一種酵母工程菌發酵方法和應用的製作方法

2023-08-05 22:02:16

專利名稱：一種酵母工程菌發酵方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，尤其涉及一種酵母工程菌發酵方法和應用。
背景技術：
近年來，抗生素濫用各種弊端逐漸顯現，抗菌肽(特別是美洲商陸抗菌肽)和抗生素具有相似的功用，其殺菌機理獨特，抗菌譜範圍廣泛，對抗生素耐藥菌、腫瘤細胞及病毒等均有良好的殺傷作用，且其本身毒副作用極低。但是，目前以發酵方法生產抗菌肽的產量不高，如《Novel Expression Vector for Secretion of Cecropin AD in Bacillus subtilis with Enhanced Antimicrobial Activity》一文中獲得的抗菌肽含量為 30. 6mg/ L，《複合抗菌肽PL在畢赤酵母中的分泌表達及其活性研究》一文中兩種抗菌肽的含量分別為95. 04mg/L和91mg/L，造成發酵生產抗菌肽成本相對較高，因此目前國內外開發的發酵法生產抗菌肽的工藝多停留在實驗室階段，無法進行工業化生產，本發明正是針對這一問題，以美洲商陸酵母工程菌為生產菌株，通過對發酵培養基優化，對接種量、通氣量、PH以及發酵過程其它參數進行修正改進，使得抗菌肽產量大幅度提升，為實現抗菌肽的大規模生產開闢可行的路徑。

發明內容
有鑑於此，本發明實施例的目的在於提供一種產量高的酵母工程菌發酵方法。本發明是這樣實現的，一種酵母工程菌發酵方法，包括如下步驟配製包括如下組分的液體培養基；將菌種種齡為2. 5-3. 5億個/mL的美洲商陸酵母工程菌按接種量為2. 5-7.0% (ν/ν)接種於該液體培養基，在ρΗ為3. 5-4. 5、通氣量為0. 4-1. Ovvm、溫度為條件下，發酵培養22-26小時，該培養基組分如下葡萄糖40_60g/L黃豆粉10-16. 8g/L玉米漿6-10g/L硫酸銨9_15g/L棉籽粉4_7.2g/L無水碳酸鈣0.1-0. 3g/L磷酸二氫鉀0.5_0.94g/L硫酸鋅0.08-0.2g/L無水硫酸鎂 0. 5-lg/L。本發明實施例進一步提供上述酵母工程菌發酵方法所製備的抗菌肽在藥品、消毒產品中的應用。
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本發明實施例酵母工程菌發酵方法，通過採用上述發酵培養基成分及含量、發酵 PH值、通氣量等參數，實現了發酵產物(美洲商陸抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05)發酵產量顯著提升。


圖1是本發明實施例發酵方法發酵過程中抗菌肽濃度、葡萄糖濃度及酵母工程菌數量變化圖。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。本發明實施例提供一種酵母工程菌發酵方法，包括如下步驟SOl，配製包括如下組分的液體培養基；S02,將菌種種齡為2. 5-3. 5億個/mL的美洲商陸酵母工程菌按接種量為 2. 5-7.0% (ν/ν)接種於該液體培養基，在ρΗ為3. 5-4. 5、通氣量為0.4-1. Ovvm、溫度為
條件下，發酵培養22-26小時，該培養基組分如下
葡萄糖40-60g/L
黃豆粉10-16. 8g/L
玉米漿6-10g/L
硫酸銨9-15g/L
棉籽粉4-7. 2g/L
無水碳5睃鈣0. l-o. 3g/L
磷酸二氫鉀0. 5-0. 94g/L
硫酸鋅0. 08-0. 2g/L
無水硫5睃鎂0. 5-lg/Lo
具體地，該美洲商陸酵母工程菌是指包含有美洲商陸抗菌肽基因序列Ι^-ΑΜΡ05
的酵母工程菌，具體是指申請號201010278464. O的專利中的酵母工程菌。該專利文件中， 關於酵母工程菌的表述為一種酵母工程菌，該酵母工程菌包含由酵母穿梭質粒和美洲商陸抗菌肽I^-AMP05 基因重組構成的重組質粒，美洲商陸抗菌肽 ^_ΑΜΡ05基因序列如SEQ ID NO=I所示。本發明實施例的酵母工程菌中，重組質粒由酵母穿梭質粒和美洲商陸抗菌肽 Pa-AMP05基因重組而成，該重組質粒在酵母細胞基因組之外，游離於酵母細胞質之中。酵母穿梭質粒是美洲商陸抗菌肽 ^_ΑΜΡ05基因的表達載體。將酵母工程菌擴大培養，其基因組得到表達，同時本發明實施例的酵母工程菌中的重組質粒也得到表達。本發明實施例中的酵母，包括各種酵母，例如畢赤酵母、釀酒酵母，優選的為釀酒酵母，其中釀酒酵母，包括但不限於酒精酵母、漢遜酵母、假絲酵母等，優選的為釀酒酵母 S78。釀酒酵母含有符合機體需求的優質蛋白、膳食纖維、複合維生素B和有機鉻、鋅、硒、 鐵、鈣等元素，其本身即是一種純天然、無汙染、生物態的健康營養源。釀酒酵母是食品級的表達系統，其表達產物安全無毒，使得本發明實施例的酵母工程菌的表達產物中不會摻雜有害物質。同時酵母遺傳背景清楚，適用於工業化生產。本發明實施例對酵母穿梭質粒沒有具體的限制，可以為各種酵母穿梭質粒，只要能夠在酵母細胞中作為表達載體即可，包括含有誘導型啟動子的酵母穿梭質粒，還包括含有非誘導型啟動子的酵母穿梭質粒，這些酵母穿梭質粒都能夠作為美洲商陸抗菌肽 Pa-AMP05基因的表達載體，使得美洲商陸抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05基因在釀酒酵母中能夠得到表達。誘導型啟動子，在基因表達中，需要加入誘導劑才能啟動基因的表達，非誘導型的啟動子即在基因表達中不需要加入誘導劑，基因也能夠得到表達。例如酵母穿梭質粒PYES2，以半乳糖為誘導劑；酵母穿梭質粒PYES6/CT，也以半乳糖為誘導劑以及酵母穿梭質粒ρ (212 等。非誘導型啟動子優選的為酵母穿梭質粒pVT102U/ci。酵母穿梭質粒pVT102U/a含有非誘導型啟動子，使得上述重組質粒在表達過程中，不需要加入任何的誘導劑，避免了表達產物中混入誘導劑雜質，例如甲醇，保證了表達產物的安全。本酵母穿梭質粒pVT102U/a 是分泌型表達載體，通過α因子的信號肽的作用，能夠將表達產物分泌到酵母細胞外，也簡化了表達產物分離提純的過程，節約成本。另外，請參見圖2，圖2顯示以酵母穿梭質粒pVT102U/ci作為美洲商陸抗菌肽 Pa-AMP05基因的表達載體時，重組質粒所具有的表達框 ADHl-α -MFL-抗菌肽 Pa-AMP05_TT其中ADHl為啟動子，α -MFL為α因子信號肽的鹼基序列，TT是終止子，抗菌肽 Ι^-ΑΜΡ05是指美洲商陸抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05的鹼基序列，具體見於SEQ ID Ν0:1。美洲商陸抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05基因表達的抗菌肽蛋白Ι^-ΑΜΡ05的N端區域與α因子的信號肽融合，信號肽引導著整個融合蛋白分泌到酵母細胞外的培養基中；α因子的信號肽帶有前體加工酶 Kex2的酶切位點，融合蛋白在酵母本身分泌的Kex2的作用下切掉信號肽而直接得到具有天然構象和生物活性的目標抗菌肽Ι^-ΑΜΡ05蛋白。SEQ ID NO 1gctggttgtattaaaaatggtggtagatgtgttgcttctggtggtccaccatattgttgttctaattat
tgttBtBgBCBBgttggttgggCtCBtBgBtattgtBBBBBtBgBtBB。具體地，步驟SOl中，該液體培養基的組分如下葡萄糖40_60g/L，黃豆餅粉 10-16. 8g/L，玉米漿6-10g/L，硫酸銨9_15g/L，棉籽餅粉4-7. 2g/L，無水碳酸鈣0. 1-0. 3g/ L,磷酸二氫鉀0. 5-0. 94g/L，硫酸鋅0. 08-0. 2g/L，無水硫酸鎂0. 5-lg/L ；該液體培養基的溶劑為純淨水。該液體培養基通過選擇上述組分和含量，滿足了菌體生長的需要，使得在發酵結束時釀酒酵母工程菌菌數達到較高的水平，實現了發酵產物濃度顯著提高。配製該液體培養基的方法沒有限制，得到液體培養基後，進行121°C滅菌30min再冷卻至即可以使用。配製液體培養基的器具沒有限制。具體地，步驟S02中，酵母工程菌的菌種種齡為2. 5-3. 5億個/mL，其培養過程為從YPD斜面上挑取一環酵母工程菌，接入60mL的YPD液體培養基，在溫度為32°C， 轉速為200rpm條件下搖床培養16_18h ；再於25L培養器中置入14-16L YPD液體培養基， 121°C滅菌30min冷卻至32°C後，接入前述培養好的酵母工程菌，培養16_1他，即可得到菌種種齡為2. 5-3. 5億個/mL的酵母工程菌，培養過程中不控pH，通氣量為0. 6vvm(每分鐘內，通入氣體的體積和發酵罐中發酵液體積比)，攪拌轉速為150rpm，罐壓0. 05Mpa，溫度為32 °C。具體地，步驟S02為按接種量為2. 5-7. 0% (v/v)(種子液體積和發酵罐中液體培養基體積比)將上述菌種種齡的酵母工程菌接種於上述液體培養基，進行發酵2216小時， 具體發酵的參數為ρΗ為3. 5-4. 5、通氣量為0. 4-1. Ovvm、溫度為^_34°C。本步驟中，使用鹼性劑調節發酵過程中的PH值，該鹼性劑沒有限制，例如，氫氧化鈉、氨水等。具體地，步驟S02中，使用的發酵設備沒有限制，優選為500L以上的發酵罐，該發酵罐的裝料係數為0. 5-0. 75，可以將步驟SOl中配製的液體培養基加入至該發酵罐中，再接種上述菌種種齡的酵母工程菌進行發酵，也可以在步驟SOl中直接使用該發酵罐，再接種上述菌種種齡的酵母工程菌進行發酵。本發明實施例發酵方法，通過選擇上述菌種種齡和接種量，使得酵母工程菌生長和發酵產物生成速率顯著提高，延遲期縮短，在發酵得到美洲商陸抗菌肽 ^_ΑΜΡ05的前提下，有效縮短了發酵周期；通過對發酵培養基的優化和發酵過程中PH值控制為3. 5-4. 5，使得發酵產物(美洲商陸抗菌肽 ^-ΑΜΡΟΟ的濃度顯著增加，大大提升了發酵產物的產量；酵母工程菌發酵過程中，通氣量控制在0. 4-1. Ovvm,進一步，酵母工程菌發酵過程中，攪拌轉速為100-250rpm，罐壓0. 03-0. OSMpa,通過控制上述發酵參數，使得發酵過程中液體培養基內的溶氧量既能夠滿足酵母工程菌生長需要，又有利於發酵產物產量的顯著提升，大大降低了能耗。通過上述改進，本發明實施例酵母工程菌發酵方法發酵生產抗菌肽的效率大大提高，發酵後混合液中抗菌肽的濃度達到42;3mg/L，而普通的發酵方法所得到的濃度大概為41mg/L ；葡萄糖利用率顯著提升，發酵結束時發酵液中殘餘葡萄糖為1. 5 2. 5g/L，衡算葡萄糖利用率達到95%以上。請參閱圖1，圖1是本發明實施例發酵方法發酵過程中抗菌肽濃度、葡萄糖濃度及酵母工程菌數量(連續10批平均值)變化圖。根據圖1可知，發酵結束後，菌體濃度較高， 抗菌肽濃度在410mg/L以上，發酵產量比普通的發酵方法大大提高，葡萄糖利用率顯著提升。本發明實施例進一步提供上述酵母工程菌發酵方法所製備的抗菌肽在藥品、消毒產品中的應用。以下結合具體實施例對上述發酵方法進行詳細闡述。實施例一本發明實施例酵母工程菌發酵方法，包括如下步驟1、從YPD斜面上挑取一環酵母工程菌，接入60mL的YPD液體培養基，於溫度為 32°C，轉速為200rpm條件下，搖床培養16h ；2、於25L發酵罐中置入14L YPD液體培養基，121°C滅菌30min冷卻至後，接入步驟1中培養好的酵母菌培養16h，培養過程中，通氣量為0. 6vvm，攪拌轉速為150rpm，罐壓0. 05Mpa,培養過程溫度為32°C ；3、於500L發酵罐中配製360L成分如下的發酵培養基葡萄糖40g/L，黃豆餅粉 10g/L,玉米漿6g/L，硫酸銨9g/L，棉籽餅粉4g/L，無水碳酸鈣0. lg/L，磷酸二氫鉀0. 5g/ L，硫酸鋅0. 08g/L，無水硫酸鎂0. 5g/L，經過121°C滅菌30min冷卻至32°C後，按接種量為 2.5% (ν/ν)接入步驟2中培養好的酵母菌，發酵22h。發酵過程中通氣量為0.4vvm，攪拌轉速為lOOrpm，罐壓0. 03Mpa，溫度為^°C，以4mol/L的NaOH溶液和50%的磷酸溶液調節本步驟發酵過程中發酵液的PH為3. 5。發酵結束時，發酵液中美洲商陸抗菌肽濃度達到 320mg/L。實施例二1、從YPD斜面上挑取一環酵母菌，接入60mL的YPD液體培養基，於溫度為32°C，轉速為200rpm條件下，搖床培養17h ；2、於25L發酵罐中置入15L YPD液體培養基，121°C滅菌30min冷卻至32°C後，接入步驟1中培養好的酵母菌，培養17h，此過程中通氣量為0. 6vvm,攪拌轉速為150rpm，罐壓 0. 05Mpa，溫度為 320C ；3、於500L發酵罐中配製360L成分如下的發酵培養基葡萄糖60g/L，黃豆餅粉12. 8g/L，玉米漿8g/L，硫酸銨12g/L，棉籽餅粉6g/L，無水碳酸鈣0. 2g/L，磷酸二氫鉀 0. 75g/L，硫酸鋅0. 15g/L，無水硫酸鎂0. 7g/L，經過121°C滅菌30min冷卻至32°C後，接入步驟2中培養好的酵母菌，發酵Mh。發酵過程中通氣量為0. 6vvm，攪拌轉速為150rpm，罐壓0. 05Mpa溫度為32°C，以4mol/L的NaOH和50%的磷酸溶液控制發酵液的pH為4. 0。發酵結束時，發酵液中美洲商陸抗菌肽濃度達到42;3mg/L。實施例三1、從YPD斜面上挑取一環酵母菌，接入60mL的YPD液體培養基，在溫度為32°C，轉速為200rpm，搖床培養18h。2、於25L發酵罐中置入16L YPD液體培養基，121°C滅菌30min冷卻至32°C後，接入步驟1中培養好的酵母菌，培養18h，培養過程中，通氣量為0. 6vvm，攪拌轉速為150rpm， 罐壓0. 05Mpa，溫度為320C ο3、於500L發酵罐中配製360L成分如下的發酵培養基葡萄糖50g/L，黃豆餅粉 16. 8g/L，玉米漿10g/L，硫酸銨15g/L，棉籽餅粉7. 2g/L，無水碳酸鈣0. 3g/L，磷酸二氫鉀 0. 94g/L，硫酸鋅0. 2g/L，無水硫酸鎂lg/L，經過121°C滅菌30min冷卻至32°C後，接入步驟2中培養好的酵母菌，發酵^h，發酵過程中通氣量為1. Ovvm,攪拌轉速為250rpm，罐壓 0. 08Mpa，溫度為34°C，以4mol/L的NaOH和50%的磷酸溶液控制發酵液的pH為4. 5。發酵結束時，發酵液中美洲商陸抗菌肽濃度達到360mg/L。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種酵母工程菌發酵方法，包括如下步驟 配製包括如下組分的液體培養基；將菌種種齡為2. 5-3. 5億個/mL的美洲商陸酵母工程菌按接種量為2. 5-7. 0% (ν/ν) 接種於所述液體培養基，在PH為3. 5-4. 5、通氣量為0. 4-1. Ovvm、溫度為條件下，發酵培養22-26小時，所述培養基組分如下 葡萄糖40-60g/L黃豆粉10-16.8g/L玉米漿6-10g/L硫酸銨9-15g/L棉籽粉4-7. 2g/L無水碳酸鈣 0. 1-0. 3g/L 磷酸二氫鉀 0. 5-0. 94g/L 硫酸鋅0. 08-0. 2g/L無水硫酸鎂 0. 5-lg/L。
2.如權利要求1所述的酵母工程菌發酵方法，其特徵在於，所述液體培養基的組分如下葡萄糖60g/L黃豆餅粉 12. 8g/L 玉米漿8g/L硫酸銨12g/L棉籽餅粉 6g/L 無水碳酸鈣 0. 2g/L 磷酸二氫鉀 0. 75g/L 硫酸鋅0. 15g/L無水硫酸鎂 0. 7g/0
3.如權利要求1所述的酵母工程菌發酵方法，其特徵在於，所述發酵培養步驟中使用發酵罐作為容器，所述發酵罐的裝料係數為0. 5-0. 75。
4.如權利要求1所述的酵母工程菌發酵方法，其特徵在於，所述發酵培養在攪拌轉速為100-250rpm條件下進行。
5.如權利要求1所述的酵母工程菌發酵方法，其特徵在於，所述發酵培養在壓強為 0. 03-0. 08Mpa條件下進行。
6.如權利要求1-5任一項所述發酵方法所製備的抗菌肽在藥品、消毒產品中的應用。
全文摘要
本發明適用於生物工程技術領域，提供了一種酵母工程菌發酵方法，包括如下步驟配製液體培養基；將菌種種齡為2.5-3.5億個/mL的美洲商陸酵母工程菌按接種量為2.5-7.0％(v/v)接種於所述液體培養基，在pH為3.5-4.5、通氣量為0.4-1.0vvm、溫度為28-34℃條件下，發酵培養22-26小時。本發明酵母工程菌發酵方法，通過對發酵培養基優化，對接種量、通氣量、pH以及發酵過程其它參數進行修正改進，實現了發酵產物(美洲商陸抗菌肽Pa-AMP05)發酵產量顯著提升。
文檔編號C12R1/865GK102174623SQ20111002063
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月18日 優先權日2011年1月18日
發明者張捷, 彭永鶴, 董清風, 鄭文官 申請人:深圳市聖西馬生物技術有限公司