螢光假單胞菌突變菌株的篩選方法及其在生物防治中的應用與流程
2023-08-05 06:10:06
本發明涉及一種螢光假單胞菌突變菌株，具體涉及一種螢光假單胞菌突變菌株的篩選方法及其在生物防治中的應用。本發明屬於生物技術領域。
背景技術：
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegens)屬革蘭氏陰性杆狀細菌，常見於植物根圍和土壤中，是作為植物根際促生細菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,pgpr)中研究較多的一種細菌，由於其繁殖速度快、適應能力強、易於人工培養、製劑穩定、施用方便、不汙染環境、防治多種植物病害等優點，我國農業部已將其列為可註冊登記的微生物農藥和肥料品種之一，在全國範圍內推廣使用。由於其能產生一種或多種抗生素，如2，4-二乙醯基藤黃酚(2,4-diacetylphloroglu-cinol,2,4-dapg)、藤黃綠膿菌素(pyoluteorin,plt)、吩嗪(phenazine)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin,prn)、apra蛋白酶和氫氰酸(hcn)等，所以對植物病害，尤其是土傳病害如猝倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，是一類重要的有益微生物資源，在農業生產上具有非常重要的意義。但是，螢光假單胞菌本身並不具有生物固氮的功能。
固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)是一株分離自德國高粱根際土壤的聯合固氮菌，已被保藏在德意志微生物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh)且分配有保藏號dsm4166。該菌在無氨和微好氧條件下可將空氣中的氮氣轉化為植物可以直接利用的銨。目前該菌株的基因組測序工作已經完成，在基因組序列中發現了一段69kb大小的nif固氮基因島，包含有58個不同的基因。然而基因組測序結果表明該細菌的次級代謝產物不豐富，抑菌能力較弱。
red/et同源重組和直接克隆技術是一種基於噬菌體重組酶的新型遺傳工程技術，它的基本原理是通過噬菌體重組酶介導大腸桿菌體內的同源重組，從而對dna序列進行修飾的重組技術。該技術不受dna分子大小和酶切位點的限制，能夠精確、高效地對基因簇進行基因插入、基因敲除、點突變和模塊替換等操作，只需用30-50bp大小的同源臂就能獲得較高的重組效率。直接克隆技術則是利用recet重組酶將天然產物基因簇直接從微生物基因組一步克隆到大腸桿菌表達載體上，只需3天就能完成整個基因簇的克隆，而且重組步驟在大腸桿菌細胞內發生，可以避免基因簇在克隆過程中發生突變。目前，該技術已經廣泛應用於微生物天然產物基因簇的克隆和異源表達研究。
技術實現要素：
本發明的目的是為克服上述現有技術的不足，提供螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif、pf5-△rets或pf5-△rets-nif。
本發明還提供上述菌株的篩選方法及其在生物防治中的應用。
為實現上述目的，本發明採用下述技術方案：
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif、pf5-△rets或pf5-△rets-nif，其保藏編號分別為cgmccno.13948、cgmccno.13949和cgmccno.13950(保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期：2017年3月28日)。
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif在促進植物生長、殺菌和固氮方面的應用。
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets在促進植物生長和殺菌方面的應用。
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets-nif在促進植物生長、殺菌和固氮方面的應用。
一種微生物菌劑，其有效成分為pf5-nif。
一種微生物菌劑，其有效成分為pf5-△rets。
一種微生物菌劑，其有效成分為pf5-△rets-nif。
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-nif的篩選方法，將固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)基因組中的nif固氮基因島整體克隆到螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組中，使之順利異源表達，得到基因工程菌株pf5-nif。
作為優選的技術方案之一，具體步驟如下：
(1)利用red/et直接克隆的方法，先使用限制性內切酶aflii和sspi對固氮斯氏假單胞菌dsm4166的基因組dna進行酶切，得到69kb大小nif固氮基因島，連接到相應的載體上構建質粒，利用如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物構建質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif，通過限制性內切酶kpni進行酶切鑑定，然後將結果正確的質粒電轉入到大腸桿菌et12567中；
(2)通過接合轉移把來自大腸桿菌et12567中的質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導入螢光假單胞菌pf5中，然後通過轉座的方式nif基因隨機插入到pf5的基因組dna中；
(3)將菌落pcr驗證後正確的轉化子pf5-nif送去測序，結果正確的分裝凍存。
作為進一步優選的技術方案之一，步驟(2)的具體方法是：挑取單菌落，將螢光假單胞菌pf5(lb培養基(胰蛋白腖10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉5g/l，調節ph至7.0)，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml+cm10μg/ml+km1μg/ml培養基，37℃)分別過夜培養；將兩種過夜的菌液7000rpm，離心1分鐘，用新鮮的lb培養基分別將螢光假單胞菌pf5和大腸桿菌et12567洗滌兩遍後，用300μllb培養基重懸，分別各取50μl懸浮液，混勻，小範圍塗在lb平板中間，晾乾，在37℃條件下孵育4h後，然後將平板在30℃的培養箱倒置培養過夜；用接種環將平板上的菌刮下來，用ml無菌水懸浮混勻，取100μl菌液z字形劃線塗布於pmm(磷酸氫二鉀8g/l，磷酸二氫鉀5g/l，硫酸銨1g/l，琥珀酸鈉6.6g/l，調節ph至7.0，滅菌後加入1m硫酸鎂1.2ml/l)+genta25μg/ml+amp100μg/ml固體培養基上，30℃倒置培養2天，直至單菌落出現；挑單菌落接種於1mllb+genta25μg/ml+amp100μg/ml過夜培養，之後用seqidno.5～seqidno.14所示的5對引物進行菌落pcr驗證。
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets的篩選方法，通過基因定向無痕敲除螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組中的rets基因，得到基因工程菌株pf5-△rets。
作為優選的技術方案之一，具體步驟如下：
(1)把質粒pbbr1-rha-tegpsy-kan通過電轉的方式導入到野生型的螢光假單胞菌pf5中，篩選到正確的轉化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan；
(2)敲除螢光假單胞菌pf5基因組上的rets基因；
(3)將pcr驗證和測序後正確的轉化子pf5-△rets分裝凍存。
作為進一步優選的技術方案之一，步驟(1)的具體方法是：將電轉後的細菌塗布於含有30μg/ml卡那黴素的lb培養基的平板上，隨機挑選單菌落提取質粒進行酶切鑑定，篩選到正確的轉化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan。
作為進一步優選的技術方案之一，步驟(2)的具體方法是：
(21)將線性dna片段loxm-genta電轉到步驟(1)得到的pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan中，利用red/et同源重組的方法，在重組酶的作用下，慶大黴素抗性基因genta替換螢光假單胞菌pf5基因組上的rets基因，經培養篩選得到正確的轉化子pf5：：△rets-genta-loxm；
(22)把能夠表達cre重組酶的pcm157質粒電轉導入pf5：：△rets-genta-loxm中，經培養篩選，利用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進行誘導，挑取genta抗性基因已被消除的重組子進行菌落pcr驗證和測序。
作為更進一步優選的技術方案之一，步驟(21)中線性dna片段loxm-genta是利用seqidno.15和seqidno.16所示的一對引物通過pcr擴增得到的。
作為更進一步優選的技術方案之一，步驟(21)的培養篩選方法為：將重組後的細菌塗布於含有15μg/mlgenta的lb培養基的平板上，隨機挑選多個單菌落進行菌落pcr驗證，篩選到正確的轉化子pf5：：△rets-genta-loxm。
作為更進一步優選的技術方案之一，pcr驗證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進行pcr擴增驗證的。
作為更進一步優選的技術方案之一，步驟(22)的具體方法是：把能夠表達cre重組酶的pcm157質粒電轉導入pf5：：△rets-genta-loxm中，塗布於含有25μg/ml四環素的lb培養基的平板上篩選；將得到的重組子接種到1ml含有25μg/ml四環素的lb培養基中，900rpm，30℃培養過夜；第二天將50μl過夜培養的菌液轉接到新鮮的1ml含有25μg/ml四環素的lb培養基中，900rpm，30℃培養3小時後，加入1mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進行誘導，繼續培養2小時後用藍色接種環將菌液z字形劃線於lb平板上，待長出單菌落後將分別雙劃線於lb培養基和含有genta15μg/ml的lb培養基的兩種平板上30℃過夜培養；如果在兩種平板上都長出了單菌落，說明說明該重組子內的genta抗性基因沒有被消除；如果在lb平板菌落生長出來，而在lb+genta15μg/m的平板上不生長，則說明該重組子內的genta抗性基因已被消除；挑取此類genta抗性基因已被消除的重組子進行菌落pcr驗證和測序。
作為更進一步優選的技術方案之一，pcr驗證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進行pcr擴增驗證的。
螢光假單胞菌(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets-nif的篩選方法，通過接合轉移把來自大腸桿菌et12567中的質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導入突變的螢光假單胞菌pf5-△rets中，然後通過轉座的方式nif基因隨機插入到pf5-△rets的基因組dna中。
作為優選的技術方案之一，具體步驟如下：
(1)把質粒pbbr1-rha-tegpsy-kan通過電轉的方式導入到野生型的螢光假單胞菌pf5中，篩選到正確的轉化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan；
(2)敲除螢光假單胞菌pf5基因組上的rets基因，得到突變的螢光假單胞菌pf5-△rets；
(3)利用red/et直接克隆的方法，先使用限制性內切酶aflii和sspi對固氮斯氏假單胞菌dsm4166的基因組dna進行酶切，獲得的69kb大小nif固氮基因島，dna片段凝膠電泳驗證正確後，再連接到相應的表達載體上，利用如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示的引物構建表達質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif，通過限制性內切酶kpni進行酶切鑑定，然後將結果正確的質粒電轉入到大腸桿菌et12567中；
(4)通過接合轉移把來自大腸桿菌et12567中的質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導入突變的螢光假單胞菌pf5-△rets中，然後通過轉座的方式nif基因隨機插入到pf5的基因組dna中。
作為進一步優選的技術方案之一，步驟(1)的具體方法是：將電轉後的細菌塗布於含有30μg/ml卡那黴素的lb培養基的平板上，隨機挑選單菌落提取質粒進行酶切鑑定，篩選到正確的轉化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan。
作為進一步優選的技術方案之一，步驟(2)的具體方法是：
(21)將線性dna片段loxm-genta電轉到步驟(1)得到的pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan中，利用red/et同源重組的方法，在重組酶的作用下，慶大黴素抗性基因genta替換螢光假單胞菌pf5基因組上的rets基因，經培養篩選得到正確的轉化子pf5：：△rets-genta-loxm；
(22)把能夠表達cre重組酶的pcm157質粒電轉導入pf5：：△rets-genta-loxm中，經培養篩選，利用異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進行誘導，挑取genta抗性基因已被消除的重組子進行菌落pcr驗證和測序。
作為更進一步優選的技術方案之一，步驟(21)中線性dna片段loxm-genta是利用seqidno.15和seqidno.16所示的一對引物通過pcr擴增得到的。
作為更進一步優選的技術方案之一，步驟(21)的培養篩選方法為：將重組後的細菌塗布於含有15μg/mlgenta的lb培養基的平板上，隨機挑選多個單菌落進行菌落pcr驗證，篩選到正確的轉化子pf5：：△rets-genta-loxm。
作為更進一步優選的技術方案之一，pcr驗證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進行pcr擴增驗證的。
作為更進一步優選的技術方案之一，步驟(22)的具體方法是：把能夠表達cre重組酶的pcm157質粒電轉導入pf5：：△rets-genta-loxm中，塗布於含有25μg/ml四環素的lb培養基的平板上篩選；將得到的重組子接種到1ml含有25μg/ml四環素的lb培養基中，900rpm，30℃培養過夜；將50μl過夜培養的菌液轉接到新鮮的1ml含有25μg/ml四環素的lb培養基中，900rpm，30℃培養3小時後，加入1mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)誘導2小時後，用藍色接種環將菌液z字形劃線於lb平板上，培養至出現單菌落。將分別雙劃線於lb培養基和含有15μg/mlgenta的lb培養基的兩種平板上30℃過夜培養；如果在兩種平板上都長出單菌落，說明說明該重組子內的genta抗性基因沒有被消除；如果在lb平板菌落生長出來，而在lb+genta15μg/m的平板上不生長，則說明該重組子內的genta抗性基因已被消除；挑取此類genta抗性基因已被消除的重組子進行菌落pcr驗證和測序。
作為更進一步優選的技術方案之一，pcr驗證是利用seqidno.13和seqidno.14所示的一對引物進行pcr擴增驗證的。
作為進一步優選的技術方案之一，步驟(4)的具體方法是：
把突變的螢光假單胞菌pf5-△rets(lb培養基，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml培養基，37℃)分別過夜培養；第二天用新鮮的lb培養基分別將突變的螢光假單胞菌pf5-△rets和大腸桿菌et12567清洗兩遍後，分別用300μllb等量溶解，混勻在一起，總共為600μl，9000rpm離心1分鐘後，棄大部分上清液，留50μl菌液與混菌重懸後，均勻地小範圍塗布於lb平板，37℃條件下溫育4h後，放入30℃的培養箱過夜培養；第三天用黃色接種環從lb平板上把共菌體轉到1mllb中混勻，取30μl菌液z字形劃線於pmm培養基+genta25μg/ml+amp100μg/ml，兩天後長出菌落，挑單菌落接種於1mllb+genta25μg/ml+amp100μg/ml過夜培養，之後用seqidno.5～seqidno.14所示的5對引物進行菌落pcr驗證，將pcr驗證後正確的轉化子pf5-△rets-nif送去測序，結果正確的分裝凍存。
本發明的有益效果：
本發明利用red/et重組和直接克隆技術，將固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)基因組中的nif固氮基因島整體克隆到螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組中，使之順利異源表達，得到基因工程菌株pf5-nif，從而使本身無生物固氮的螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)產生生物固氮功能；此外，基因定向無痕敲除螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組中的rets基因，得到基因工程菌株pf5-△rets，提高了抗生素2，4-二乙醯基藤黃酚(2,4-dapg)和紅色素的表達量，從而得到殺菌活性更強的螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株。以前從未報導螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)能夠自身進行生物固氮，用於植物生長促進特性。將該基因工程菌株pf5-nif施用於栽培在溫室和田間條件下的不同作物後，其提供了顯著的生物固氮和生長促進效果。此外，根據可得到的文獻數據，其作用一貫比任何其他先前記錄的植物生長促進微生物製劑更加穩定和可重複。
本發明提供了一株螢光假單胞突變菌株pf5-△rets及以其為活性成分的菌劑，室溫盆栽和田間試驗證明該菌株具有防病害和促生長雙重功效，不僅對多種植物的土傳病害，如猝倒病、根腐病、枯萎病等均有很好的防治作用，而且還能夠很好地促進植物生長。基因組學和分子生物學研究表明該菌株防治植物病害的主要機制是其能夠產生抑制病原菌生長的抗生素類物質，如2，4-二乙醯基藤黃酚(2,4-dapg)和藤黃綠膿菌素等，以及良好的植物根際定殖能力。促進植物生長的主要機制是其含有1-氨基環丙烷-1-羧酸鹽脫氨基酶基因，這種酶可以降低植物苗期根部及其周圍的乙烯含量，從而刺激植物的生長。
螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif在lb固體培養基上30℃培養2-3天後可長出單菌落，挑取單菌落接種到lb液體培養基中(可加入適當的抗生素用於培養和篩選)，進行後續的培養和遺傳操作，得到相應的基因工程菌轉化子，經酶切鑑定和測序後，將正確的基因工程菌大規模培養後用於室溫盆栽和田間試驗。
本發明提供的螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif製成的菌劑，所述菌劑中螢光假單胞菌pf5的菌數可達1x109cfu/ml以上；其菌劑製備工藝簡單，發酵周期短，具有很大的工業化生產潛能。本發明在防治作物土傳病害和促進植物生長等領域具有廣泛的應用空間和市場。
附圖說明
圖1為本發明中螢光假單胞突變菌株pf5-△rets的菌落pcr驗證圖。
圖2為本發明中固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)的基因組dna中的nif固氮基因島的示意圖。
圖3為本發明中通過red/et直接克隆方法構建的表達質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif經過限制性內切酶kpni的酶切鑑定驗證圖。
圖4為本發明中本發明中通過red/et直接克隆方法構建的表達質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif實驗流程圖。
圖5為本發明中固氮螢光假單胞菌株pf5-nif的菌落pcr驗證圖。
圖6為本發明中固氮突變的螢光假單胞菌株pf5-△rets-nif的菌落pcr驗證圖。
圖7為本發明中螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的抑菌實驗。
圖8a～圖8c為本發明中擬南芥移栽入盆4周後固氮螢光假單胞菌株pf5-nif處理與對照施加氮肥no3-和pf5盆栽效果示意圖。
保藏信息
分類名詞：螢光假單胞菌pseudomonasprotegens
保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心
保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
保藏日期：2017年3月28日
保藏號：cgmccno.13948
分類名詞：螢光假單胞菌pseudomonasprotegens
保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心
保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
保藏日期：2017年3月28日
保藏號：cgmccno.13949
分類名詞：螢光假單胞菌pseudomonasprotegens
保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心
保藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
保藏日期：2017年3月28日
保藏號：cgmccno.13950
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發明，並不對其內容進行限定。
實施例1：
螢光假單胞菌突變菌株pf5-△rets的篩選方法，具體操作步驟如下：
(1)把質粒pbbr1-rha-tegpsy-kan(該質粒可以在假單胞菌中表達重組酶)通過電轉的方式導入到野生型的螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)中，將電轉後的細菌塗布於lb培養基+卡那黴素(km，30μg/ml)的平板上，隨機挑選12個單菌落提取質粒進行酶切鑑定，篩選到正確的轉化子pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan；
(2)敲除螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組上的rets基因。將線性dna片段loxm-genta(此片段通過pcr的方法得到，所用的一對引物為rets-genta-loxm-5』gcacacgcccttgccgtgcggtcattacgccgcgcatagttataatcaggcatcaaccaacgaagggatttcgccagctgaattacattcccaaccg/rets-genta-loxm-3’tggagcatggtgggagctcacgactaaaggagggcgagcgagagtttaacaggcgccgcagagcctgtcggctcacaacttaaatgtgaaagtgggtc，分別如seqidno.15和seqidno.16所示)電轉到步驟1)得到的pf5：：pbbr1-rha-tegpsy-kan中，利用red/et同源重組的方法，在重組酶的作用下，慶大黴素抗性基因(genta)將替換螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)基因組上的rets基因，將重組後的細菌塗布於lb培養基+genta15μg/ml的平板上，隨機挑選多個單菌落進行菌落pcr驗證(驗證時用的引物為check-5’tgcttctaccgcaaggacatc/check-3』gctgatgaagcacgagagcac，分別如seqidno.13和seqidno.14所示)，篩選到正確的轉化子pf5：：△rets-genta-loxm；
消除pf5：：△rets-genta-loxm中的genta抗性基因。把能夠表達cre重組酶的pcm157質粒電轉導入pf5：：△rets-genta-loxm中，塗布於lb培養基+四環素(tet25μg/ml)的平板上篩選。將得到的重組子接種到1mllb+tet25μg/ml液體培養基中，900rpm，30℃培養過夜。將50μl過夜培養的菌液轉接到新鮮的1mllb+tet25μg/ml液體培養基中，900rpm，30℃培養3小時後，加入1mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)進行誘導，繼續培養2小時後用藍色接種環將菌液z字形劃線於lb平板上，待長出單菌落後將分別雙劃線於lb和lb+genta15μg/ml兩種平板上30℃過夜培養。如果在兩種平板上都長出了單菌落，說明說明該重組子內的genta抗性基因沒有被消除；如果在lb平板菌落生長出來，而在lb+genta15μg/ml的平板上不生長，則說明該重組子內的genta抗性基因已被消除。挑取此類genta抗性基因已被消除的重組子進行菌落pcr驗證和測序，引物為：
check-5’tgcttctaccgcaaggacatc/
check-3』gctgatgaagcacgagagcac；分別如seqidno.13和seqidno.14所示。
(3)將pcr驗證和測序後正確的轉化子pf5-△rets分裝凍存，用於後續的抑菌、室溫盆栽和田間試驗。
圖1顯示，m為dl5,000dna的marker，1-5號樣品為最終的轉化子pf5-△rets，6號樣品為pf5：：△rets-genta-loxm，在經過iptg誘導產生的cre重組酶的作用下，介導兩個loxm位點(序列)之間的特異性重組，使loxm位點間的genta抗性基因序列被刪除，從而消除了外源抗性基因對於螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)生長、繁殖和定殖等方面的影響，可以更加放心的使用。
實施例2：螢光假單胞菌突變菌株pf5-nif的篩選方法，具體操作步驟如下：
(1)利用red/et直接克隆的方法，先使用限制性內切酶aflii和sspi對固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)的基因組dna進行酶切，獲得的69kb大小nif固氮基因島(圖2)dna片段凝膠電泳驗證正確後，再連接到相應的表達載體上，所使用的引物為：
primer1:agtgaattgtaatacgactcactatagggcgaattcgagctcggtacccgcttaagtacggctacctggagctcgcgccagtg，如seqidno.1所示；
primer2:tacggctacctggagctcgcgccagtgcttgccgacatcgaatcacggccgctgctgcagcacgtggtggtcaccggccgggatccgtttaaacacaaatggcaagggctaatg，如seqidno.2所示；
primer3:attgatgttttccttggccagcgcctcgaacatccggctggcgacgcctgcgtgcgaacgcataccgacaccgacgatagggatccgtttaaacggtgtggtagctcgcgtatt，如seqidno.3所示；
primer4:gcgacactatagaatactcaagcttggcatgaatgcaggtcgactctagagaatattgatgttttccttggccagcgcctcgaac，如seqidno.4所示；
構建了表達質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif(圖3)，通過限制性內切酶kpni進行酶切鑑定，然後將結果正確的質粒電轉入到大腸桿菌et12567中(圖4)；
(2)通過接合轉移把來自大腸桿菌et12567中的質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導入螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)中，然後通過轉座的方式，nif基因可隨機插入到pf5的基因組dna中。接合轉移詳細操作為：平板挑取單菌落，把螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)(lb培養基，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml+cm10μg/ml+km1μg/ml培養基，37℃)分別過夜培養；將兩種過夜的菌液7000rpm，離心1分鐘。用新鮮的lb培養基分別將螢光假單胞菌pf5和大腸桿菌et12567洗滌兩遍後，用300μllb培養基重懸，分別各取50μl懸浮液，混勻，小範圍塗在lb平板中間，晾乾。在37℃條件下孵育4h後，將平板在30℃的培養箱中倒置培養過夜；用接種環將平板上的菌刮下來，用1ml無菌水懸浮混勻，取100μl菌液z字形劃線塗布於pmm培養基+genta25μg/ml平板上，30℃倒置培養2天，直至單菌落出現；兩天後長出菌落，挑單菌落接種於1mllb+genta25μg/ml過夜培養，之後用以下的5對引物進行菌落pcr驗證，引物為：
nif-check-1ggtctaccagctcgacct/
nif-check-2cgattccagcgtcgaatgat；
nif-check-3gctgacctccttgaggtgct/
nif-check-4cagcggcacctcgaggagt；
nif-check-5gatagagcaggtcctcgat/
nif-check-6ggtgctctacgtcagccatt；
nif-check-7cgacagatcctgattaccgt/
nif-check-8taccctcgaccagcttgagca；
check-5’tgcttctaccgcaaggacatc/
check-3』gctgatgaagcacgagagcac；分別如seqidno.5～seqidno.14所示；
前4對引物用於驗證nif固氮基因是否已經整體整合到螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組當中，擴增出的pcr片段的分別為1000bp、970bp、830bp、1080bp，第5對引物是為了驗證導入nif固氮基因的菌株是螢光假單胞菌pf5而不是大腸桿菌et12567，其pcr擴增結果是dna片段大小為3200bp的rets基因；
(3)將菌落pcr驗證後正確的轉化子pf5-nif送去測序，結果正確的分裝凍存，用於後續的抑菌、室溫盆栽和田間試驗。
圖5顯示，m為dl5,000dna的marker，ck1為野生型螢光假單胞菌pf5，ck2為大腸桿菌et12567，二者作為對照組。其中5列dna電泳圖代表了一個pf5-nif轉化子用上述的5對引物做了5次菌落pcr驗證，經過反覆仔細比對後，有藍色方框標註的為正確的轉化子pf5-nif，從而證明固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)中的nif固氮基因已經整體整合到螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組當中，從而獲得了正確的轉化子pf5-nif。
實施例3：螢光假單胞菌突變菌株pf5-△rets-nif的篩選方法，具體操作步驟如下：
通過接合轉移把來自大腸桿菌et12567中的質粒pbelobac11-orit-tnpa-genta-nif導入突變的螢光假單胞菌pseudomonasprotegenspf5-△rets中，然後通過轉座的方式nif基因可隨機插入到pf5-△rets的基因組dna中。接合轉移詳細操作為：把突變的螢光假單胞菌pseudomonasprotegenspf5-△rets(lb培養基，30℃)與大腸桿菌et12567(lb+genta2μg/ml培養基，37℃)分別過夜培養。第二天用新鮮的lb培養基分別將突變的螢光假單胞菌pseudomonasprotegenspf5-△rets和大腸桿菌et12567清洗兩遍後，分別用500μllb等量溶解，混勻在一起，總共為1ml，9000rpm離心1分鐘後，棄大部分上清液，留100μl菌液與混菌重懸後，均勻地小範圍塗布於lb平板，37℃條件下溫育4h後，放入30℃的培養箱過夜培養。第三天用黃色接種環從lb平板上把共菌體轉到1mllb中混勻，取30μl菌液z字形劃線於pmm培養基+genta25μg/ml，兩天後長出菌落，挑單菌落接種於1mllb+genta25μg/ml過夜培養，之後用實施例2中的5對引物進行菌落pcr驗證，其中為了前4對引物用於驗證nif固氮基因是否已經整體整合到螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)的基因組當中，擴增出的pcr片段的分別為1000bp、970bp、830bp、1080bp，第5對引物是為了驗證導入nif固氮基因的菌株是螢光假單胞菌pf5而不是大腸桿菌et12567，但因為這次nif固氮基因電轉入的是已經敲除了rets基因的突變螢光假單胞菌株pf5-△rets，所以其pcr擴增結果是大小為400bp的dna片段；將pcr驗證後正確的轉化子pf5-△rets-nif送去測序，結果正確的分裝凍存，用於後續的抑菌、室溫盆栽和田間試驗。
圖6顯示，m為1kbdna的marker，ck1為已經敲除了rets基因的突變螢光假單胞菌pf5-△rets，ck2為大腸桿菌et12567，二者作為對照組。其中5列dna電泳圖代表了一個pf5-nif轉化子用上述的5對引物做了5次菌落pcr驗證，經過反覆仔細比對後，有藍色方框標註的為正確的轉化子pf5-nif，從而證明固氮斯氏假單胞菌dsm4166(pseudomonasstutzeridsm4166)中的nif固氮基因已經整體整合到已經敲除了rets基因的突變螢光假單胞菌pf5-△rets的基因組當中，從而獲得了正確的轉化子pf5-△rets-nif。
本發明得到的幾種螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif的相關信息，如表1所示。
表1.各個菌株的相關信息
試驗例1
採用濾紙片法，檢測螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif對枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的抑制作用，具體操作步驟如下：
(1)將枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)和實驗菌株螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif分別接種到1mllb液體培養基，900rpm，30℃過夜培養；
(2)第二天把枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)9000rpm，離心1分鐘後，留100μl菌液均勻塗布在lb固體平板上，待晾乾後在該平板上放置若干個直徑6mm的雙層濾紙片，取5μl過夜培養的實驗菌株螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)及其突變菌株pf5-nif，pf5-△rets和pf5-△rets-nif的菌液分別滴加到濾紙片上。將此平板放置在30℃條件下培養過夜；
(3)第三天觀察平板上各個小濾紙片周邊的抑菌圈大小。
圖7顯示，已經敲除了rets基因的螢光假單胞菌pf5(pseudomonasprotegenspf5)突變菌株pf5-△rets和pf5-△rets-nif的抑菌圈比未敲除rets基因的螢光假單胞菌pf5和pf5-nif的抑菌圈明顯要大，從而說明其抑制枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的能力，在△rets基因敲除後得到了增強。
試驗例2
固氮螢光假單胞菌株pf5-nif的室溫盆栽試驗，以擬南芥為試驗對象，試驗方案如下：
1)使用野生型擬南芥col-0為試驗對象，試驗條件：溫度為20℃，光照強度80μmol·m-2·s-1，
光照周期：16小時光照，8小時黑暗；試驗分為3個組：
①正常施加氮肥1mm(no3-)組，作為對照
②未施加氮肥，但施加了正常的螢光假單胞菌株pf5
③未施加氮肥，但施加了固氮螢光假單胞菌株pf5-nif
2)擬南芥種子預處理：種子放置於4℃的冰箱2-4天(讓種子春化，使該批試驗種子的發芽率保持齊平)；種子消毒：在2w.t.％次氯酸鈉(naclo)中脫毒15分鐘後(脫毒過程中不斷搖晃，使種子充分被接觸)，隨後用無菌水對種子進行衝洗5-10遍；
3)將擬南芥種子播種在1/2ms固體培養基上(相同位置的種子不能過多)。具體操作：將ep管中的上清液用移液槍頭吸掉，吸取200μl培養基，讓液體緩慢流至槍尖，然後輕輕地點在ms培養基上，之後把平皿豎著培養；
4)移苗：當ms培養基上長出小苗後(需10天左右的時間)，移植到土壤培養基中(蛭石：黑土(質量比)＝1:1)，每個花盆三棵苗，移植過程中一定不要弄斷小苗的根部；
5)接菌：挑平板上的pf5-nif單菌落在kb培養基上培養過夜，第二天按照過夜菌液：新鮮培養基(體積比)＝1:50的比例接種於lb培養基，220rpm，30℃培養至od600＝0.6左右(pf5-nif的菌數可達1x109cfu/ml)，取1ml菌液接種於擬南芥幼苗根際周圍0.5mm範圍內，連續接種3天；
6)在溫室中按照設定的試驗條件進行培育，
用於室溫盆栽試驗的各培養基成分如下：
ms培養基：nh4no31.65g/l，kno31.9g/l，cacl2·2h2o0.44g/l，mgso4·7h2o0.37g/l，kh2po40.17g/l，ki0.83mg/l，h3bo36.2mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，feso4·7h2o27.8mg/l，na2-edta·2h2o37.3mg/l，肌醇100mg/l，煙酸0.5mg/l，維生素b60.5mg/l，維生素b10.1mg/l，甘氨酸2mg/l。
kb培養基：k2hpo40.1g/l，kh2po40.4g/l，nacl0.1g/l，mgso4·7h2o0.01g/l，fe2(so4)3·h2o0.01g/l，znso4·7h2o0.01g/l，mncl2h2o0.01g/l，namoo40.01g/l，cacl22h2o0.1g/l，檸檬酸鈉1g/l，葡萄糖5.5g/l，酵母提取物0.2g/l，調節ph至7.0。
圖8a～圖8c顯示，經過四周的室溫盆栽試驗，未施加氮肥，但施加了正常的螢光假單胞菌株pf5的②試驗組中，擬南芥的長勢不好，葉小莖短，遠不如其餘兩個試驗組(圖8a，圖8c)。而在未施加氮肥，但施加了固氮螢光假單胞菌株pf5-nif③試驗組中，擬南芥的長勢和葉子大小等表型還要優於施加了氮肥的①試驗組(圖8c)，這是由於pf5-nif不僅能夠進行生物固氮，減少氮肥的使用，更由於螢光假單胞菌株pf5其自身的殺菌和促植物生長的功效，使得植物能夠茁壯生長，各項指標超過了對照組(圖8a，圖8c)。
利用本發明獲得的固氮螢光假單胞菌株pf5-nif處理的盆栽擬南芥綠色質量平均提高了約8％(圖8b)，植株在未施加氮肥的條件下，看上去更綠更茁壯。
上述雖然結合附圖對本發明的具體實施方式進行了描述，但並非對本發明保護範圍的限制，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護範圍以內。
sequencelisting
山東大學，德州邁科生物技術有限公司
螢光假單胞菌突變菌株的篩選方法及其在生物防治中的應用
2017
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