一株假單胞菌及其雙功能酶製劑的製備方法與應用與流程
2023-08-05 06:31:01
本發明涉及一株假單胞菌及其雙功能酶製劑的製備方法與應用，屬於環境生物技術領域。
背景技術：
持久性有機汙染物(pops)是環境中一類具有持久性、半揮發性、長距離遷移性、生物蓄積性和高毒性的有機汙染物，分布廣泛，對人體危害巨大。其中，工業化學品多氯聯苯(pcbs)是首批被列入國際《斯德哥爾摩公約》的pops，其氯化程度越高，毒性越大，越難分解。有機氯農藥阿特拉津是一種半衰期長的三嗪類除草劑，因其可移動性強，對土壤、水生生態系統和飲用水源產生嚴重汙染，已被學術界提名為新pops物質。目前，已有pops汙染問題亟待解決，新的pops汙染事故仍不斷發生，及時有效地治理和修復汙染環境，對人類健康和經濟發展至關重要。
微生物降解因其低耗、易於實現原位修復、環境安全和純生態過程的顯著優點，是公認的治理pops汙染的一種環保而有效的手段。好氧微生物能夠把低氯pcbs(ncl<5)氧化為氯代苯甲酸，但很難降解高氯pcbs(ncl≥5)；厭氧生物過程將高氯pcbs還原成低氯pcbs，但不能破壞苯環結構。目前，微生物降解pcbs周期長、效率低，好氧條件下的高氯代pcbs高效降解未見報導。胡江等利用arthrobactersp.ha1可在84h實現對阿特拉津的高效降解。然而，能夠同時實現高效降解不同種類pops的多功能酶在國內外尚屬空白。鑑於土壤、水生生態系統汙染並非單一汙染因素造成，製備能夠高效降解pops的多功能酶，提高pcbs、有機氯農藥的降解速率，對推進汙染環境的大規模快速修復具有重要意義。
技術實現要素：
本發明針對現有技術的不足，提供一株來源於pops汙染土壤的能降解多氯聯苯、阿特拉津的假單胞菌及其雙功能酶製劑的製備方法與應用。
本發明是通過以下技術方案實現的：
一株假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，2017年3月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號：cgmccno.13960。
上述假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株採用如下方法篩選獲得：
取pops汙染土壤浸出液，分別稀釋至濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5個濃度梯度。將稀釋後的菌懸液塗布於含有多氯聯苯和阿特拉津的固體培養基，每個濃度做兩個平行，30℃培養1～3天。將生長較快、形態較為典型的細菌菌落挑出，然後經過3次平板劃線分離純化後，挑單菌落於無機鹽液體培養基中，30℃、150轉/分鐘培養3天，取培養物1.5ml加入0.5ml甘油，混勻後於-80℃冰箱長期保存。用於塗布菌懸液的固體培養基為lb固體培養基，組分如下：蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，水定容至1l，ph自然。用於單菌落培養的無機鹽液體培養基組分如下：磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鈉0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.1g，氯化鈉0.2g，硫酸銨1.0g，蛋白腖2.0g，水定容至1l，ph7.0。
將上述所得到的菌株，分別接種到含有多氯聯苯和阿特拉津的無機鹽液體培養基上，150轉/分鐘、30℃培養72h，觀察菌液渾濁情況，同時取菌懸液進行600nm處的吸光值檢測。依據上述指標選擇產酶菌株。將在無機鹽培養基中吸光值最高的菌株挑取到lb固體培養基上培養，並保種記為eco-1。
假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，經測定，其16srrna的基因序列長度為1401bp，核苷酸序列如seqidno.1所示。通過使用美國生物工程信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)blastn程序比對，本發明的菌株的16srrna的基因序列與ncbi註冊的假單胞菌標準菌株(pseudomonas)16srrna的基因序列具有較高的同源性。經比對，與標準菌株pseudomonasputidaatcc12633，pseudomonasaspleniiatcc23835親緣關係最近，相似度為99％，但是目前未見假單胞菌(pseudomonassp.)能夠降解多種pops的報導。
上述16srrna基因測序的基本方法是：用細菌基因組提取試劑盒(天根)製備菌株的基因組dna，以菌株的基因組dna為模板，使用細菌16srrna基因的通用引物進行擴增，用膠回收試劑盒(天根)純化pcr擴增產物，電泳驗證後，由青島擎科梓熙生物技術有限公司完成16srrna基因測序，將所得序列與美國國家生物信息中心(ncbi)收錄的標準菌株的16srrna基因序列進行比對。
利用上述假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株生產雙功能酶製劑的方法，步驟如下：
(1)取假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株劃線於lb固體培養基上，28～37℃倒置活化培養1～2天，製得活化後菌株；
(2)取步驟(1)製得的活化後菌株接種至lb液體培養基中，在溫度為28～37℃、轉速為100～200轉/分鐘的條件下，搖床培養1～2天，製得種子液；
(3)取步驟(2)製得的種子液，按1～10％的體積百分比接種於無機鹽培養基中，在溫度為28～37℃、轉速為100～200轉/分鐘的條件下，擴大培養3～5天，製得假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌液；
(4)取步驟(3)製得的假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌液，在3000～10000轉/分鐘的條件下，離心2～10分鐘，收集菌體，懸浮於10～30倍體積的ph6.0～8.0的磷酸緩衝液中，進行超聲波細胞破碎，在4～25℃、3000～8000轉/分鐘的條件下，離心2～5分鐘，收集上清液，製得雙功能酶製劑。
根據本發明優選的，所述步驟(1)中的lb固體培養基，每升組分如下：
蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，水定容至1l，ph自然。
根據本發明優選的，所述步驟(2)中的lb液體培養基，每升組分如下：
蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水定容至1l，ph自然。
根據本發明優選的，所述步驟(3)中的無機鹽培養基，每升組分如下：
磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鈉0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.1g，氯化鈉0.2g，硫酸銨1.0g，蛋白腖2.0g，聯苯0.5g，阿特拉津0.025g，水定容至1l，ph7.0。
根據本發明優選的，所述步驟(4)中的超聲波細胞破碎，條件如下：
破碎時間/間隙時間為2秒/2秒，總時間17分鐘，功率為165瓦。
上述雙功能酶製劑在降解多氯聯苯、阿特拉津中的應用。
上述應用，步驟如下：
取上述製得的雙功能酶製劑，調整體系中多氯聯苯濃度0.5～5mg/l和/或阿特拉津的濃度50～500mg/l，加入雙功能酶製劑使體系中雙功能酶製劑濃度為0.05～0.25g/l，在溫度為20～37℃的條件下，反應3～24小時，即可。
有益效果
本發明首次從pops汙染土壤中分離獲得一株假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，利用該菌株首次製備獲得能夠高效降解多氯聯苯、阿特拉津的雙功能酶製劑，尤其對在好氧條件下難降解的高氯代多氯聯苯降解活性顯著，這與現有已知的假單胞菌(pseudomonassp.)及其酶製劑的功能完全不同，具有大規模生產應用前景。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護範圍不限於此。
實施例1
一株假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，2017年3月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號：cgmccno.13960。
上述假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株採用如下方法篩選獲得：
取pops汙染土壤浸出液，分別稀釋至濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的5個濃度梯度。將稀釋後的菌懸液塗布於含有多氯聯苯和阿特拉津的固體培養基，每個濃度做兩個平行，30℃培養1～3天。將生長較快、形態較為典型的細菌菌落挑出，然後經過3次平板劃線分離純化後，挑單菌落於無機鹽液體培養基中，30℃、150轉/分鐘培養3天，取培養物1.5ml加入0.5ml甘油，混勻後於-80℃冰箱長期保存。用於塗布菌懸液的固體培養基為lb固體培養基，組分如下：蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，水定容至1l，ph自然。用於單菌落培養的無機鹽液體培養基組分如下：磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鈉0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.1g，氯化鈉0.2g，硫酸銨1.0g，蛋白腖2.0g，水定容至1l，ph7.0。
將上述所得到的菌株，分別接種到含有多氯聯苯和阿特拉津的無機鹽液體培養基上，150轉/分鐘、30℃培養72h，觀察菌液渾濁情況，同時取菌懸液進行600nm處的吸光值檢測。依據上述指標選擇產酶菌株。將在無機鹽培養基中吸光值最高的菌株挑取到lb固體培養基上培養，並保種記為eco-1。
假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株，經測定，其16srrna的基因序列長度為1401bp，核苷酸序列如seqidno.1所示。通過使用美國生物工程信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,ncbi)blastn程序比對，本發明的菌株的16srrna的基因序列與ncbi註冊的假單胞菌標準菌株(pseudomonas)16srrna的基因序列具有較高的同源性。經比對，與標準菌株pseudomonasputidaatcc12633，pseudomonasaspleniiatcc23835親緣關係最近，相似度為99％，但是目前未見假單胞菌(pseudomonassp.)能夠降解多種pops的報導。
上述16srrna基因測序的基本方法是：用細菌基因組提取試劑盒(天根)製備菌株的基因組dna，以菌株的基因組dna為模板，使用細菌16srrna基因的通用引物進行擴增，用膠回收試劑盒(天根)純化pcr擴增產物，電泳驗證後，由青島擎科梓熙生物技術有限公司完成16srrna基因測序，將所得序列與美國國家生物信息中心(ncbi)收錄的標準菌株的16srrna基因序列進行比對。
實施例2
利用上述假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株生產雙功能酶製劑的方法，步驟如下：
(1)從-80℃冰箱劃線假單胞菌(pseudomonassp.)eco-1菌株於lb固體培養基上，28℃倒置培養1天；
所述lb固體培養基，每升組分如下：
蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，水定容至1l，ph自然；
(2)挑取eco-1單菌落至lb液體培養基中，在溫度為28℃、轉速為200轉/分鐘的條件下，搖床培養1天，製得種子液；
所述lb液體培養基，每升組分如下：
蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水定容至1l，ph自然；
(3)將步驟(2)製得的種子液，按10％的體積百分比接種於無機鹽培養基中，在溫度為28℃、轉速為200轉/分鐘的條件下，擴大培養5天，製得假單胞菌eco-1菌液；
所述無機鹽培養基，每升組分如下：
磷酸二氫鉀0.5g，磷酸氫二鈉0.5g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.1g，氯化鈉0.2g，硫酸銨1.0g，蛋白腖2.0g，聯苯0.5g，阿特拉津0.025g，水定容至1l，ph7.0；
(4)取步驟(3)製得的假單胞菌eco-1菌液，在3000轉/分鐘的條件下，離心10分鐘，收集菌體，懸浮於30倍體積的ph7.0的磷酸緩衝液中，進行超聲波細胞破碎，在4℃、3000轉/分鐘的條件下，離心2分鐘，收集上清液，製得雙功能酶製劑；
所述的超聲波細胞破碎，條件如下：
破碎時間/間隙時間為2秒/2秒，總時間17分鐘，功率為165瓦。
對比例
如實施例2所述的方法，不同之處在於，採用的菌株為pseudomonasputidaatcc12633。
實驗例1、雙功能酶對多氯聯苯降解能力的分析
將濃度25mg/l的五氯聯苯pcb114底物、雙功能酶、pbs緩衝液按1:5:19(體積比)的比例混合後，在30℃、ph7.0下反應12h，加入10ml正己烷萃取3次，取萃取液，用gc-ms法檢測五氯聯苯降解率，pcb114降解率可達65.7％。
對比例中菌株pseudomonasputidaatcc12633胞內酶、pbs緩衝液、濃度25mg/l的五氯聯苯pcb114底物按5:19:1(體積比)的比例混合後，在30℃、ph7.0下反應12h，加入10ml正己烷萃取3次，取萃取液，用gc-ms法檢測五氯聯苯降解率，pcb114未被降解。
實驗例、雙功能酶對阿特拉津降解能力的分析
將濃度100mg/l的阿特拉津底物、雙功能酶、pbs緩衝液按1:10:38(體積比)的比例混合後，在25℃、ph7.5下反應6h，加入10ml二氯甲烷萃取3次，取萃取液，用hplc法檢測阿特拉津降解率，降解率可達45％。
對比例中菌株pseudomonasputidaatcc12633胞內酶、pbs緩衝液、濃度100mg/l的阿特拉津底物按10:38:1(體積比)的比例混合後，在25℃、ph7.5下反應6h，加入10ml二氯甲烷萃取3次，取萃取液，用hplc法檢測阿特拉津降解率，降解率為7.3％。
結果顯示，假單胞菌eco-1菌株製備的雙功能酶能夠高效降解多氯聯苯、阿特拉津，尤其對好氧條件下難降解的高氯代多氯聯苯具有較高降解活性，在pops汙染治理與修復領域具有潛在的應用價值。對比例中與假單胞菌eco-1同源性較高的假單胞菌標準菌株pseudomonasputidaatcc12633，其胞內酶在好氧條件下對高氯代多氯聯苯不具有降解能力，對阿特拉津的降解率遠遠低於假單胞菌eco-1菌株胞內酶。假單胞菌eco-1菌株製備的雙功能酶是能夠同時實現高效降解不同種類pops的多功能酶，這與現有已知的假單胞菌(pseudomonassp.)及其酶製劑的功能完全不同，具有大規模生產應用前景。
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山東省科學院生態研究所
一株假單胞菌及其雙功能酶製劑的製備方法與應用
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