抗微生物活性多肽於25℃孵育24小時也能夠抑制枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)的生長暈。
本發明的多肽優選具有由SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項1至19位胺基酸顯示的胺基酸序列組成的多肽的至少20％抗微生物活性。在特別優選的實施方案中，所述多肽具有由SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項1至19位胺基酸顯示的胺基酸序列組成的多肽的抗微生物活性的至少40％，如至少50％，優選至少60％，如至少70％，更優選至少80％，如至少90％，最優選至少95％，如約或至少100％。
片段文中應用時，胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57的任意一項或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69的任意一項的「片段」為所述多肽的子序列，其中一個或多個胺基酸自氨基端和/或羧基端缺失。優選一個或多個胺基酸自羧基端缺失。片段可由至少19個胺基酸，如19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29個胺基酸組成。優選片段自多肽的氨基端計數由至少19個胺基酸組成。
等位變體在本上下文中，術語「等位變體」表示佔據相同染色體基因座基因的任意兩個或多個備選形式。等位變異通過突變天然發生，且可在群內導致多態性。基因突變可為沉默的(在所編碼多肽中無變化)或可編碼具有經改變胺基酸序列的多肽。多肽的等位變體為通過基因的等位變體編碼的多肽。
基本上純的多核苷酸文中應用的術語「基本上純的多核苷酸」是指多核苷酸製備物，其中多核苷酸自它的天然遺傳環境中去除，並因此沒有其它外來或不需要的編碼序列且為在遺傳工程蛋白質產生系統中適合應用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有佔與它天然相關的其它多核苷酸材料按重量計算至多10％(優選其它多核苷酸材料的較低百分比，例如按重量計算至多8％，按重量計算至多6％，按重量計算至多5％，按重量計算至多4％，按重量計算至多3％，按重量計算至多2％，按重量計算至多1％且按重量計算至多1/2％)。然而，基本上純的多核苷酸可包括天然存在5』及3』非翻譯區，如啟動子和終止子。優選基本上純的多核苷酸至少92％純，即多核苷酸組成至少佔製備物中存在總多核苷酸材料的按重量計算92％，且優選較高百分率如至少94％純，至少95％純，至少96％純，至少97％純，至少98％純，至少99％純且至多99.5％純是優選的。文中公開的多核苷酸優選基本上純的形式。特別地，文中公開的多核苷酸為「基本上純的形式」即多核苷酸製備物基本上無與它天然相關的其它多核苷酸材料是優選的。文中，術語「基本上純的多核苷酸」與術語「經分離多核苷酸」及「經分離形式的多核苷酸」是同義的。
修飾本發明上下文中術語「修飾」欲表示由胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或如SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項1至19位胺基酸顯示的胺基酸序列組成的多肽的任意化學修飾以及編碼所述多肽的DNA的遺傳操作。修飾可為胺基酸側鏈的取代，在目的胺基酸中或目的胺基酸的替代、缺失和/或插入；或在胺基酸序列中應用具有相似特徵的非天然胺基酸。特別地，修飾可為醯胺化，如C端的醯胺化。
cDNA術語「cDNA」在本上下文中應用時，欲覆蓋可通過自來源於真核細胞的成熟的、已剪接mRNA分子通過反轉錄製備的DNA分子。cDNA缺乏一般在對應基因組DNA中存在的內含子序列。最初的初級RNA轉錄物為mRNA前體且經過一系列加工作用成為成熟的已剪接mRNA。此類作用包括通過稱為剪接的過程去除內含子序列。由於cDNA來自mRNA，因此它缺乏內含子序列。
核酸構建體文中應用時，術語「核酸構建體」表示分離自天然存在基因或以在自然界不存在的方式進行修飾以含有核酸節段的單鏈或雙鏈核酸分子。當核酸構建體含有用於表達本發明的編碼序列所需控制序列時，術語核酸構建體與術語「表達盒」是同義的。
控制序列文中定義的術語「控制序列」包括對本發明的多肽的表達是必需的或有益的所有組分。每個控制序列對編碼多肽的核苷酸序列可為天然的或外來的。此類控制序列包括但不限於前導序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列及轉錄終止子。控制序列最少包括啟動子、轉錄及翻譯終止信號。控制序列可與接頭一起提供用於導入有助於控制序列與編碼多肽的核苷酸序列的編碼區連接的特異限制性位點。
有效連接術語「有效連接」文中定義為構造，所述構造中將控制序列適當置於與DNA序列的編碼序列相關位置使控制序列指導多肽的表達。
編碼序列文中應用時，術語「編碼序列」欲覆蓋核苷酸序列，其直接規定它的蛋白質產物的胺基酸序列。編碼序列的邊界一般通過通常以ATG起始密碼子開始的可讀框確定。編碼序列一般包括DNA、cDNA及重組核苷酸序列。
表達在本上下文中，術語「表達」包括多肽產生相關的任意步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯及翻譯後修飾。優選表達也包含多肽的分泌。
表達載體在本上下文中，術語「表達載體」覆蓋線性或環狀DNA分子，其包含編碼本發明的多肽的節段且所述節段與提供它轉錄的額外節段有效連接。
宿主細胞如文中應用的，術語「宿主細胞」包括用核酸構建體易於轉化的任意細胞類型。
術語「多核苷酸探針」、「雜交」以及多種嚴格條件在標題為「具有抗微生物活性多肽」的節中進行定義。
詳述具有抗微生物活性多肽第一方面，本發明涉及具有抗微生物活性的多肽且其中所述多肽包含，優選由胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQID NO57中任意一項的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的1至19位胺基酸組成。在一個令人感興趣的實施方案中，所述胺基酸序列與胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69的任意一項的1至19位胺基酸的至多五個胺基酸(例如五個胺基酸)，如至多四個胺基酸(例如四個胺基酸)，例如至多三個胺基酸(例如三個胺基酸)，特別是至多兩個胺基酸(例如兩個胺基酸)，如一個胺基酸不同。
術語「SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中的任意一項」欲表示SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9、SEQ IDNO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ ID NO13、SEQ ID NO14、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO29、SEQ ID NO30、SEQ ID NO31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO33、SEQ ID NO34、SEQ ID NO35、SEQID NO36、SEQ ID NO37、SEQ ID NO38、SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO44、SEQ ID NO45、SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ ID NO48、SEQID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO52、SEQ ID NO53、SEQ ID NO54、SEQ ID NO55、SEQ ID NO56或SEQ ID NO57。
術語「SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項」欲表示SEQ IDNO58、SEQ ID NO59、SEQ ID NO60、SEQ ID NO61、SEQ ID NO62、SEQ ID NO63、SEQ ID NO64、SEQ ID NO65、SEQ ID NO66、SEQ ID NO67、SEQ ID NO68或SEQ ID NO69。
優選地，本發明的多肽包含SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項的胺基酸序列或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的胺基酸序列；或其具有抗微生物活性的片段。在另一優選實施方案中，本發明的多肽包含SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的1至19位胺基酸。在更優選的實施方案中，所述多肽由SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的1至19位胺基酸組成。
組成本發明的多肽的胺基酸可獨立地選自D型或L型。
本發明的多肽可為人工變體，與胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的1至19位胺基酸相比，所述人工變體包含，優選由具有至多三個，例如至多兩個，如至多一個胺基酸替代、缺失和/或插入的胺基酸序列組成。此類人工變體可通過本領域已知的標準技術構建，如通過定點/隨機誘變包含胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57的任意一項中1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的1至19位胺基酸顯示的胺基酸序列的多肽來構建。在本發明的一個實施方案中，胺基酸變化較小，即為不顯著影響蛋白質摺疊和/或活性的保守性胺基酸替代；一般為一個至約5個胺基酸的小缺失；小氨基或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸殘基；多達約10-25個殘基的小連接肽；或通過改變淨電荷或另一功能如多組氨酸道(tract)、抗原表位或結合結構域有助於純化的小延伸。
保守性替代的實例在鹼性胺基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性胺基酸(穀氨酸及天冬氨酸)、極性胺基酸(穀氨醯胺及天冬醯胺)、疏水性胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸及甲硫氨酸)、芳香族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小胺基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸及蘇氨酸)中。一般不改變比活的胺基酸替代是本領域已知的且例如通過H.Neurath和R.L.Hill，1979，在The Proteins，Academic Press，紐約一書中描述。最通常發生的交換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu及Asp/Gly以及這些顛倒過來。
在本發明的一個令人感興趣的實施方案中，胺基酸的改變為多肽理化性質改變的性質。例如可進行改善多肽熱穩定性、改變底物特異性、改變最適pH等等的胺基酸改變。
N端延伸本發明的多肽的N端延伸可合適的由1至50個胺基酸，優選2-20個胺基酸，特別是3-15個胺基酸組成。在一個實施方案中N端肽延伸不含有Arg(R)。在另一實施方案中N端延伸包含如以下進一步定義的kex2或kex2樣切割位點。在優選的實施方案中N端延伸為包含至少兩個Glu(E)和/或Asp(D)胺基酸殘基的肽，如包含以下序列EAE、EE、DE及DD之一的N端延伸。
Kex 2位點Kex2位點(參見，例如，D.Goeddel編輯的Methods in Enzymology第185卷，Academic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，「Gene ExpressionTechnology」一書)及Kex2樣位點為一些蛋白質的前肽編碼區及成熟區之間發現的雙鹼性識別位點(即，切割位點)。
在某些情況中顯示插入kex2位點或kex2樣位點改善在前肽切割位點的正確內肽酶加工，導致蛋白質分泌水平增加。
在本發明上下文中，插入kex2或kex2樣位點導致N端延伸某位置獲得切割的可能性，導致與胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的1至19位胺基酸顯示的成熟多肽相比延伸的抗微生物多肽。
融合多肽本發明的多肽也包括融合多肽或可切割融合多肽，所述融合多肽或可切割融合多肽中另一多肽與本發明的多肽或其片段的N端或C端融合。融合多肽通過編碼另一多肽的核苷酸序列(或其部分)與本發明的核苷酸序列(或其部分)融合產生。用於產生融合多肽的技術是本領域已知的，且包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們在框內且融合多肽的表達處於相同啟動子及終止子的控制下。
多核苷酸及核苷酸序列本發明還涉及具有編碼本發明的多肽的核苷酸序列的多核苷酸。特別地，本發明涉及由編碼本發明的多肽核苷酸序列組成的多核苷酸。由於遺傳密碼的簡併性，本領域技術人員易於認識到可以製備編碼本發明的每種多肽的一些核苷酸序列。本領域公知哪些核苷酸組成編碼本發明的多肽的胺基酸的密碼子。
本發明還涉及編碼具有抗微生物活性的胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的片段的多核苷酸。多核苷酸的子序列為其中自5』和/或3』端缺失一個或多個核苷酸的核苷酸序列。
核苷酸序列可通過遺傳工程中應用的標準克隆方法獲得以將核苷酸序列自一個位置至一個不同位點重新定位，所述核苷酸序列在所述不同位點複製。克隆方法可包含切割及分離包含編碼所述多肽的核苷酸序列的目的片段，將該片段插入載體分子及將重組載體整合到宿主細胞，在宿主細胞中所述核苷酸序列的多個拷貝或克隆將進行複製。核苷酸序列可為基因組的、半合成、合成來源的或其任意組合。
編碼本發明的多肽的核苷酸序列的修飾對於包含胺基酸序列的多肽合成可能是必需的，所述胺基酸序列與胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；或SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項的1至29為胺基酸或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項的1至19位胺基酸相比，具有至少一個替代、缺失和/或插入。這些人工變體與分離自天然來源的多肽在一些工程方法上不同，例如在比活、熱穩定性、最適pH等等中不同的變體。
此類修飾可在對分子功能關鍵的區域外產生且仍然產生活性多肽對本領域技術人員是顯然的。本發明的核苷酸序列編碼多肽的活性必需並因此優選不進行修飾，如替代的胺基酸殘基可根據本領域已知方法如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(參見，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085)進行鑑定。在丙氨酸掃描誘變技術中，在分子的每個正電荷殘基上導入突變，對產生的突變分子進行抗微生物活性檢測以鑑定對分子活性重要的胺基酸殘基。如通過技術如核磁共振分析、晶體學或光親和標記法(參見，例如，de Vos等人，1992，Science 255306-312；Smith等人，1992，Journal of Molecular Biology 224899-904；Wlodaver等人，1992，FEBS Letters 30959-64)確定的三維結構的分析也可確定底物-酶相互作用位點。
此外，編碼本發明的多肽的核苷酸序列可通過導入核苷酸替代進行修飾，所述核苷酸替代不產生核苷酸序列編碼的多肽的另一胺基酸序列，但與欲用於產生所述酶的宿主生物體的密碼子選擇對應。
將突變導入核苷酸序列以將核苷酸改變為另一核苷酸可通過定點誘變完成，使用本領域已知方法中的任意一種。特別有用的為利用具有目的插入片段的超螺旋、雙鏈DNA載體及含有目的突變的兩種合成引物的方法。每種與載體的相反鏈互補的寡核苷酸引物通過Pfu DNA聚合酶在溫度循環期間延伸。整合引物後，產生含有交錯切口的經突變質粒。溫度循環後，將產物用對甲基化及半甲基化DNA特異的Dpnl處理以消化親代DNA模板並選擇包含突變的經合成DNA。也可用本領域已知的其它方法。對核苷酸替代的一般性描述，參見例如Ford等人，1991，Protein Expression andPurification 295-107一書。
核酸構建體本發明還涉及包含本發明的核苷酸序列的核酸構建體，所述核苷酸序列有效連接一種或多種控制序列，所述控制序列在合適宿主細胞中在與控制序列相容條件下指導編碼序列的表達。
對編碼本發明多肽的核苷酸序列可以多種方式進行操作以提供多肽的表達。取決於表達載體，插入載體前對核苷酸序列的操作可以是所希望的或必需的。用重組DNA方法修飾核苷酸序列的技術是本領域公知的。
控制序列可為適當的啟動子序列，所述啟動子序列為通過宿主細胞識別用於核苷酸序列的表達的核苷酸序列。啟動子序列含有介導多肽表達的轉錄控制序列。啟動子可為在選擇的宿主細胞中顯示轉錄活性的任意核苷酸序列，包括突變、截短及雜合啟動子，且可自與宿主細胞同源或異源的編碼細胞外或細胞內多肽的基因獲得。
用於指導本發明的核酸構建體轉錄，特別是在細菌宿主細胞中轉錄的合適啟動子的實例為獲自大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α澱粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖澱粉酶基因(amyM)、解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青黴素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內醯胺酶基因(Villa-Kamaroff等人，1978，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 753727-3731)的啟動子，以及tac啟動子(DeBoer等人，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 8021-25)的啟動子。更多啟動子在「Useful proteins from recombinant bacteria」inScientific American，1980，24274-94一書中以及在Sambrook等人，1989，同上一書中描述。
用於指導在絲狀真菌宿主細胞中本發明的核酸構建體的轉錄的適宜的啟動子的實例為得自以下的啟動子米麴黴TAKA澱粉酶、Rhiomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴中性α-澱粉酶、黑麴黴酸穩定α-澱粉酶、黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶(glaA)、Rhiomucor miehei脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、米麴黴丙糖磷酸異構酶、構巢麴黴乙醯胺酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(WO 96/00787)，以及Na2-tpi啟動子(來自黑麴黴中性α-澱粉酶和米麴黴丙糖磷酸異構酶基因的啟動子的雜合體)和它們的突變體、截短和雜合啟動子。
在酵母宿主中，有用啟動子得自以下來源的基因釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它酵母宿主細胞的有用啟動子如Romanos等人，1992，酵母(Yeast)8423-488所述。
所述控制序列還可以是一種適宜的轉錄終止子序列，其為由宿主細胞識別用於終止轉錄的序列。終止子序列有效連接到編碼所述多肽的核苷酸序列的3』末端。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的終止子可以用於本發明。
優選的用於絲狀真菌宿主細胞的終止子得自以下來源的基因米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴氨基苯甲酸合酶、黑麴黴α-葡糖苷酶和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
優選的酵母宿主細胞終止子得自以下來源的基因釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素C(CYC1)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的酵母宿主細胞的終止子。
所述控制序列還可以是適宜的先導序列，為對宿主細胞翻譯重要的mRNA非翻譯區。所述先導序列有效連接到編碼多肽的核苷酸序列的5』末端。任何在所選擇的宿主細胞內發揮功能的先導序列可以用於本發明。
優選的用於絲狀真菌宿主細胞的先導序列得自以下來源的基因米麴黴TAKA澱粉酶和構巢麴黴丙糖磷酸異構酶。
適宜的酵母宿主細胞先導序列得自以下來源的基因釀酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。
所述控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，該序列有效連接到核苷酸序列的3』末端且在轉錄時被宿主細胞識別為一種將聚腺苷殘基加至被轉錄的mRNA的信號的序列。任何在所選擇的宿主細胞中發揮功能的聚腺苷酸化序列可以用於本發明。
優選的用於絲狀真菌宿主細胞的聚腺苷酸化序列得自以下來源的基因米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、構巢麴黴氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑麴黴α-葡糖苷酶。
酵母宿主細胞的有用的聚腺苷酸化序列如由Guo和Sherman，1995，分子細胞生物學(Molecular Cellular Biology)155983-5990所描述。
所述的控制序列還可以是信號肽編碼區，其編碼連接到多肽的氨基末端的胺基酸序列並指導所編碼的多肽進入細胞分泌途徑。所述核苷酸序列的編碼序列的5』端本身可以包含一個天然連接在具有編碼所分泌的多肽的編碼區節段的翻譯讀框上的信號肽編碼區。可選擇地，所述編碼序列的5』端可以包含此編碼序列的外源信號肽編碼區。當所述的編碼序列並不天然包含一個信號肽編碼區時，可能需要外源信號肽編碼區。可選擇地，所述的天然信號肽編碼區可用外源信號肽編碼區簡單替換以促進多肽的分泌。但任何可指導所表達的多肽進入所選擇的宿主細胞的分泌途徑的信號肽編碼區均可用於本發明。
細菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是得自以下來源的基因的信號肽編碼區芽孢桿菌屬NCIB 11837麥芽糖澱粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-澱粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內醯胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。其它的信號肽如在以下文獻中所述Simonen和Palva，1993，微生物學評論(Microbiological Reviews)57109-137。
絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼區是得自以下基因的信號肽編碼區米麴黴TAKA澱粉酶、黑麴黴中性澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纖維素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。
酵母宿主細胞的有用信號肽得自以下來源的基因釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶。Romanos等人，1992，上文，描述了其它有用的信號肽編碼區。
所述控制序列還可以是編碼位於多肽氨基末端的胺基酸序列的前肽編碼區。所得的多肽已知是一種酶原或前多肽(或在某些情況下為酶原)。前多肽一般沒有活性，並可以通過催化切割或自身催化切割來自前多肽的前肽而轉化為成熟的活性多肽。所述的前肽編碼區可以得自以下來源的基因枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α-因子、米赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲黴漆酶(WO 95/33836)。
當在多肽的氨基末端存在信號肽和前肽區兩者時，所述的前肽區與多肽的氨基末端相鄰，所述的信號肽區與所述前肽區的氨基末端相鄰。
加入對與宿主細胞生長相關的多肽的表達進行調節的控制序列也是有利的。那些調控系統的實例是其對化學或物理刺激物(包括存在的調節化合物)的應答可以使得基因的表達被開啟或關閉的系統。原核系統中的調控系統包括lac、tac和trp操縱子系統。在酵母中，可以使用ADH2系統或GAL1系統。在絲狀真菌中，TAKAα-澱粉酶啟動子、黑麴黴葡糖澱粉酶啟動子和米麴黴葡糖澱粉酶啟動子可以用作控制序列。控制序列的其它實例為允許基因擴增的控制序列。在真核系統中，它們包括在甲氨蝶呤存在下擴增的二氫葉酸還原酶基因和用重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與控制序列有效連接。
表達載體本發明還涉及包含本發明的核酸構建體的重組表達載體。以上描述的多種核苷酸及控制序列可連在一起以產生重組表達載體，所述重組表達載體可包括一個或多個方便的限制性位點以允許編碼所述多肽的核苷酸序列在這些位點的插入或替代。備選地，本發明的核苷酸序列可通過將核苷酸序列或包含該序列的核酸構建體插入到用於表達的適當載體進行表達。在產生表達載體時，將編碼序列置於載體中以使編碼序列與適當控制序列有效連接用於表達。
重組表達載體可為任意載體(例如，質粒或病毒)，所述任意載體可方便進行重組DNA方法且可以引起核苷酸序列的表達。載體的選擇一般取決於載體與將導入載體的宿主細胞的相容性。載體可為線性或閉合環狀質粒。
載體可為自主複製載體，即作為染色體外實體存在的載體，其複製不依賴於染色體複製，例如，質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。
載體可包含用於確保自身複製的任意方式。備選地，載體可為這種載體，當其導入到宿主細胞時，與基因組整合且與其整合的染色體一起複製。此外，可應用一種載體或質粒或一起含有欲導入到宿主細胞基因組中總DNA的兩種或多種載體或質粒或轉座子。
本發明的載體優選含有一個或多個允許易於選擇經轉化細胞的選擇標記。選擇標記為基因，其產物提供殺生物或病毒抗性、重金屬抗性、營養缺陷體原養型等等。
細菌選擇標記的實例為來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性的標記。用於酵母宿主細胞的合適標記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及URA3。用於在絲狀真菌宿主細胞中應用的選擇標記包括但不限於amdS(乙醯胺酶)、argB(鳥氨酸氨甲醯轉移酶)、bar(膦絲菌素乙醯轉移酶)、hygB(潮黴素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5』-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷醯轉移酶)、trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。
優選在麴黴細胞中應用的為構巢麴黴或米麴黴的amdS及pyrG基因及吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本發明的載體優選含有允許將載體穩定整合到宿主細胞基因組中或不依賴於基因組在細胞的載體中自主複製的元件。
對於整合到宿主細胞基因組中，載體可依賴於編碼多肽的核苷酸序列或載體任意其它元件用於通過同源或非同源重組將載體穩定整合到基因組中。備選地，載體可含有額外核苷酸序列用於通過同源重組指導整合到宿主細胞基因組中。額外核苷酸能使載體整合到宿主細胞基因組中染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件優選含有足夠數量的核苷酸，如100至1,500個鹼基對，優選400至1,500個鹼基對，且最優選800至1,500個鹼基對，所述鹼基對與對應的靶序列高度同源以增強同源重組的可能性。整合元件可為與宿主細胞基因組中靶序列同源的任意序列。此外，整合元件可為非編碼或編碼核苷酸序列。另一方面，載體可通過非同源重組整合到宿主細胞基因組中。
對於自主複製，載體可進一步包含能使載體在所述宿主細胞中自主複製的複製起點。細菌複製起點的實例為允許在大腸桿菌中複製的質粒pBR322、pUC19、pACYC177及pACYC184及允許在芽孢桿菌中複製的pUB110、pE194、pTA1060及pAMβ1的複製起點。用於在酵母宿主細胞中應用的複製起點實例為2微米複製起點、ARS1、ARS4，ARS1與CEN3的組合以及ARS4與CEN6的組合。複製起點可為具有突變的複製起點，所述突變使得所述複製起點宿主細胞中具有功能性溫度敏感(參見，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 751433)。
可將一個以上拷貝的本發明核苷酸序列插入到宿主細胞以增加基因產物的產生。核苷酸序列拷貝數的增加可通過將至少一個額外拷貝的序列整合到宿主細胞基因組獲得，或者通過所述核苷酸序列包括可擴增的選擇標記基因，其中細胞含有選擇標記基因的經擴增的拷貝，因此通過在存在適當選擇試劑時培養細胞以選擇核苷酸序列的額外拷貝可以獲得核苷酸序列拷貝數的增加。
用於連接以上的描述元件以構建本發明的重組表達載體的方法對本領域技術人員是公知的(參見，例如，Sambrook等人，1989，同上)。
宿主細胞本發明還涉及包含本發明的核酸構建體的重組宿主細胞，所述核酸構建體有益地在多肽重組產生中應用。將包含本發明的核苷酸序列的載體導入到宿主細胞中使載體作為染色體整合體或作為如以前描述的自身複製染色體外載體保持。
宿主細胞可為單細胞微生物例如，原核細胞或非單細胞微生物，例如真核細胞。
有用的單細胞細胞為細菌細胞如革蘭氏陽性細菌，包括但不限於芽孢桿菌細胞，例如，嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)；或鏈黴菌細胞，例如，變鉛青鏈黴菌(Streptomyces lividans)或鼠灰鏈黴菌(Streptomyces murinus)，或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌及假單胞菌種。在優選的實施方案中，細菌宿主細胞為遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細胞。在另一優選的實施方案中，芽孢桿菌細胞為嗜鹼芽孢桿菌。
將載體導入細菌宿主細胞中可通過例如，原生質體轉化(參見，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)、用感受態細胞(參見，例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology 56209-221)、電穿孔(參見，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)或接合(參見，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 1695771-5278)進行。
宿主細胞可為真核細胞，如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。
在優選的實施方案中，宿主細胞為真菌細胞。如文中應用的「真菌」包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)及接合菌門(Zygomycota)(如通過Hawksworth等人，在Ainswoffh and Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，英國一書中定義的)以及卵菌門(Oomycota)(如在Hawksworth等人，1995，同上，第171頁一書中引用的)及所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，同上)。
在更優選的實施方案中，真菌宿主細胞是酵母細胞。文中所用「酵母」包括產子囊孢子酵母(內孢黴目)、產擔子孢子酵母和屬於半知菌的酵母(芽孢綱)。因為酵母的分類在將來可以改變，所以對於本發明，酵母將如Biology and Activities of Yeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，編者，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)所描述的定義。
在優選實施方案中，酵母宿主細胞是假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或Yarrowia細胞。
在最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、可魯弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)細胞。在另一最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細胞。在另一最優選的實施方案中，酵母宿主細胞是Yarrowia lipolvtica細胞。
在另一優選實施方案中，真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括真菌門和卵菌門亞門的所有絲狀形式(如Hawksworth等人，1995，上文定義)。絲狀真菌特徵是由菌絲體壁，其由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其他複雜多糖組成。營養體生長是通過菌絲延長，碳代謝是專性需氧的。相比，酵母，如釀酒酵母的營養體生長是通過單細胞菌體的出芽，碳代謝是發酵的。
在甚至更優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是但不限於，枝頂孢黴屬(Acremonium)、麴黴屬(Aspergillus)、鐮孢屬(Fusarium)、腐質黴屬(Humicola)、毛黴(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、鏈孢黴屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、草根黴菌屬(Thielavia)、Tolypocladium或木黴屬(Trichoderma)的細胞。
在最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是泡盛麴黴(Aspergillusawamori)、臭麴黴(Aspergillus foetidus)、日本麴黴(Aspergillusjaponicus)、構巢麴黴(Aspergillus nidulans)、黑麴黴(Aspergillus niger)或米麴黴(Aspergillus oryzae)細胞。在另一最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是杆孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾穀鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢(Fusarium heterosporium)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、玫瑰色鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色鐮孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum細胞。在甚至最優選的實施方案中，絲狀真菌親本細胞是Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.)。在另一最優選的實施方案中，絲狀真菌宿主細胞是Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米赫毛黴(Mucor miehei)、嗜熱毀絲黴(Myceliophthorathermophila)、粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)、產紫青黴(Penicilliumpurpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichoderma harzianum、康寧木黴(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或綠色木黴(Trichoderma viride)細胞。
通過一種本身已知方法可以轉化真菌細胞，所述方法包括原生質體形成、轉化原生質體和再生細胞壁。用於轉化麴黴屬宿主細胞的適宜的方法在EP 238 023和Yelton等人1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 811470-1474中描述。用於轉化鐮孢屬的適宜方法由Malardier等人，1989，Gene 78147-156和WO 96/00787描述。使用Becker和Guarente，Abelson，J.N.和Simon，M.I.，編者，Guide to YeastGenetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，卷194，182-187頁，Academic Press Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal ofBacteriology 153163；和Hinnen等人，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 751920所描述的方法轉化酵母。
產生方法本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，所述方法包含(a)在有益於產生所述多肽的條件下培養宿主細胞；及(b)回收所述多肽。
在本發明產生方法中，用本領域已知方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養所述細胞。例如，可通過搖瓶培養、在實驗室或工業發酵罐中小規模互大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)在合適培養基中並在允許所述多肽表達和/或分離的條件下培養所述細胞。使用本領域已知方法，在包含碳源、氮源及無機鹽的合適營養培養基中進行培養。合適培養基可以獲自供應商或可根據已公開的組分(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)製備。如果多肽分泌到營養培養基中，那麼可直接自培養基中回收多肽。如果所述多肽不分泌，那麼可自細胞裂解物中回收所述多肽。
可用對所述多肽特異的本領域已知方法檢測所述多肽。這些檢測方法可包括應用特異抗體、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，酶測定法可用於確定如文中描述的多肽的活性。
所得多肽可通過本領域已知方法進行回收。例如，可通過常規方法自營養培養基中回收所述多肽，所述常規方法包括但不限於，離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。
可通過本領域已知的多種方法純化本發明的多肽，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦及大小排阻)、電泳方法(例如，製備等電聚焦)、差別溶解性(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden編輯，VCH Publishers，紐約，1989)。
植物本發明還涉及轉基因植物、植物部分或植物細胞，所述轉基因植物、植物部分或植物細胞用編碼具有本發明的抗微生物活性多肽的核苷酸序列轉化以表達及產生可回收量的多肽。可自植物或植物部分回收所述多肽。備選地，含有重組多肽的植物或植物部分可這樣使用用於提高食品或飼料品質，例如提高營養價值、適口性、流變學性質或破壞抗營養因子。經回收多肽、植物或植物部分可用於改善或改變動物及家畜中的消化菌群。
轉基因植物可為雙子葉(雙子葉植物)或單子葉(單子葉植物)。單子葉植物的實例為禾本科植物，如牧草(blue grass、Poa)，飼料草如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)，溫帶草如剪股穎屬(Agrostis)及穀類，例如小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、高梁及玉米(玉蜀黍)。
雙子葉植物的實例為菸草、馬鈴薯、甜菜，豆類如羽扇豆、豌豆、豆和大豆及十字花科植物(十字花科)如花椰菜、油菜籽及密切相關的模式生物擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
植物部分的實例為莖、愈傷組織、葉、根、果實、種子及塊莖。特定植物組織如葉綠體、質外體、線粒體、液泡、過氧化物酶體及細胞質也被考慮為植物部分。此外，任意植物細胞無論任意組織來源都被考慮為植物部分。
此類植物、植物部分及植物細胞的子代也包括在本發明範圍內。
表達本發明的多肽的轉基因植物或植物細胞可根據本領域已知方法進行構建。簡而言之，通過將編碼本發明的多肽的一個或多個表達構建體整合到植物宿主基因組並將產生的經修飾植物或植物細胞增殖成轉基因植物或植物細胞構建植物或植物細胞。
方便地，表達構建體為核酸構建體，所述核酸構建體包含編碼本發明多肽的核苷酸序列，其與在所選植物或植物部分中表達所述核苷酸序列所需的適當調節序列有效連接。此外，表達構建體可包含用於鑑定表達構建體已經整合的宿主細胞的選擇標記及用於將構建體導入所述植物中必需的DNA序列(所述DNA序列取決於應用的DNA導入方法)。
調節序列如啟動子及終止序列及任選的信號或轉運序列的選擇例如在希望多肽何時、在哪裡及怎樣進行表達的基礎上進行鑑定。例如，編碼本發明多肽的基因的表達可為組成型或誘導型，或可為發育、階段或組織特異的，且基因產物可靶向特定組織或植物部分如種子或葉。例如Tague等人，1988，Plant Physiology 86506描述了調節序列。
對於組成型表達，可應用35S-CaMV啟動子(Franck等人，1980，Cell 21285-294)。器官特異啟動子可為，例如來自儲存庫(sink)組織如種子、馬鈴薯塊莖及果實(Edwards和Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24275-303)或來自代謝庫組織如分生組織(Ito等人，1994，Plant Mol.Biol.24863-878)的啟動子，種子特異啟動子如來自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白啟動子(Wu等人，1998，Plant and Cell Physiology 39885-889)、來自蠶豆的豆球蛋白B4及未知種子蛋白質基因的蠶豆(Viciafaba)啟動子(Conrad等人，1998，Journal of Plant Physiology 152708-711)、來自種子油體蛋白質的啟動子(Chen等人，1998，Plant and CellPhysiology 39935-941)、來自歐洲油菜(Brassica napus)儲藏蛋白質的napA啟動子或本領域已知的任意其它特異啟動子，例如在WO91/14772中描述。此外，啟動子可為葉特異啟動子，如來自稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等人，1993，Plant Physiology 102991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基轉移酶基因啟動子(Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 2685-93)或來自稻的aldP基因啟動子(Kagaya等人，1995，Molecular and General Genetics 248668-674)或創傷誘導型啟動子，如馬鈴薯pin2啟動子(Xu等人，1993，Plant Molecular Biology 22573-588)。
也可應用啟動子增強子元件以獲得在植物中所述酶的較高表達。例如，啟動子增強子元件可為置於啟動子和編碼本發明多肽的核苷酸序列之間的內含子。例如，Xu等人，1993，同上公開了應用稻肌動蛋白1基因的第一個內含子以增強表達。
選擇標記基因及表達構建體的任意其它部分可自本領域可獲得的選擇標記基因及表達構建體中選擇。
根據本領域已知的常規技術，將核酸構建體整合到植物基因組中，所述技術包括農桿菌介導的轉化、病毒介導的轉化、顯微注射、粒子轟擊、生物射彈轉化及電穿孔(Gasser等人，1990，Science 2441993；Potrykus，1990，Bio/Technology 8535；Shimamoto等人，1989，Nature 338274)。
當前，根癌農桿菌介導的基因轉移是用於產生轉基因雙子葉植物的所選方法(對於綜述，參見Hooykas和Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 1915-38)。然而它也可用於轉化單子葉植物，儘管對於這些植物一般優選其它轉化方法。當前，用於產生轉基因單子葉植物的所選方法為離子轟擊(用轉化DNA包裹的顯微金或鎢顆粒)胚胎胼胝體或正發育的胚胎(Christou，1992，Plant Journal 2275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5158-162；Vasil等人，1992，Bio/Technology 10667-674)。用於轉化單子葉植物的備選方法基於如Omirulleh等人，1993，Plant Molecular Biology 21415-428描述的原生質體轉化。
轉化後，根據本領域公知方法對其中整合表達構建體的轉化體進行選擇並再生成完整植物。
本發明還涉及用於產生本發明的多肽的方法，所述方法包含(a)在有益於產生所述多肽的條件下，培養包含編碼具有本發明的抗微生物活性的多肽的核苷酸序列的轉基因植物或植物細胞；和(b)回收所述多肽。
組合物在又一方面，本發明涉及包含本發明的抗微生物多肽的組合物，如藥物組合物。
組合物可包含本發明的多肽作為主要多肽組分，例如單組分組合物。備選地，組合物可包含多種酶活性，如氨肽酶、澱粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角化酶(cutinase)、環糊精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖澱粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、滷過氧化物酶(haloperoxidase)、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽穀氨醯胺酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉穀氨醯胺酶或木聚糖酶。
所述組合物可還包含另一種藥學活性劑，如額外的殺生物劑，如以上定義顯示抗微生物活性的另一抗微生物多肽。如本領域已知的，殺生物劑可為抗生素。抗生素類型包括青黴素，例如青黴素G、青黴素V、二甲氧基苯青黴素、苯唑青黴素、羧苄青黴素、乙氧萘青黴素、氨苄青黴素等；青黴素與β-內醯胺酶抑制劑的組合，頭孢菌素，例如，頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢氨呋肟、拉氧頭孢等；碳青黴烯類(carbapenems)；單環內醯胺；氨基糖苷類；四環素類；大環內酯類；林可黴素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類(quinolones)；氯黴素；甲硝唑；壯觀黴素、甲氧苄啶、萬古黴素等。殺生物劑也可為抗真菌劑，包括多烯，例如兩性黴素B、制黴菌素；5-flucosyn及吡咯類，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康唑及氟康唑。
在一個實施方案中，殺生物劑為非酶化學劑。在另一實施方案中殺生物劑為非多肽化學劑。
在殺生物劑的25％(w/w)水溶液中，優選在10％(w/w)水溶液中；更優選在5％(w/w)水溶液中；甚至更優選在1％(w/w)水溶液中；最優選在0.5％(w/w)水溶液中；且特別是在0.1％(w/w)水溶液中於20℃孵育8小時後(優選4小時後，更優選2小時後，最優選1小時後，且特別是30分鐘後)，殺生物劑能夠降低大腸桿菌(DSM 1576)活細胞數至1/100。
在微生物生長培養基中，當加入1000ppm濃度；優選加入500ppm濃度；更優選加入250ppm濃度；甚至更優選當加入100ppm濃度；最優選加入50ppm濃度；且特別是加入25ppm濃度殺生物劑時，於25℃作用24小時，所述殺生物劑也能夠抑制大腸桿菌(DSM 1576)生長暈。
在殺生物劑的25％(w/w)水溶液中，優選在10％(w/w)水溶液中；更優選在5％(w/w)水溶液中；甚至更優選在1％(w/w)水溶液中；最優選在0.5％(w/w)水溶液中；且特別是在0.1％(w/w)水溶液中於20℃孵育8小時後(優選4小時後，更優選2小時後，最優選1小時後，且特別是30分鐘後)，殺生物劑能夠降低枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)活細胞數至1/100。
在微生物生長培養基中，當加入1000ppm濃度；優選加入500ppm濃度；更優選加入250ppm濃度；甚至更優選加入100ppm濃度；最優選加入50ppm濃度；且特別是加入25ppm濃度殺生物劑時，於25℃作用24小時，所述殺生物劑也能夠抑制枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)生長暈。
組合物可包含合適的載體材料。當組合物用作藥物時，組合物也可包含能將本發明的抗微生物多肽遞送到目的部位的合適遞送載體。
組合物可根據本領域已知方法進行製備且可為液態或乾燥組合物形式。例如，多肽組合物可為顆粒或微顆粒形式。組合物中包括的多肽可根據本領域已知方法進行穩定。
以下給出了本發明的多肽組合物優選用途的實例。本發明的多肽組合物的劑量及組合物應用的其它條件可基於本領域已知方法確定。
方法及用途本發明還包含本發明的抗微生物多肽的多種用途。抗微生物多肽一般用於受細菌、真菌、酵母或藻類汙染的任意部位。一般地，所述部位為水系統，如冷卻水系統、洗衣衝洗水，油系統如切削油、潤滑油、油田等等，需要殺死所述部位的微生物或控制它們的生長。然而，本發明也可用於已知抗微生物組合物有用的所有應用中，如木材、乳膠、粘合劑、膠水、紙、紙板、紡織品、皮革、塑料、堵塞材料及飼料的保護。
其它用途包括食品、飲料、化妝品如洗液、面霜、凝膠、油膏、肥皂、洗髮劑、調節劑、止汗劑、除臭劑、漱口水、隱形眼鏡製品、酶製劑或食品成分的保存。
因此，本發明的抗微生物多肽可作為消毒劑用於例如治療痤瘡、眼或口中的感染、皮膚感染；止汗劑或防臭劑；足浴鹽；用於隱形鏡片、堅硬表面、牙齒(口腔護理)、創傷、擦傷等等的清潔及消毒。
大體上，可以考慮本發明的抗微生物多肽用於任意堅硬表面的清潔、消毒或抑制微生物生長。可與本發明的抗微生物多肽有益接觸的表面的實例為，所用加工設備的表面，所述加工設備為例如乳製品、化學品或藥物加工車間、水衛生系統、油加工車間、紙漿加工車間、水處理車間及冷卻塔。本發明的抗微生物多肽應以對所述表面清潔、消毒或抑制微生物生長有效的量應用。
此外，設想本發明的抗微生物多肽可有益地在就地清洗(C.I.P.)系統中應用用於清潔任意種類加工設備。
本發明的抗微生物多肽又可用於在食品加工車間清潔表面及烹飪用具以及準備或提供食品的任意區域，如醫院、療養院、飯店，特別是快餐店、熟食店等等。在食品製品中它也可作為抗微生物劑應用且特別用於奶酪、水果及蔬菜以及色拉棒上食品的表面抗微生物劑。
所述多肽也可在基於水的油漆中用作防腐劑或消毒劑。
本發明的抗微生物多肽也用於水位線的微生物控制，和用於水的消毒，特別用於工業水的消毒。
本發明還涉及本發明的抗微生物多肽或組合物作為藥物的用途。此外，本發明的抗微生物多肽或組合物也可用於製造藥物用於控制或抗擊微生物，如真菌生物或細菌，優選革蘭氏陽性細菌。
本發明的組合物及抗微生物多肽可用作獸醫用或者用於人的抗微生物治療劑或預防劑。因此，本發明的組合物及抗微生物多肽可用於製備獸醫用的或者用於人的治療劑或預防劑用以治療微生物感染，如細菌或真菌感染，優選革蘭氏陽性細菌感染。特別地微生物感染可與肺病相關，所述肺病包括但不限於肺結核、肺炎及囊性纖維化以及治療性傳播疾病，包括但不限於淋病及衣原體。
本發明的組合物包含有效量的本發明的抗微生物多肽。
術語「有效量」在文中應用時欲表示包含足可抑制所述微生物生長的所述抗微生物多肽或其片段或變體的量，所述多肽包含胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R；X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R；X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K或如SEQ ID NO1至SEQ ID NO57中任意一項1至29位胺基酸序列或SEQ ID NO58至SEQ ID NO69中任意一項1至19位胺基酸顯示的胺基酸序列。
本發明還涉及創傷癒合組合物或產物如繃帶、醫療器具例如導管，還涉及抗頭皮屑產品如洗髮劑。
對遭受或易患微生物感染的宿主施用本發明的抗微生物多肽的製劑。取決於特異微生物，施用可為體表(topical)、局部(localized)或全身的，優選局部施用。大體上本發明的抗微生物多肽的劑量足可降低微生物群體到至少約50％，一般至少1/10，且可殺死至1/100或者以下。本發明的化合物以降低微生物群體而將任意副作用降到最小的劑量施用。設想得到並在醫師的指導下體內使用所述組合物。本發明的抗微生物多肽特別用於殺死革蘭氏陰性細菌，包括綠膿假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)；及革蘭氏陽性細菌，包括多種葡萄球菌(staphylococci)及鏈球菌(streptococci)。
本發明的抗微生物多肽也用於體外製劑以殺死微生物，特別是當不希望導入常規抗生素量時。例如，本發明的抗微生物多肽可加入到動物和/或人食物製品中；或它們可作為用於體外細胞培養的添加劑以防止組織培養中微生物的過度生長。
如在實驗部分中詳細說明的，特定微生物對用本發明的抗微生物多肽殺死的敏感性可通過體外檢測確定。一般地微生物的培養物與抗微生物多肽以多種濃度組合作用足可使蛋白質作用一段時間，一般為約一小時到一天。然後對有活力微生物進行計數並確定殺死水平。
目的微生物包括但不限於，革蘭氏陰性細菌，例如檸檬酸細菌屬(Citrobacter sp.)；腸桿菌屬(Enterobacter sp.)；埃希桿菌屬(Escherichiasp.)，例如大腸桿菌；克雷伯桿菌屬(Klebsiella sp.)；摩根菌屬(Morganellasp.)；變形菌屬(Proteus sp.)；普羅威登斯菌屬(Providencia sp.)；沙門氏菌屬(Salmonella sp.)，例如傷寒沙門氏菌(S.typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌屬(Serratia sp.)；志賀菌屬(Shigellasp.)；假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)，例如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)；耶爾森菌屬(Yersinia sp.)，例如鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)、假結核耶爾森菌(Y.pseudotuberculosis)、結腸耶爾森菌(Y.enterocolitica)；弗朗西絲菌屬(Franciscella sp.)；巴斯德氏菌屬(Pasturella sp.)；弧菌屬(Vibrio sp.)，例如霍亂弧菌(V.cholera)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)；彎曲桿菌屬(Campylobaeter sp.)，例如空腸彎曲菌(C.jejuni)；嗜血桿菌屬(Haemophilus sp.)，例如流感嗜血桿菌(H.influenzae)、杜克雷嗜血桿菌(H.ducreyi)；博德特氏菌屬(Bordetellasp.)，例如，百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、支氣管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)；布魯氏菌屬(Brucella sp.)；奈瑟氏球菌屬(Neisseria sp.)，例如淋病(gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)等。其它目的細菌包括軍團桿菌屬(Legionella sp.)，例如嗜肺性軍團桿菌(L.pneumophila)；利斯特氏菌屬(Listeria sp.)，例如產單核細胞利斯特氏菌(L.monocytogenes)；支原體屬(Mycoplasma sp.)，例如人支原體(M.hominis)、肺炎支原體(M.pneumoniae)；分支桿菌屬(Mycobacteriumsp.)，例如結核分支桿菌(M.tuberculosis)、麻風分支桿菌(M.lepra)；密螺旋體屬(Treponema sp.)，例如蒼白密螺旋體(T.pallidum)；疏螺旋體屬(Borrelia sp.)，例如伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)；細螺旋體屬(Leptospirae sp.)；立克次體屬(Rickettsia sp.)，例如立克立克次體(R.rickettsii)、地方性斑疹傷寒立克次體(R.typhi)；衣原體屬(Chlamydia sp.)，例如沙眼衣原體、肺炎衣原體(C.pneumoniae)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)；螺旋桿菌屬(Helicobacter sp.)，例如幽門螺旋桿菌(H.pylori)等。
目的非細菌病原體包括真菌及原生動物病原體，例如瘧原蟲屬(Plasmodia sp.)，例如惡性瘧原蟲(P.falciparum)；錐蟲屬(Trypanosomasp.)，例如布氏錐蟲(T.brucei)；shistosomes；內阿米巴屬(Entaemoebasp.)；隱球菌屬(Cryptococcus sp.)；念珠菌屬(Candida sp.)，例如白色念珠菌(C.albicans)；等等。
可應用多種施用方法。多肽製劑可經口、或靜脈內注射、皮下注射、腹膜內注射，通過氣溶膠、經眼、膀胱內施用、局部施用等。例如，通過吸入施用的方法是本領域公知的。取決於施用的特定抗微生物多肽、疾病性質、施用頻率、施用方式、活性劑自宿主的清除等等，治療製劑的劑量有很大程度變化。初始劑量可較大，接著是較小的維持劑量。劑量可不經常地每周或每兩周進行施用，或分為較小劑量並每天、每半周等施用一次或幾次以維持有效劑量水平。在許多情況下，經口施用比靜脈內施用需要更高劑量。對於經口施用，可對醯胺鍵以及氨基及羧基端進行修飾以得到更大穩定性。例如，可對羧基端進行醯胺化。
劑型本發明的化合物可摻入到多種劑型用於治療性施用。更特別地，本發明的化合物可通過與適當可藥用載體或稀釋劑組合製成藥物組合物，且可製成固體、半固體、液體或氣體形式的製劑，如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、乳膏、泡沫劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球、洗劑及氣霧劑。如此，化合物的施用可以多種方式完成，包括經口、含服、經直腸、腸胃外、腹膜內、皮內、經皮、氣管內等。本發明的抗微生物多肽在施用後可達到全身或可通過應用在植入部位保持活性劑量的植入物或其它劑型局部化。
在一個實施方案中，用於局部應用的劑型包含降低二價陽離子，特別是鈣離子及鎂離子有效濃度的螯合劑。例如，可包括試劑如檸檬酸鹽、EGTA或EDTA，優選檸檬酸鹽。檸檬酸鹽的濃度一般自約1至10mM。
本發明的化合物可單獨施用、互相組合施用，或它們可與其它已知化合物(例如，穿孔蛋白、消炎劑、抗生素等)組合應用。在藥物劑型中，化合物可以它們可藥用鹽的形式施用。以下方法及賦型劑僅僅為示例性的並且絕非限制。
對於經口製劑，化合物可單獨應用或與適當添加劑組合以製備片劑、粉劑、顆粒劑或膠囊劑，例如，與常規添加劑如乳糖、甘露醇、玉米澱粉或馬鈴薯澱粉；與粘合劑如晶體纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉或明膠；與崩解劑如玉米澱粉、馬鈴薯澱粉或羧甲基纖維素鈉；與潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂；且根據需要，與稀釋劑、緩衝劑、溼潤劑、防腐劑及芳香劑組合應用。
通過將化合物在水性溶劑或非水溶劑如植物油或其它相似油，合成脂族酸甘油酯、高等脂族酸酯或丙二醇中溶解、懸浮或乳化，並且如果需要，使用常規添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和防腐劑將所述化合物製成注射用製劑。
化合物可以以氣霧劑劑型通過吸入施用進行應用。本發明的化合物可配製到可加壓推進劑，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等中。
化合物可通過與常規添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑製備作為例如以防止燒傷感染的洗劑應用。
此外，化合物可通過與多種基質如乳化基質或水溶性基質混合製成栓劑。本發明的化合物可通過栓劑經直腸施用。栓劑可包括在體溫溶解，但在室溫固化的載體如可可脂、碳蠟及聚乙二醇。
可提供用於經口或經直腸施用的單位劑型如糖漿劑、酏劑及混懸劑，其中每種劑量單位，例如一茶匙、一湯匙、片劑或栓劑含有預定量的組合物，其含有本發明的一種或多種化合物。相似地，用於注射或靜脈內施用的單位劑型可包含組合物中的本發明化合物，所述組合物作為無菌水、生理鹽水或另一可藥用載體中的溶液劑。
用於持續釋放劑型的植入物是本領域公知的。植入物與可生物降解或不可生物降解聚合物配製成微球體、厚片(slab)等。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主良好耐受的易蝕聚合物。將含有本發明的抗微生物多肽的植入物置於感染位置附近，使活性劑的局部濃度相對於身體的其餘部位增加。
如文中應用的術語「單位劑型」是指適合用於人及動物受試者的單一劑量的物理上離散的單位，每個單位含有經計算與可藥用稀釋劑、載體或運載體(vehicle)聯合足可產生目的作用的量的預定量的本發明化合物。用於本發明的單位劑型的說明書取決於應用的具體化合物及欲達到的效果和在宿主中與所述化合物相關的藥物動力學。
可藥用賦形劑如運載體、佐劑、載體或稀釋劑對公眾是易於獲得的。此外，可藥用輔助物質，如pH調節及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、溼潤劑等等對公眾是易於獲得的。
用於全身施用的一般劑量為每次施用0.1pg至100微克/kg受試者體重。一般劑量可為每天服用兩至六次，每次一粒片劑或每天服用一次一粒定時釋放膠囊劑或一粒片劑且包含較高比例含量的活性成分。定時釋放作用可通過在不同pH值溶解的膠囊劑材料、通過滲透壓緩慢釋放的膠囊劑或通過任意其它控制釋放的已知方法獲得。
本領域技術人員易於理解劑量水平可隨特定化合物、症狀的嚴重度及受試者對副作用的易感性而變化。一些特定化合物比其它化合物更強效。本領域技術人員通過多種方法易於確定給定化合物的優選劑量。優選方法為測定給定化合物的生理效能。
應用脂質體作為遞送載體是一個令人感興趣的方法。脂質體與靶位點的細胞融合併將腔內容物遞送到細胞內。使用保持接觸的多種方法，如分離、結合劑等等使脂質體保持接觸細胞足夠時間用於融合。在本發明一方面，將脂質體設計為氣溶膠化用於肺部施用。可用介導膜融合的經純化蛋白質或肽，如仙臺病毒或流感病毒等製備脂質體。脂類可為已知形成脂質體的脂類，包括陽離子或兩性離子脂類，如磷脂醯膽鹼的任意有用組合。剩餘脂類通常為中性或酸性脂類，如膽固醇、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油等等。
對於脂質體的製備，可應用Kato等人，(1991)J.Biol.Chem.2663361描述的方法。簡而言之，脂類及含有肽的腔組合物在適當水性介質中組合，所述水性介質方便地為鹽水介質，其中總固體為約1-10重量百分比。短時間強烈攪拌約5-60秒後，將試管置於約25-40℃的溫水浴中並將此循環重複約5-10次。然後將組合物進行超聲處理一段方便時間，一般約1-10秒，並可進一步通過渦旋攪拌。然後通過加入水性介質將體積擴大，大體上增加體積約1-2倍，接著進行搖動及冷卻。此方法使高分子量分子摻入到腔中。
與其它活性劑的劑型對於用於主題方法中，本發明的抗微生物多肽可與其它藥學活性劑，特別是其他抗微生物劑配製。如本領域已知的，其它目的活性劑包括多種抗生素。抗生素類型包括青黴素，例如，青黴素G、青黴素V、二甲氧基苯青黴素、苯唑青黴素、羧苄青黴素、乙氧萘青黴素、氨苄青黴素等；青黴素與β-內醯胺酶抑制劑的組合，頭孢菌素，例如，頭孢克洛、頭孢唑啉、頭孢氨呋肟、拉氧頭孢等；碳青黴烯類；單菌黴素；氨基糖苷類；四環素類；大環內酯類；林可黴素類；多粘菌素類；磺胺類；喹諾酮類；氯黴素；甲硝唑；壯觀黴素、甲氧苄啶；萬古黴素；等。
抗真菌劑也是有用的，包括多烯，例如兩性黴素B、制黴菌素；5-flucosyn及吡咯類，例如咪康唑、酮康唑、伊曲康唑及氟康唑。抗結核病藥包括異煙肼、乙胺丁醇、鏈黴素及利福平。細胞因子也可以包括在本發明的抗微生物多肽劑型中，所述細胞因子為例如γ幹擾素、腫瘤壞死因子α、白細胞介素12等。
體外合成用如本領域已知的常規方法，可通過體外合成製備本發明的抗微生物多肽。多種商品化合成裝置例如通過Applied BiosystemsInc.，Beckman的自動合成儀等是可獲得的。通過用合成儀，可用非天然胺基酸，特別是D-異構體(或D-型)例如，D-丙氨酸及D-異亮氨酸、非對映異構體、具有不同長度或功能性的側鏈等等替代天然存在胺基酸。特定序列及製備方式可由方便性、經濟、所需純度等等決定。
可為包含方便官能度的多種肽或蛋白質提供化學連接用於形成鍵，如氨基用於醯胺或取代胺形成，例如還原性胺化，巰基用於硫醚或二硫化物形成，羧基用於醯胺形成等等。
如果希望，在合成期間或表達期間，可將允許與其它分子或與表面連接的多種基團導入到肽中。因此，可用半胱氨酸製備硫醚、組氨酸用於連接金屬離子絡合物、羧基用於形成醯胺或酯、氨基用於形成醯胺等等。
也可根據重組合成的常規方法對多肽進行分離及純化。可製備表達宿主的裂解物且用HPLC、排阻層析、凝膠電泳、親和層析或其它純化技術對裂解物進行純化。對於大部分，相對於與產物製備方法及它的純化相關的汙染物，應用的組分佔目的產物至少20％重量，更一般佔至少約75％重量，優選至少約95％重量，並且對於治療目的，一般佔至少約99.5％重量。一般地，百分率基於總蛋白質。
動物飼料本發明還涉及在動物飼料中使用具有抗微生物活性多肽的方法，還涉及包含本發明的抗微生物多肽的飼料組合物及飼料添加劑。
術語動物包括所有動物，包括人。動物的實例為非反芻動物及反芻動物，如牛、綿羊及馬。在特定實施方案中，動物為非反芻動物。非反芻動物包括單胃動物，例如豬(包括但不限於小豬、成長豬及母豬)；家禽如火雞及雞(包括但不限於適於烘烤小雞、產蛋雞)；小牛；及魚(包括但不限於鮭魚)。
術語飼料或飼料組合物表示動物適合或欲用於動物攝取的任意化合物、製備物、混合物或組合物。
在根據本發明的用途中，抗微生物多肽可在膳食之前、之後或同時進行餵食，與膳食同時餵食是優選的。
在特定實施方案中，對加入到飼料中，或包括在飼料添加劑中的形式的抗微生物多肽進行了明確定義。，明確定義表示抗微生物多肽製劑為至少50％純，這可以如通過大小排阻層析(參見WO01/58275實施例12)確定。在另一特定實施方案中，如通過這個方法確定的，抗微生物多肽製劑至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％純。
明確定義的抗微生物多肽製劑是有益的。例如，向飼料中正確添加基本上不幹擾或汙染其它抗微生物多肽的抗微生物多肽是較容易的。術語正確添加特別是指獲得一致及恆定結果的目的，和基於預期效果優化劑量的能力。
然後，對於在動物飼料中應用，抗微生物多肽不必那麼純；例如它可包括其它酶，在這種情況下它可稱為抗微生物多肽製劑。
抗微生物多肽製劑可(a)直接加入到飼料中(或在植物蛋白質的處理過程中直接應用)，或(b)它可在產生一種或多種中間組合物如飼料添加劑或預混物中應用，所述中間組合物隨後加入到飼料中(或在處理過程中應用)。無論是根據以上(a)或(b)應用，以上描述的純度是指初始抗微生物多肽製劑的純度。
具有這個數量級純度的抗微生物多肽製劑用重組產生方法是特別易獲得的，而通過傳統發酵方法產生抗微生物多肽時，它們不易獲得且批與批之間差異也較大。
此類抗微生物多肽製劑當然可與其它酶混合。
如文中應用的術語植物蛋白質是指包括來自或起始自植物的至少一種蛋白質的任意化合物、組合物、製劑或混合物，包括經修飾蛋白質及蛋白質衍生物。在特定實施方案中，植物蛋白質的蛋白質含量為至少10、20、30、40、50或60％(w/w)。
植物蛋白質可來自植物蛋白質源，如豆類及穀類，例如來自豆科(Fabaceae(Leguminosae))、十字花科、藜科(Chenopodiaceae)及禾本科(Poaceae)植物的物質，如大豆膳食、羽扇豆膳食及油菜籽膳食。
在特定實施方案中，植物蛋白質源為來自豆科的一種或多種植物的材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆。
在另一實施方案中，植物蛋白質源為來自藜科的一種多種植物的材料，例如甜菜(beet)、甜菜(sugar beet)、菠菜或昆諾阿藜(quinoa)。
植物蛋白質源的其它實例為油菜籽及捲心菜。
大豆為優選的植物蛋白質源。
植物蛋白質源的其它實例為穀類如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米(玉蜀黍)、稻及高梁。
抗微生物多肽可以任意形式加入到飼料中，所述任意形式可以是相對純的抗微生物多肽或與欲用於加入到動物飼料的其它組分混合，即以動物飼料添加劑的形式，如所稱作的動物飼料的預混物。
又一方面本發明涉及在動物飼料中應用的組合物，如動物飼料及動物飼料添加劑，例如預混物。
除了本發明的抗微生物多肽外，本發明的動物飼料添加劑含有至少一種脂溶性維生素和/或至少一種水溶性維生素和/或至少一種微量礦物質、和/或至少一種大量礦物質。
此外，任選地，飼料添加劑成分為著色劑、芳香化合物、穩定劑和/或至少一種選自植酸酶EC 3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC 3.2.1.8；半乳聚糖酶EC 3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC 3.2.1.4中的其它酶。
在特定實施方案中，這些其它酶是明確定義的(如以上對於抗微生物多肽製劑定義的)。
其它抗微生物肽(AMP’s)的實例為CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、Protegrin-1、Thanatin、防衛素、Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer，2000)及其保持抗微生物活性的變體或片段。
其他抗真菌多肽(AFP’s)的實例為如在WO 94/01459及PCT/DK02/00289[一旦公開用WO號替換]中公開的巨大麴黴(Aspergillusgiganteus)及黑麴黴肽，其以及保持抗真菌活性的變體及片段。
通常脂溶性及水溶性維生素，以及微量礦物質形成部分所稱作的預混物以用於加入到飼料中，而大量礦物質通常單獨加到飼料中。這些組合物類型當富含本發明的抗微生物多肽，為本發明的動物飼料添加劑。
在特定實施方案中，在動物膳食或飼料中欲包括(或規定應當包括)0.01至10.0％水平；更特別是0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％表示每100g飼料g添加劑)的本發明的動物飼料添加劑。這對於預混物尤其如此。
以下為這些組分實例的非排他性列表脂溶性維生素的實例為維生素A、維生素D3、維生素E及維生素K，例如維生素K3。
水溶性維生素的實例為維生素B12、生物素及膽鹼、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸及泛酸鹽，例如Ca-D-泛酸鹽。
微量礦物質的實例為錳、鋅、鐵、銅、碘、硒及鈷。
大量礦物質的實例為鈣、磷及鈉。
這些組分的營養需要量(用家禽及小豬/豬示例)在WO 01/58275表A中列出。營養需要量表示這些組分在膳食中以標明的濃度提供。
備選地，本發明的動物飼料添加劑包含在WO 01/58275表A中詳細說明的至少一種單獨組分。至少一種表示一種或多種，一種、或兩種、或三種、或四種等等直到所有十三種、或直到所有十五種單獨組分。更特別地，這至少一種單獨組分以提供表A中第四列或第五列或第六列中標明範圍內的飼料濃度量包括在本發明的添加劑中。
本發明還涉及動物飼料組合物。動物飼料組合物或膳食具有相對高含量的蛋白質。家禽及豬的膳食可如WO 01/58275表B的第2-3列中標明的表徵。魚膳食可如這個表B第4列中標明的表徵。此外此類魚膳食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
根據本發明的動物飼料組合物具有50-800g/kg的粗蛋白質含量，且此外包含如文中要求保護的至少一種抗微生物多肽。
此外，或備選地(對於以上標明的粗蛋白質含量)，本發明的動物飼料組合物具有10-30MJ/kg可代謝能量含量；和/或0.1-200g/kg的鈣含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg賴氨酸含量。
在特定實施方案中，可代謝能量、粗蛋白質、鈣、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或賴氨酸含量在WO 01/58275(R.2-5)表B中的2、3、4或5行中的任意一行中。
粗蛋白質通過氮(N)乘以因子6.25計算，即粗蛋白質(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。氮含量通過凱氏定氮法(A.O.A.C.，1984，Official Methods ofAnalysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，華盛頓)確定。
可基於NRC出版物Nutrient requirements in swine，第九次修訂版，1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board of agriculture.national research council.National Academy Press，華盛頓，第2-6頁一書中，以及European Table of Energy Values forPoultry Feed-stuffs，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DA Beekbergen，荷蘭一書中，Grafisch bedrijf Ponsenlooijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5計算可代謝能量。
完全動物膳食中鈣、有效磷及胺基酸膳食含量通過在飼料表如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg 6,8219pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7一書飼料表基礎上進行計算。
在特定實施方案中，本發明的動物飼料組合物含有至少一種以上定義的植物蛋白質或蛋白質源。
在又一特定實施方案中，本發明的動物飼料組合物含有0-80％玉米；和/或0-80％高梁；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-40％大豆粉；和/或0-10％魚粉；和/或0-20％乳清。動物膳食可例如作為碎飼料(非顆粒)或顆粒飼料進行製備。一般地，將磨碎飼料進行混合併根據用於相關物種的說明書加入足量必需維生素及礦物質。酶可作為固體或液體酶劑型加入。例如固體酶劑型一般在混合步驟之前或期間加入；液體製劑一般在造粒步驟之後加入。酶也可摻合到飼料添加劑或預混物中。
膳食中的最終酶濃度在每kg膳食0.01-200mg酶蛋白質範圍內，例如在每kg動物膳食中5-30mg酶蛋白質的範圍。
抗微生物多肽可以以下量(劑量範圍)的一種或多種進行施用0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10，所有這些範圍為mg抗微生物多肽蛋白質/kg飼料(ppm)。
為確定每kg飼料中所含mg抗微生物多肽蛋白質，將抗微生物多肽自飼料組合物中純化，且經純化抗微生物多肽的比活用相關測定法(參見以下抗微生物活性、底物及測定法)測定。如此類的飼料組合物中抗微生物活性也可用相同測定法測定，且在這兩個測定基礎上，計算以每kg飼料所含mg抗微生物多肽蛋白質表示的劑量。
相同原理用於測定飼料添加劑中mg抗微生物多肽蛋白質。當然，如果用於製備飼料添加劑或飼料的抗微生物多肽的樣品是可獲得的，那麼自這個樣品確定比活(不需要自飼料組合物或添加劑中純化抗微生物多肽)。
洗滌劑組合物可向洗滌劑組合物中加入本發明的抗微生物多肽並且其因此成為洗滌劑組合物的組分。
本發明的洗滌劑組合物可例如作為手工或機器洗衣洗滌劑組合物製備，所述手工或機器洗衣洗滌劑組合物包括適合用於預處理經染色織物的洗衣添加組合物及漂洗添加織物軟化劑組合物，或可作為用於一般家庭硬表面清洗操作的洗滌劑組合物製備，或用於手工或機器洗盤操作製備。
在特定方面中，本發明提供了包含本發明的抗微生物多肽及表面活性劑的洗滌添加劑。洗滌添加劑以及洗滌劑組合物可包含一種或多種其它酶，如蛋白酶、脂肪酶、角化酶、澱粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(如漆酶)和/或過氧化物酶(如滷過氧化物酶)。
通常，所選酶的性質應與所選洗滌劑相容(即最適pH、與其它酶和非酶成分等的相容性)，且酶應以有效量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括來自動物、植物、微生物的蛋白酶。來源於微生物的蛋白酶是優選的。也包括經化學修飾或蛋白工程化的突變體。所述的蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優選鹼性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。鹼性蛋白酶的實例為枯草桿菌蛋白酶，特別是來自芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如來自豬或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所公開的鐮孢黴屬的蛋白酶。
有用的蛋白酶的實例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的變體，特別是在一個或多個下述位置發生替換的變體27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，218，222，224，235和274。
脂肪酶合適的脂肪酶包括那些來源幹細菌或真菌的脂肪酶。也包括經化學修飾或蛋白工程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括如EP258 068和EP 305 216中所公開的來自腐質黴屬(Thermomyces與之同物異名)，例如來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶或如WO96/13580中所公開的來自H.Insolens的脂肪酶，假單胞菌脂肪酶，例如來自產鹼假單胞菌(P.Alcaligenes)或類產鹼假單胞菌(P.Pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋蔥假單胞菌(P.Cepacia)(EP 331376)，施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，螢光假單胞菌(P.Fluorescens)，假單胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)，芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等人(1993)，生物化學與生物物理學學報(Biochemica etBiophysica Acta)，1131，253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B.Pumilus)(WO 91/16422)。
其它的實例為如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 4072 25，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所公開的脂肪酶變體。
澱粉酶合適的澱粉酶(α和/或β)包括那些來源於細菌或真菌的澱粉酶。也包括經化學修飾或蛋白工程化的突變體。澱粉酶包括例如來源於芽孢桿菌的α-澱粉酶，例如來自地衣芽孢桿菌的特定菌株，詳細內容參見GB 1,296,839。
有用的澱粉酶的實例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的變體，尤其是那些在一個或多個下列位置發生替換的變體15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。
纖維素酶合適的纖維素酶包括來源於細菌或真菌的纖維素酶。也包括其經化學修飾或蛋白工程突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質黴屬、鐮孢黴屬、草根黴屬、枝頂孢黴屬的纖維素酶，例如可由在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691,178，US5,776,757和WO 89/09259中公開的Humicola insolens、嗜熱毀絲黴和尖孢鐮孢產生的所述真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有顏色保護優勢的鹼性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的實例為如EP 0 495 257，EP 05 313 72，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公開的纖維素酶。其它的實例為如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公開的纖維素酶變體。
過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括那些來源於植物、細菌或真菌的過氧化物酶/氧化酶。也包括化學修飾或蛋白工程化的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括如WO 93/24618，WO 95/10602和WO 98/15257所述的來自鬼傘屬(Coprinus)(例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus))和其變體的過氧化物酶。
所述的洗滌劑酶可以通過添加含一種或多種酶的獨立添加劑，或通過添加含所有這些酶的組合添加劑而被包含於洗滌劑組合物中。本發明的洗滌劑添加劑，也就是獨立添加劑或組合添加劑可以製成例如顆粒狀、液體、漿狀等等。優選的洗滌劑添加劑形式為顆粒狀(特別是非粉末化顆粒)、液體(特別是穩定的液體)或漿。
非粉末化顆粒可依照例如US 4,106,991和4,661,452所述進行生產並可任選地用已知的方法包被。蠟狀包被材料的實例是平均分子量為1000到20000的聚(環氧乙烷)產物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50個環氧乙烷單位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基脂肪醇，其中，醇含12到20個碳原子且其中存在15到80個環氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中給出了適合於通過流化床技術應用的成膜包被材料的實例。液體酶製劑可以依照現成的方法通過例如添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以穩定。受保護的酶可依照EP 238,216中所公開的方法進行製備。
本發明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如棒狀、片狀、粉末、顆粒、粘團或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含高達70％的水和0-30％的有機溶劑，或不含水的。
所述的洗滌劑組合物一般包含一種或多種表面活性劑，它們可以是非離子表面活性劑，包括半極性的和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子表面活性劑。所述的表面活性劑一般佔到0.1％到60％的重量。當包含在所述洗滌劑中時，通常包含約1％到約40％的陰離子表面活性劑，如直鏈烷基苯磺酸酯、α-烯屬磺酸酯、硫酸烷基酯(硫酸脂肪醇酯)、乙氧基硫酸醇酯、仲鏈烷磺酸酯、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸或皂。
當包含在所述洗滌劑中時，通常含有約0.2％到約40％的非離子表面活性劑例如乙氧基化脂肪醇、乙氧基化壬基酚、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇醯胺、脂肪酸單乙醇醯胺、多羥基烷基脂肪酸醯胺或葡糖胺的N-醯基N-烷基衍生物(「葡糖醯胺」)。
所述的洗滌劑可以包含0-65％的洗滌劑增潔劑或絡合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性矽酸鹽或層疊式矽酸鹽(例如購自Hoechst的SKS-6)。
所述的洗滌劑還可以包含一種或多種聚合物。實例為羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。
所述的洗滌劑還可以含有可能包含H2O2來源的漂白體系，如可以與形成過酸的漂白活化劑如四乙醯基乙二胺或壬醯氧基苯磺酸鹽結合的過硼酸鹽或過碳酸鹽。可選擇地，所述的漂白體系可以包含例如醯胺、二醯亞胺或碸類的過氧酸。
本發明的洗滌劑組合物中的酶可以通過諸如以下的常規穩定劑穩定多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲醯基苯基硼酸，且所述的組合物也可製備為如WO 92/19709和WO 92/19708中所述的組合物。
所述的洗滌劑還可以包含其它的常規洗滌劑成分例如纖維調節劑包括黏土、增泡劑、泡沫抑制劑、抗腐蝕劑、汙物懸浮劑、抗汙物再沉澱劑、染料、殺菌劑、光學增白劑、助溶劑、失澤抑制劑或香料。
目前認為在本發明的洗滌劑組合物中，任意酶及本發明的抗微生物多肽可以以相當於每升洗滌液中具有0.01-100mg酶蛋白質，優選每升洗滌液0.05-10mg酶蛋白質，更優選每升洗滌液中0.1-5mg酶蛋白質，特別優選每升洗滌液中具有0.1-1mg酶蛋白質的量加入。
本發明的抗微生物多肽可額外摻入到如WO 97/07202所公開的洗滌劑製劑中，該文獻引入本文作為參考。
本發明通過以下實例進一步描述，所述實例不應理解為限制本發明範圍。
實施例用作緩衝劑及底物的化學試劑為至少試劑級的商品。
實施例1抗微生物多肽(Cat1)的克隆、表達及活性評估編碼Cat1的合成基因的克隆為了產生抗微生物多肽Cat1(SEQ ID NO3)用於抗微生物活性測定，製備合成基因(見下文)並將其插入到表達載體pET31b+(Novagen Inc.)。合成基因由特別設計的寡核苷酸(引物1及引物2)構成。
編碼Cat1的合成基因(SEQ ID NO70)
GGC CTG CTG CGC CGT CTG CGC AAG AAG ATT GGC AAA AAG CTG AAG AAAG L L R R L R K K I G K K L K KATT GGC CAG AAG ATT AAA CCG ATT CGC ATT CTG GTG CCG TAGI G Q K I K P I R I L V P *引物1(SEQ ID NO72)ATTATTCAGA TGCTGGATCC GGCGGAAGGC CTGCTGCGCC GTCTGCGCAA GAAGATTGGCAAAAAGCTGA AGAAAATTGG CCAGAAGATT AAACCGATTC GCATTCTGGT GCCGTAGCTCGAGATTATT引物2(SEQ ID NO73)AATAATCTCG AGCTACGGCA CCAGAATGCG AATCGGTTTA ATCTTCTGGC CAATTTTCTTCAGCTTTTTG CCAATCTTCT TGCGCAGACG GCGCAGCAGG CCTTCCGCCG GATCCAGCATCTGAATAAT側翼限制性內切酶位點(AlwNI/AvaI)的酶消化使我們能克隆在pET31b+中作為融合構建體的這個合成基因(如通過生產商New EnglandBiolabs Inc.描述的標準方法)。所有標準方法在別處已經描述(Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989)。
Cat1在大腸桿菌中的轉化及表達如通過生產商(Novagen)描述的，將重組pET31b+轉化到大腸桿菌Novablue中。通過QIAprep小柱(QIAGEN Inc.)製備質粒且用質粒特異引物(引物3及引物4)通過自動測序對質粒測序。
引物3(SEQ ID NO74)TGCTA GTTAT TGCTC AGCGG引物4(SEQ ID NO75)ACCGT AGTTG CGCCC ATCG根據生產商(Novagen)將質粒轉化到大腸桿菌BLR-DE3中。將細菌在LB培養基中培養至OD600～0.8且通過1mM IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)起始重組蛋白質合成。經過3小時誘導作用，收穫細菌，在1/10體積的緩衝液A(50mM Tris-HCl，1mM EDTA，100mM NaCl，pH 8)中重懸浮並通過壓力破裂(1500mBar)裂解。產生的沉澱物在緩衝液B(50mM Tris-HCl，10mM EDTA，0.5％TritonX-100，100mMNaCl，pH 8)中洗兩次。所有標準方案在別處已經描述(Sambrook，Fritsch和Maniatis，1989)。
自大腸桿菌內含體中純化Cat1自以上純化得到的沉澱物包含經純化內含體。為了自KSI融合配偶體中釋放肽，在經改造的導入編碼Cat1的基因的N-端的Asp-Pro位點進行酸性水解。將內含體在100mM磷酸鈉(pH 2.3)中重懸浮並於85攝氏度孵育過夜。得到的上清液包含肽(PAE-Cat1)。樣品通過加入100mM磷酸鈉(pH 12.3)中和。為了使肽成熟，將肽用穀氨醯內肽酶I(來自地衣芽孢桿菌)進行處理。經成熟肽通過質譜分析法證實並進一步通過標準層析方法純化。
通過全國臨床標準實驗委員會(NCCLS)微稀釋培養基測定(MIC和MBC)抗微生物活性根據NCCLS用於新抗微生物化合物敏感性試驗的指南(Methods forDilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That GrowAerobically；Approved Standard第五版，NCCLS document M7-A5(ISBN1-56238-394-9))，我們發現Cat1的廣譜活性。以下細菌菌株對Cat1敏感(MIC＜64μg/ml)枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(ATCC9341)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(DSM1798)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)(DSM2570)、產氣假單胞菌(Pseudomonas aeroginosa)(ATCC27853)、支氣管敗血性博德特氏菌(Bortadella bronchiseptica)(ATCC4617)、大腸桿菌(ATCC10536)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)(ATCC10031)、豬霍亂沙門菌(Salmonella choleraesuis)(DSM9220)及奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)(ATCC7002)。最低殺菌濃度(MBC)在相似範圍內，表明Cat1活性是殺細菌的。
在另一研究中，對多種與創傷感染相關微生物菌株測定Cat1的特定MIC。如在以上談及的NCCLS方案中推薦的，將菌株在經陽離子調節的Muller-Hinton培養基中生長。檢測的最高濃度為32μg/ml。表1中的結果表明Cat1為對許多不同革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌具有強效活性的廣譜抗生素。
表1
在不同試驗條件下的MIC值還在微肉湯(microbroth)稀釋測定中用經陽離子調節的Muellerhinton培養基(MHB)測定Cat1的最低抑制濃度，其中如以下表2描述的，以不同修飾應用MHB。所選受試生物為產氣假單胞菌(ATCC 27853)。
表2
殺滅動力學用產氣假單胞菌(ATCC 27853)作為受試生物在MHB中測定Cat1的殺滅率。將細菌與Cat1(在4×MIC濃度)孵育。在不同時間點，將製劑的幾種稀釋液塗平板並確定活細胞的估計(CFU/ml)。表3中的結果表明Cat1快速殺死細菌，在30分鐘內將CFU降低至約1/1000。
表3
通過輻射擴散測定法(MEC)測定抗微生物活性在抗微生物活性檢測中應用以前發表方案的經修飾形式(Lehrer等人，(1991)Ultra sensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptidesJ Immunol Methods 137167-173)。將靶細菌(106個菌落形成單位(CFU))加入到10ml底層瓊脂糖(1％低電滲瓊脂糖，0.03％胰腖豆腖培養液，10mM磷酸鈉pH 7.4，37攝氏度)中。懸浮液在INTEGRID培養皿(BectonDickinson Labware)上固化。用3mm凝膠打孔器在底層瓊脂糖上打孔(Amersham Pharmacia Biotech，瑞典)。將樣品加入孔中並於37攝氏度孵育3小時。在上面鋪上一層瓊脂糖並將平板孵育過夜(LB培養基，7.5％瓊脂)。通過觀察孔周圍細菌清除區確定抗微生物活性。通過加入10ml 0.2mM MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物噻唑藍)對活細胞進行復染。
這個測定法顯示如通過NCCLS方案(上面段落)確定的相似活性譜及濃度。發現以下細菌種是敏感的(最低有效濃度(MEC)＜64μg/ml)枯草芽孢桿菌(ATCC6633)、希氏腸球菌(Enterococcus hirae)(ATCC10541)、藤黃微球菌(ATCC9341)、金黃色葡萄球菌(ATCC29737)、表皮葡萄球菌(DSM1798)、糞腸球菌(DSM2570)、產氣假單胞菌(ATCC27853)、支氣管敗血性博德特氏菌(ATCC4617)、大腸桿菌(ATCC10536)、肺炎克雷伯菌(ATCC10031)、豬霍亂沙門菌(DSM9220)及奇異變形桿菌(ATCC7002)。
實施例2抗微生物活性的評估如在國際專利申請WO 00/73433實施例1中公開的(有較小變更)，用阿拉伯糖作為誘導物，在大腸桿菌TOP10(Invitrogen)中表達一系列合成的抗微生物多肽。本發明的抗微生物多肽的表達使宿主細胞的生長受到抑制。
簡而言之，在微量滴定板中，將含有0.2％葡萄糖及氨苄青黴素(100μg/ml)的RM培養基中生長的新鮮過夜培養物稀釋300倍至含有0.2％甘油及氨苄青黴素(100μg/ml)以及不同濃度阿拉伯糖(0、0.01％或0.1％)的150微升RM的並於37攝氏度劇烈搖動下孵育。通過用Bioscreen C微生物讀出器(Thermo Electron Corporation)以30分鐘間隔測定OD450(關於緩衝劑及培養基組合物參見Invitrogen方案的pBAD/gIIIA、B及C載體目錄號V450-01)14小時對生長曲線進行監測。
通過每個樣品的終點OD測量值除以獲自含有對照載體的細胞的終點OD測量值並乘以100計算生長抑制百分率。公式如下
其中「空白OD」對應於空孔的OD。
Cat1的胺基酸序列及經選擇的改進合成變體在表4、5及6中列出。
表4
表5
表6
表4、5及6中顯示的結果令人信服地表明所有檢測的抗微生物多肽都顯示強抗微生物活性。
實施例3針對細菌菌株的抗微生物活性(MIC和MEC)用Mueller Hinton培養基(MHB)，使用微稀釋培養基測定(參見實施例1)分析本發明多肽的抗微生物活性。在這個方案中對四種不同細菌菌株進行檢測藤黃微球菌(ATCC 9341)、產氣假單胞菌(ATCC 27853)、大腸桿菌(ATCC 10536)及肺炎克雷伯菌(DSM681)。多肽的胺基酸序列及獲得的最低抑制濃度(MIC，微克/毫升)在以下表7中顯示。
表7
還用最低條件在輻射擴散測定法(參見實施例1)中分析本發明多肽的抗微生物活性。在這個方案中對兩種細菌菌株進行檢測；肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)及大腸桿菌Top10。多肽的胺基酸序列及獲得的最低有效濃度(MEC，微克/毫升)在以下表8顯示。
表8
序列表110諾和酶股份有限公司120抗微生物多肽13010328.204-WO16075170PatentIn版本3.1210121129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽220
221MISC_FEATURE222(2)..(2)223Xaa＝亮氨酸或精氨酸220
221MISC_FEATURE222(3)..(3)223Xaa＝亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸220
221MISC_FEATURE222(4)..(4)223Xaa＝精氨酸或賴氨酸220
221MISC_FEATURE222(6)..(6)223Xaa＝亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸
220
221MISC_FEATURE222(7)..(7)223Xaa＝精氨酸、色氨酸或甘氨酸220
221MISC_FEATURE222(8)..(8)223Xaa＝賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、天冬醯胺或穀氨酸220
221MISC_FEATURE222(11)..(11)223Xaa＝甘氨酸、賴氨酸、精氨酸或穀氨酸220
221MISC_FEATURE222(12)..(12)223Xaa＝賴氨酸、精氨酸、甘氨酸或穀氨酸220
221MISC_FEATURE222(14)..(14)223Xaa＝亮氨酸或苯丙氨酸220
221MISC_FEATURE222(15)..(15)223Xaa＝賴氨酸或精氨酸220
221MISC_FEATURE222(17)..(17)223Xaa＝亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或酪氨酸220
221MISC_FEATURE222(18)..(18)223Xaa＝甘氨酸、丙氨酸或蘇氨酸220
221MISC_FEATURE222(19)..(19)223Xaa＝穀氨醯胺、精氨酸、亮氨酸或脯氨酸220
221MISC_FEATURE222(20)..(20)223Xaa＝賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸220
221MISC_FEATURE222(23)..(23)223Xaa＝脯氨酸、丙氨酸、組氨酸、天冬醯胺或天冬氨酸220
221MISC_FEATURE222(24)..(24)223Xaa＝異亮氨酸或亮氨酸220
221MISC_FEATURE222(25)..(25)223Xaa＝精氨酸、組氨酸、穀氨醯胺或脯氨酸220
221MISC_FEATURE222(26)..(26)223Xaa＝異亮氨酸或賴氨酸4001Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Ile Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Lys
1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Pro20 25210221129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽220
221MISC_FEATURE222(2)..(2)223Xaa＝亮氨酸或精氨酸220
221MISC_FEATURE222(20)..(20)223Xaa＝賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸220
221MISC_FEATURE222(23)..(23)223Xaa＝脯氨酸、丙氨酸、組氨酸、天冬醯胺或天冬氨酸220
221MISC_FEATURE222(24)..(24)223Xaa＝異亮氨酸或亮氨酸220
221MISC_FEATURE222(25)..(25)223Xaa＝精氨酸、組氨酸、穀氨醯胺或脯氨酸
220
221MISC_FEATURE222(26)..(26)223Xaa＝異亮氨酸或賴氨酸220
221MISC_FEATURE222(3)..(3)223Xaa＝亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸220
221MISC_FEATURE222(4)..(4)223Xaa＝精氨酸或賴氨酸220
221MISC_FEATURE222(6)..(6)223Xaa＝亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或苯丙氨酸220
221MISC_FEATURE222(7)..(7)223Xaa＝精氨酸、色氨酸或甘氨酸220
221MISC_FEATURE222(8)..(8)223Xaa＝賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、天冬醯胺或穀氨酸220
221MISC_FEATURE222(11)..(11)223Xaa＝甘氨酸、賴氨酸、精氨酸或穀氨酸220
221MISC_FEATURE222(12)..(12)223Xaa＝賴氨酸、精氨酸、甘氨酸或穀氨酸220
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221MISC_FEATURE222(17)..(17)223Xaa＝異亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或酪氨酸220
221MISC_FEATURE222(19)..(19)223Xaa＝穀氨醯胺、亮氨酸或脯氨酸4002Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Ile Xaa Xaa Lys Xaa Lys Lys1 5 10 15Xaa Gly Xaa Xaa Ile Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Pro20 25210321129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽(Cat1)4003Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys
1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Pro Ile Arg Ile Leu Val Pro20 25210421129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽4004Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Gly Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Ala Ile Arg Lys Leu Val Pro20 25210521129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽4005Gly Leu Leu Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Gly Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly Gln Ile Ile Lys His Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252106
21129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽4006Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Arg Lys Ile Gly Gly Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Lys Ile Lys Pro Leu Arg Lys Leu Val Pro20 25210721129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽4007Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Lys Ile Lys His Ile Arg Ile Leu Val Pro20 25210821129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽4008
Gly Leu Leu Lys Arg Leu Gly Arg Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Lys Ile Lys Ala Ile Arg Lys Leu Val Pro20 25210921129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽4009Gly Arg Phe Lys Arg Phe Trp Lys Lys Ile Gly Arg Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Met Leu Lys Pro Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252101021129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40010Gly Leu Leu Lys Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Pro Lys Ile Lys His Ile Arg Lys Leu Val Pro20 25
2101121129212PRT213人工的220
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223合成的抗微生物肽40012Gly Arg Leu Arg Arg Leu Arg Arg Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Val IIe Lys Ala Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252101321129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽
40013Gly Leu Leu Arg Arg Leu Trp Arg Lys Ile Gly Arg Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly Gln Lys Ile Lys Ala Leu Arg Lys Leu Val Pro20 252101421129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40014Gly Arg Phe Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Leu Val Ile Lys His Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252101521129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40015Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Arg Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Lys Ile Lys His Ile Arg Ile Leu Val Pro
20 252101621129212PRT213人工的220
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220
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223合成的抗微生物肽40020Gly Leu Phe Arg Arg Phe Arg Arg Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15
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213人工的220
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1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Pro Ile Arg Lys Leu Val Pro20 252102621129212PRT213人工的220
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223合成的抗微生物肽40027Gly Arg Leu Arg Arg Leu Arg Arg Lys Ile Arg Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly Gln Lys IIe Lys Ala Ile Arg Lys Leu Val Pro20 2521028
21129212PRT213人工的220
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223合成的抗微生物肽40029Gly Arg Phe Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Met Ile Lys Ala Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252103021129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40030
Gly Arg Leu Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Met Ile Lys His Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252103121129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40031Gly Leu Val Arg Arg Phe Arg Arg Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Ile Ile Lys Ala Ile Arg Lys Leu Val Pro20 252103221129212PRT213人工的220
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2103321129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40033Gly Leu Phe Arg Arg Leu Arg Gly Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Ala Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252103421129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40034Gly Leu Phe Arg Arg Leu Gly Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Val Ile Lys His Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252103521129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽
40035Gly Leu Leu Arg Arg Leu Gly Lys Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Val Ile Lys Ala Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252103621129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40036Gly Leu Phe Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Val Ile Lys His Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252103721129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40037Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Glu Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly Pro Lys Ile Lys Ala Leu Arg Lys Leu Val Pro
20 252103821129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40038Gly Arg Ile Lys Arg Val Gly Glu Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Val Ile Lys His Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252103921129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40039Gly Leu Phe Arg Arg Phe Gly Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Val Ile Lys Ala Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252104021129212PRT213人工的
220
223合成的抗微生物肽40040Gly Arg Leu Arg Arg Phe Gly Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Leu Ile Lys Ala Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252104121129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40041Gly Leu Leu Arg Arg Phe Trp Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Lys Ile Lys Pro Leu Pro Lys Leu Val Pro20 252104221129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40042Gly Arg Phe Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys1 5 10 15
Phe Gly Gln Val Ile Lys Ala Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252104321129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40043Gly Leu Phe Arg Arg Phe Gly Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Pro Ile His Lys Leu Val Pro20 252104421129212PRT213人工的220
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223合成的抗微生物肽40045Gly Leu Leu Arg Arg Phe Arg Glu Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly Gln Lys Ile Lys His Leu Arg Lys Leu Val Pro20 252104621129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40046Gly Leu Phe Arg Arg Leu Arg Arg Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Lys Ile Lys Pro Leu Arg Lys Leu Val Pro20 252104721129212PRT213人工的220
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223合成的抗微生物肽40050Gly Leu Leu Arg Arg Phe Arg Asn Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Pro Ile Arg Lys Leu Val Pro20 252105121129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40051Gly Arg Phe Lys Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asp Ile Arg Lys Leu Val Pro20 252105221129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40052
Gly Leu Phe Arg Arg Ile Arg Arg Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Val Ile Lys Pro Leu Arg Lys Leu Val Pro20 252105321129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40053Gly Arg Leu Arg Arg Leu Gly Lys Lys Ile Gly Glu Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Met Ile Lys His Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252105421129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40054Gly Leu Leu Arg Arg Leu Gly Lys Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Cys Gly Gln Val Ile Lys Ala Ile Arg Ile Leu Val Pro20 25
2105521129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40055Gly Leu Leu Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Glu Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Phe Gly Gln Lys Ile Lys Asn Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252105621129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40056Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Pro Ile Arg Lys Leu Val Pro20 252105721129212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽
40057Gly Leu Leu Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Tyr Gly Gln Lys Ile Lys His Leu Arg Ile Leu Val Pro20 252105821119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽220
221MISC_FEATURE222(2)..(2)223Xaa＝亮氨酸或精氨酸220
221MISC_FEATURE222(3)..(3)223Xaa＝亮氨酸或苯丙氨酸220
221MISC_FEATURE222(4)..(4)223Xaa＝精氨酸或賴氨酸220
221MISC_FEATURE222(6)..(6)223Xaa＝亮氨酸或苯丙氨酸220
22lMISC_FEATURE222(7)..(7)223Xaa＝精氨酸、賴氨酸或甘氨酸220
221MISC_FEATURE222(8)..(8)223Xaa＝精氨酸、賴氨酸或穀氨酸220
221MISC_FEATURE222(11)..(11)223Xaa＝甘氨酸或賴氨酸220
221MISC_FEATURE222(12)..(12)223Xaa＝賴氨酸、精氨酸或穀氨酸220
221MISC_FEATURE222(14)..(14)223Xaa＝亮氨酸或苯丙氨酸220
221MISC_FEATURE222(18)..(18)223Xaa＝丙氨酸或蘇氨酸220
22lMISC_FEATURE222(15)..(15)223Xaa＝賴氨酸或精氨酸220
22lMISC_FEATURE222(17)..(17)
223Xaa＝異亮氨酸或亮氨酸40058Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Ile Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Lys1 5 10 15Xaa Xaa Arg2105921119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40059Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Ala Arg2106021119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40060Gly Leu Phe Arg Arg Leu Lys Arg Lys Ile Gly Arg Lys Phe Lys Lys1 5 10 15
Ile Ala Arg2106121119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40061Gly Leu Leu Lys Arg Leu Gly Arg Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Ile Ala Arg2106221119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40062Gly Leu Leu Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Ala Arg2106321119212PRT
213人工的220
223合成的抗微生物肽40063Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Thr Arg2106421119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40064Gly Leu Phe Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Ala Arg2106521119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40065Gly Leu Phe Arg Arg Leu Lys Arg Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys
1 5 10 15Ile Ala Arg2106621119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40066Gly Leu Leu Lys Arg Leu Gly Arg Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Ala Arg2106721119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40067Gly Leu Leu Arg Arg Phe Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Thr Arg21068
21119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40068Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Arg Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Ile Ala Arg2106921119212PRT213人工的220
223合成的抗微生物肽40069Gly Leu Phe Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Phe Lys Lys1 5 10 15Ile Ala Arg2107021190212DNA213人工的220
223合成的Cat1基因220
221CDS222(1)..(90)223
40070ggc ctg ctg cgc cgt ctg cgc aag aag att ggc aaa aag ctg aag aaa48Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15att ggc cag aag att aaa ccg att cgc att ctg gtg ccg tag90Ile Gly Gln Lys Ile Lys Pro Ile Arg Ile Leu Val Pro20 252107121129212PRT213人工的220
223合成的Cat1基因40071Gly Leu Leu Arg Arg Leu Arg Lys Lys Ile Gly Lys Lys Leu Lys Lys1 5 10 15Ile Gly Gln Lys Ile Lys Pro Ile Arg Ile Leu Val Pro20 2521072211129212DNA213人工的220
223引物1序列40072attattcaga tgctggatcc ggcggaaggc ctgctgcgcc gtctgcgcaa gaagattggc 60aaaaagctga agaaaattgg ccagaagatt aaaccgattc gcattctggt gccgtagctc120
gagattatt12921073211129212DNA213人工的220
223引物2序列40073aataatctcg agctacggca ccagaatgcg aatcggttta atcttctggc caattttctt 60cagctttttg ccaatcttct tgcgcagacg gcgcagcagg ccttccgccg gatccagcat120ctgaataat1292107421120212DNA213人工的220
223引物3序列40074tgctagttat tgctcagcgg 202107521119212DNA213人工的220
223引物4序列40075accgtagttg cgcccatcg 19
權利要求
1.具有抗微生物活性的多肽，其包含在SEQ ID NO1中列出的胺基酸序列，或其具有抗微生物活性的至少19個胺基酸的片段，所述SEQ ID NO1為G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X1＝L或R； X2＝L、V、I或F； X3＝R或K；X4＝L、V、I或F； X5＝R、K、W或G； X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E； X8＝G、R、K或E； X9＝L或F；X10＝K或R； X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；X13＝Q、R、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L； X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；並且其中組成所述多肽的胺基酸獨立地選自D型或L型。
2.具有抗微生物活性的多肽，其包含與以下胺基酸序列至多有兩個胺基酸不同的胺基酸序列G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-Z；其中X1＝L或R； X2＝L、V、I或F；X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、K、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E；X9＝L或F；X10＝K或R； X11＝I、L、F、C或Y；X12＝G、A或T；Z＝R或X13-X14-I-K-X15-X16-X17-X18-L-V-P；其中X13＝Q、L或P；X14＝K、I、M、L或V；X15＝P、A、H、N或D；X16＝I或L；X17＝R、H、Q或P；X18＝I或K；並且其中組成所述多肽的胺基酸獨立地選自D型或L型。
3.權利要求2的多肽，其包含與SEQ ID NO58中列出的胺基酸序列至多有兩個胺基酸不同的胺基酸序列，所述SEQ ID NO58為G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-X10-K-X11-X12-R；其中X1為L或R； X2為L或F； X3為R或K；X4為L或F； X5為R、K或G；X6為K、R或E；X7為G或K； X8為K、R或E；X9為L或F；X10為K或R；X11為I或L； X12為A或T。
4.權利要求2的多肽，其包含與SEQ ID NO2列出的胺基酸序列至多有兩個胺基酸不同的胺基酸序列，所述SEQ ID NO2為G-X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-K-I-X7-X8-K-X9-K-K-X10-G-X11-X12-I-K-X13-X14-X15-X16-L-V-P；其中X1＝L或R； X2＝L、V、I或F； X3＝R或K；X4＝L、V、I或F；X5＝R、W或G；X6＝K、R、G、M、N或E；X7＝G、R、K或E；X8＝G、R、K或E； X9＝L或F；X10＝I、F、C或Y； X11＝Q、L或P； X12＝K、I、M、L或V；X13＝P、A、H、N或D；X14＝I或L； X15＝R、H、Q或P；X16＝I或K。
5.權利要求2的多肽，其與SEQ ID NO1的1至29位胺基酸、SEQ IDNO2的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58的1至19位胺基酸相比包含至多兩個胺基酸替代、缺失和/或插入。
6.權利要求2的多肽，其包含SEQ ID NO1的1至29位胺基酸、SEQID NO2的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58的1至19位胺基酸。
7.權利要求2的多肽，其由SEQ ID NO1的1至29位胺基酸、SEQ IDNO2的1至29位胺基酸或SEQ ID NO58的1至19位胺基酸組成。
8.多核苷酸，其具有編碼權利要求1-7中任意一項定義的多肽的核苷酸序列。
9.核酸構建體，其包含權利要求8中定義的核苷酸序列，所述核苷酸序列與在適宜宿主中指導所述多肽產生的一種或多種控制序列有效連接。
10.重組表達載體，其包含權利要求9中定義的核酸構建體。
11.重組宿主細胞，其包含權利要求9中定義的核酸構建體。
12.用於產生如權利要求1-7中任意一項定義的多肽的方法，所述方法包括(a)在有益於產生所述多肽的條件下，培養如權利要求10中定義的重組宿主細胞；和(b)回收所述多肽。
13.組合物，其包含如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽。
14.權利要求13的組合物，其還包含額外的殺生物劑。
15.殺滅微生物細胞或抑制微生物細胞生長的方法，其包括將所述微生物細胞與如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽接觸。
16.洗滌劑組合物，其包含如權利要求1-7中任意一項定義的表面活性劑和抗微生物多肽。
17.如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽，其用作藥物。
18.如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽，其用作獸醫用的或者用於人的抗微生物治療或預防劑。
19.如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽的用途，其用於製備獸醫用或者用於人的治療劑，所述治療劑用於治療微生物感染或用於預防用途。
20.如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽的用途，用於殺滅微生物細胞或抑制微生物細胞生長。
21.轉基因植物、植物部分或植物細胞，其已經用編碼如權利要求1-7中任意一項定義的具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序列轉化。
22.如權利要求1-7中任意一項定義的至少一種抗微生物多肽的用途，用於動物飼料中。
23.如權利要求1-7中任意一項定義的至少一種抗微生物多肽的用途，用於製備用於動物飼料中的組合物。
24.動物飼料添加劑，其包含(a)至少一種如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種微量礦物質，和/或(e)至少一種大量礦物質。
25.權利要求24的動物飼料添加劑，其還包含植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。
26.動物飼料組合物，其具有50至800g/kg的粗蛋白質含量並且包含至少一種如權利要求1-7中任意一項定義的抗微生物多肽。
全文摘要
本發明涉及具有抗微生物活性的多肽及具有編碼所述多肽的核苷酸序列的多核苷酸。本發明還涉及核酸構建體、載體及包含所述核酸構建體的宿主細胞以及產生和使用所述多肽的方法。
文檔編號A01H5/00GK1816561SQ200480019203
公開日2006年8月9日 申請日期2004年6月10日 優先權日2003年6月11日
發明者D·R·塞古拉, P·H·米京德, H-H·K·赫根豪格, A·託西 申請人:諾和酶股份有限公司