螢光假單胞菌pf27在抗煙粉蝨和防治馬鈴薯病害中的應用的製作方法

2023-08-05 06:09:11

本發明屬於生物技術領域，具體涉及螢光假單胞菌pf27在抗煙粉蝨和防治馬鈴薯病害中的應用。

背景技術：

馬鈴薯是目前種植量較大的農作物，由於其生長適應性強、味道好和營養豐富等特點，種植範圍較大，逐步被認定為繼玉米、小麥、水稻之後的第四大主糧，人們對馬鈴薯的需求量也越來越大。馬鈴薯生長過程中容易出現一些病害，如晚疫病、早疫病、瘡痂病和病毒病等多種病害，已經嚴重影響到馬鈴薯的生長情況，甚至會導致馬鈴薯塊莖腐爛等。而農業害蟲煙粉蝨俗稱小白蛾，是近年來新發生的一種蟲害，嚴重危害番茄、黃瓜、辣椒等蔬菜及棉花等眾多作物。目前，國內外對病蟲害的防治多從農業防治和化學防治出發，防治效果不明顯，而且造成了一定程度的環境汙染。

生物防治由於其自身的優點開始受到越來越多的重視。假單胞菌通常具有植物促生作用，同時能夠增強植物對於病原物和非生物脅迫的抗性，被稱作植物促生細菌(plantgrowth-promotingbacteria，pgpb)或植物根圍促生細菌，螢光假單胞菌(psedomonasfluorescens)作為一種重要的生防細菌，可通過抑制病原菌的發生、誘導系統抗性、產生植物激素和提高植物生長量來促進植株的生長發育，是微生物肥料和生防製劑生產中最常見也是最重要的菌種之一。石晶盈等(2011)研究發現銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)mgp3發酵液對採後番木瓜炭疽病和疫黴病的防治效果分別達到50％和71％，並且mgp3菌液可以顯著降低除苗期外果實炭疽菌的潛伏侵染率和炭疽病的病情指數。韋巧婕等(2013)研究發現拮抗菌bacillussp.b與有機肥發酵混配使用對黃瓜枯萎病有顯著的防治作用，發病率降低了66.7％，病情指數下降了67％，防治效果達到80.7％；而單純使用有機肥發病率不僅不能降低，而且還有所上升。

因此，開發新的、更為高效和安全的微生物殺菌劑來控制病害的發生是提高社會生產總量的需要，同時更是農業安全可持續發展的需要，符合社會發展需求。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液的新用途。

本發明提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在防治馬鈴薯病害中的應用。

本發明還提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在製備防治馬鈴薯病害的產品中的應用。

本發明還提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在抗菌和/或抑菌中的應用。

本發明還提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在製備抗菌和/或抑菌的產品中的應用。

本發明還提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在防治農業害蟲中的應用。

本發明還提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在製備防治農業害蟲的產品中的應用。

上述應用中，所述農業害蟲為煙粉蝨bemisiatabaci。

本發明還提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在提高植物對煙粉蝨的抵抗能力中的應用。

本發明還提供了螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液在製備提高植物對煙粉蝨的抵抗能力的產品中的應用。

本發明的另一個目的是提供一種產品；所述產品具有如下1)-4)中任一種功能：

1)防治馬鈴薯病害；

2)抗菌和/或抑菌。

3)防治農業害蟲；所述農業害蟲具體為煙粉蝨；

4)提高植物對煙粉蝨的抵抗能力；

本發明提供的產品的活性成分為螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液；

上述應用或產品中，所述螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens為螢光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27。

上述應用或產品中，所述馬鈴薯病害為馬鈴薯真菌病害、馬鈴薯卵菌病害和馬鈴薯細菌病害；

所述馬鈴薯真菌病害具體為馬鈴薯黑痣病；

所述馬鈴薯卵菌病害具體為馬鈴薯晚疫病；

所述馬鈴薯細菌病害具體為馬鈴薯瘡痂病。

上述應用或產品中，所述菌為馬鈴薯黑痣病菌和/或馬鈴薯晚疫病菌和/或馬鈴薯瘡痂病菌。所述馬鈴薯黑痣病菌具體為馬鈴薯黑痣病菌gs-3；所述馬鈴薯晚疫病菌具體為馬鈴薯晚疫病菌88069和t30-4；所述馬鈴薯瘡痂病菌具體為馬鈴薯瘡痂病菌4.1789、4.0076和4.1756。

本發明還有一個目的是提供一種防治馬鈴薯病害的方法。

本發明提供的防治馬鈴薯病害的方法包括用螢光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液處理馬鈴薯幼苗的步驟。

本發明最後一個目的是提供一種防治農業害蟲煙粉蝨的方法。

本發明提供的防治農業害蟲煙粉蝨的方法包括用螢光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27或其菌劑或其發酵液或其代謝液或其菌懸液或其培養液處理植物幼苗的步驟。

上述方法中，所述植物可為十字花科、葫蘆科、豆科、茄科和錦葵科等植物；所述葫蘆科植物具體可為黃瓜，所述茄科植物具體可為番茄、馬鈴薯和菸草；所述錦葵科植物具體可為棉花。

上述應用或產品或方法中，

所述pf27菌劑的製備方法如下：將螢光假單胞菌pf27接種於kb培養基中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養12-16h，然後4000rpm離心20min，棄上清液，收集菌體沉澱，再用滅菌水將所述菌體沉澱進行稀釋，即得到pf27菌劑。

所述pf27發酵液的製備方法如下：將螢光假單胞菌pf27接種於kb培養液中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養12-16h，然後4000rpm離心20min，收集上清液，即得到pf27發酵液。

所述pf27代謝液的製備方法如下：將pf27發酵液經過0.22μm濾膜過濾(該步驟的目的是除菌)，收集濾液，即得到pf27代謝液。

本發明的螢光假單胞菌pseudomonasfluorescenspf27的分類命名為螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens，該菌株已於2017年5月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為cgmccno.14105。

本發明通過對已有菌株的再次開發，篩選到對多寄主危害煙粉蝨和馬鈴薯主要病害有防治效果的螢光假單胞菌pf27。通過實驗證明：pf27菌劑處理番茄幼苗後能夠誘導番茄植株對害蟲煙粉蝨的抗性，其抑制效果在產卵和幼蟲發育方面均達到約50％，雙向選擇實驗數據顯示pf27對煙粉蝨具有明顯的驅蟲效果。在對馬鈴薯的主要病害的抑菌效果中，pf27發酵液對馬鈴薯黑痣病gs-3的抑菌效果為82.56％，馬鈴薯晚疫病88069抑菌效果為47.33％，同時pf27代謝液對馬鈴薯瘡痂病4.0076、4.1576和4.1789平均抑菌效果分別為49.74％、39.39％和45.47％，而大腸桿菌e.coli對這三個株系的細菌病害的平均抑菌率分別只有5.73％、17.37％和11.89％。上述結果充分說明pf27發酵液或代謝液對馬鈴薯主要病害具有廣譜的抑菌效果。本發明的pf27菌劑或pf27發酵液或pf27代謝液作為一種生物源農藥，具有廣譜、高效和安全的優點，不僅避免了化學農藥大量使用帶來的殘留和環境汙染等問題，而且有利於促進環境保護及農業可持續發展，具有較好的應用前景。

附圖說明

圖1為基於16srdna序列構建的pf27系統發育樹。

圖2為微生物菌劑pf27對煙粉蝨的抵抗能力。a為煙粉蝨在番茄幼苗植株上產卵和發育到四齡幼蟲的示意圖；b為煙粉蝨在對照番茄植株(control)和pf27菌劑處理的番茄植株的雙向選擇示意圖；c為煙粉蝨在pf27菌劑處理和對照(control)的番茄植株上產卵的數目統計。d為煙粉蝨成蟲對pf27菌劑處理和對照(control)的番茄植株上雙向選擇的比率的統計。e為煙粉蝨在pf27菌劑處理和對照(control)的番茄植株單個葉片上發育到四齡幼蟲的數目統計。f為自然條件下煙粉蝨成蟲在pf27菌劑處理和對照(control)的馬鈴薯幼苗上的生長狀態。註：*表示在0.05水平上差異顯著，**表示在0.01水平上差異顯著(同下)。

圖3為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯黑痣病gs-3的發病情況統計，照片拍攝接種6天後。a為pf27菌劑處理組和對照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯黑痣病gs-3孢子懸浮液後的發病情況，其中，上圖為對照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯黑痣病gs-3孢子懸浮液的發病情況；下圖為pf27菌劑處理組馬鈴薯葉片接種gs-3孢子懸浮液發病情況。每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。b為pf27菌劑處理組和對照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯黑痣病gs-3發病的病斑面積統計，n＝12。

圖4為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯晚疫病88069和t30-4的發病情況，照片拍攝接種6天後。a為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯晚疫病t30-4的發病情況，其中，上圖為pf27菌劑處理組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病t30-4孢子懸浮液的發病情況；下圖為對照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病t30-4孢子懸浮液發病情況，每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。b為pf27菌劑處理組和對照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病t30-4發病的病斑面積數據統計，n＝12。c為馬鈴薯第4，5莖葉接種馬鈴薯晚疫病88069的發病情況，其中，上圖為pf27菌劑處理組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病88069孢子懸浮液的發病情況；下圖為對照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病88069孢子懸浮液發病情況，每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。d為pf27菌劑處理組和對照組馬鈴薯葉片接種馬鈴薯晚疫病88069發病的病斑面積，n＝12。

圖5為微生物pf27發酵液對馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病t30-4和88069的抑菌示意圖。

圖6為pf27菌劑對馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病88069和t30-4的抑菌實驗。a為pf27菌劑處理組和對照組平板接種馬鈴薯晚疫病88069和t30-4菌斑的生長情況，其中，左圖為pf27菌劑處理組和對照組平板接種馬鈴薯晚疫病88069菌斑的生長情況，右圖為pf27菌劑處理組和對照組平板接種馬鈴薯晚疫病t30-4菌斑生長情況。b為pf27菌劑處理組和對照組平板接種馬鈴薯黑痣病gs-3菌斑的生長情況。c為pf27菌劑對馬鈴薯晚疫病88069、t30-4和馬鈴薯黑痣病gs-3的抑制率的柱形圖統計。每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。

圖7為pf27代謝液對馬鈴薯瘡痂病4.1789、4.0076和4.1756的抑菌實驗。a為接種馬鈴薯瘡痂病4.1789、4.0076和4.1756的實驗組、對照組、空白組培養基中的菌斑生長情況。b為接種馬鈴薯瘡痂病4.1789、4.0076和4.1756的實驗組、對照組、空白組培養基中的抑制率的柱形圖統計。每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。

保藏說明

菌種名稱：螢光假單胞菌

拉丁名：pseudomonasfluorescens

菌株編號：pf27

保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機構簡稱：cgmcc

地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號

保藏日期：2017年5月8日

保藏中心登記入冊編號：cgmccno.14105

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。

下述實施例中所用培養基配方如下(液體培養基僅將固體培養基中的瓊脂粉去除，且保持其他組分和濃度不變)：

mea培養基(固體)：maltextract30g，mycologicalpeptone5g，瓊脂粉15g，ph5.4；

牛肉膏蛋白腖培養基(固體)：蛋白腖10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂粉12g，水1000ml，ph7.2-7.4；

lb培養基(固體)：氯化鈉10g，蛋白腖10g，酵母提取物5g，瓊脂粉12g，水1000ml，ph7.0；

kb培養基(固體)：蛋白腖20g，k2hpo41.5g，甘油8ml，mgso40.74g，h2o補足到1l，ph7.0；固體培養基加瓊脂粉12g。

pda培養基(固體)：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，水1000ml。

10％v8培養基(固體)：v8汁上清液(將超市內購買的v8汁4000rpm離心10min，收集上清液)100ml，caco31g，瓊脂粉15g，水1000ml。

下述實施例中的馬鈴薯黑痣病菌gs-3記載於如下文獻：趙偉全等，2006，中國馬鈴薯瘡痂病菌的鑑定，公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的馬鈴薯晚疫病菌t30-4記載於如下文獻：sansomee等，disploidyandchromosomalstructuralhybridityinphytophthorainfestans.nature)；馬鈴薯晚疫病菌88069記載於如下文獻：劉衛，馬鈴薯晚疫病抗性相關基因stbl-slgpk的克隆和功能分析；公眾可從申請人處獲得，該生物材料只為重複本發明的相關實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中的馬鈴薯瘡痂病菌4.0076購自中國農業微生物菌種保藏管理中心，菌種目錄編號為accc40076；馬鈴薯瘡痂病菌4.1756和4.1789購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為cgmccno.4.1756和cgmccno.4.1789。

實施例1、pf27菌株的分離與鑑定

一、pf27菌株的分離

pf27分離自雲南省普洱市疣粒野生稻區根際土壤(北緯22。33』56」，100。35』12」，海拔737米)。具體分離方法如下：將採自疣粒野生稻區的根際土壤，挑取根系，刮取根際土，稱量5g，無菌條件下放進已準備好的滅菌三角瓶中，用滅菌水梯度稀釋到10-6倍，設置3個重複。將梯度稀釋的土壤樣品取200μl分別塗到mea培養基、牛肉膏蛋白腖培養基、lb培養基和kb培養基平板上，分別在28℃，37℃培養箱中培養，每天觀察菌落的生長狀態，結果顯示稀釋為10-5、10-6倍時平板上基本上沒有菌落長出，而稀釋為10-4倍時，平板上能長出單一的菌落，並挑取在kb培養基上長出單一的菌落，將其命名為pf27菌株，然後在kb液體培養基中擴大培養，做進一步的菌株鑑定。

二、pf27菌株的鑑定

1、pf27菌株的形態鑑定

pf27菌株在kb培養基上培養24h～48h後可形成橙色菌落，菌落狀態呈圓形，表面光滑有凸起邊緣整齊，較粘稠，易挑起。

2、pf27菌株的分子鑑定

提取pf27菌株的dna，採用通用引物eubac27f/eubac1492r進行pcr擴增，得到含有pf27菌株16srdna保守區的pcr產物。引物序列如下：

eubac27f：5』-agagtttgatcctggctcag-3』；

eubac1492r：5』-ggttaccttgttacgactt-3』。

將pcr產物經ta克隆連接到peasy-t3(購買自北京全式金生物有限公司)，以通用引物在英濰捷基公司測序。

測序結果表明：pcr產物的核苷酸序列如序列1所示。將測序所得序列與ncbi資料庫進行blast比對後，通過mega5.1軟體對pf27和其他代表22種不同假單胞菌種的螢光假單胞模式菌株進行系統發育分析，系統發育樹如圖1所示。

綜合上述鑑定結果，確定pf27菌株的分類命名為螢光假單胞菌pseudomonasfluorescens，該菌株已於2017年5月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為cgmccno.14105。

實施例2、微生物pf27菌劑、微生物pf27發酵液和微生物pf27代謝液的製備

1、微生物pf27菌劑的製備

將實施例1中獲得的螢光假單胞菌pf27接種於kb培養基中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養12-16h，然後4000rpm離心20min，棄上清液，收集菌體沉澱，再用滅菌水將菌體沉澱進行稀釋，製成微生物pf27菌劑(菌劑pf27)，微生物pf27菌劑成品中pf27活菌總濃度為1×109-1×1010cfu/ml。

2、微生物pf27發酵液的製備

將實施例1中獲得的螢光假單胞菌pf27接種於kb培養液中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養12-16h，然後4000rpm離心20min，收集上清液，即為微生物pf27發酵液，微生物pf27發酵液成品中pf27活菌總濃度為1×102-1×103cfu/ml。

3、微生物pf27代謝液的製備

將步驟2中微生物pf27發酵液經過0.22μm濾膜過濾(該步驟的目的是除菌)，收集濾液，即為微生物pf27代謝液。

實施例3、微生物pf27菌劑對農業害蟲煙粉蝨的抵抗能力

一、實驗方法

1、番茄植株

(1)將中雜9號番茄種子(中蔬種業科技(北京)有限公司生產)用3％naclo溶液消毒10min後，用ddh2o清洗6次，得到消毒後種子。然後將消毒後種子均勻鋪在滅菌的蛭石泥炭土基質(蛭石和泥炭土按照1:1的比例混勻，121℃高壓滅菌20min)中，在26℃，光照：黑暗(12h:12h)條件下培養種子萌發，待種子萌發生長到兩片真葉時，分別移栽到均勻添加pf27菌劑的蛭石泥炭土基質(每kg蛭石泥炭土基質添加50mlod值為1的pf27菌劑，pf27菌劑使用終濃度為1×105cfu/ml)中和對照(以不添加任何菌劑作為對照，control)的營養穴中。番茄苗移栽到育苗穴盤中(穴盤規格：上口直徑9釐米，下口直徑6釐米，高度8釐米)，放置在溫室中生長(生長條件：光照時間12h，溫度26℃，相對溼度50％)。

(2)將生長到5周左右的番茄植株的單個葉片放置在盎司的塑料杯中(底、高、口徑大小為32mm×34mm×40mm，將塑料杯一側開直徑為5mm左右的開口，用於將煙粉蝨置於杯中；另一側從口徑位置處開2mm左右的開口，用於放置葉柄)，然後將剛孵化的煙粉蝨成蟲(3頭雌成蟲和3頭雄成蟲)從開口處接種到單片番茄葉子，再用透氣的醫用膠帶將其開口封住。10天後統計每個番茄葉片上的產卵量。每個處理8個生物學重複，實驗重複3次。

(3)將生長到5周左右的番茄植株的單個葉片放置在盎司的塑料杯中，將16頭雌成蟲接種到單個番茄葉片上，經過2天的產卵時間，將全部的成蟲移除，22天後統計每個番茄葉片上發育到4齡幼蟲的數量。每個處理8個生物學重複，實驗重複3次。

(4)將生長到5周左右的pf27菌劑處理組和對照組的番茄幼苗分別放置在120目的籠子(40cm×40mm×40mm)的兩側，然後將煙粉蝨成蟲在冰上冷凍2分鐘，每次數100頭煙粉蝨成蟲放置兩株番茄之間，15分鐘後統計兩株番茄上的煙粉蝨的數目，計算煙粉蝨在兩株番茄上的選擇率。選擇率的計算方法：統計100頭煙粉蝨中分別在pf27處理組和對照組植株上的煙粉蝨數目，並且相加得選擇的煙粉蝨數目總和，計算pf27處理組和對照組植株上煙粉蝨所佔選擇的總煙粉蝨百分數。每個處理6個生物學重複，實驗重複3次。

2、馬鈴薯植株

將購買自北京首航超市內的土豆放置在潮溼黑暗的環境中，經過一周後，挑選出芽一致的健康土豆的芽，用70％的酒精滅菌消毒刀片後將其切下。然後將幼芽分別移栽到均勻添加pf27菌劑的滅菌的蛭石泥炭土基質(每kg蛭石泥炭土基質添加50mlod值為1的pf27菌劑，pf27菌劑使用終濃度為1×105cfu/ml)和對照(以不添加任何菌劑作為對照，control)的營養穴中，並置於塑料花盆(規格：上口直徑為14釐米，下口直徑為9.5釐米，高度為12.5釐米)內培養，表面覆蓋一層保鮮膜保溼，待其長出子葉後將保鮮膜去掉，放置自然條件下生長，得到馬鈴薯幼苗。

(2)自然條件下觀察煙粉蝨成蟲在pf27菌劑處理下和對照的馬鈴薯幼苗上的生長狀態及數量。每個處理6個生物學重複，實驗重複3次。

二、抗蟲效果統計

在解剖鏡下統計煙粉蝨在選擇的葉片上的產卵量、發育到4齡幼蟲的數量及煙粉蝨在pf27菌劑處理組和對照組的番茄植株的選擇率。

結果如圖2所示。和對照組相比，微生物pf27菌劑處理組的番茄上煙粉蝨成蟲產卵量和發育到4齡幼蟲的數量顯著降低，產卵量減少約50.11％，發育到4齡幼蟲的蟲量約減少33.51％。煙粉蝨在pf27菌劑處理組和對照組的番茄植株的雙向選擇實驗數據顯示：pf27菌劑處理組的番茄植株對煙粉蝨具有明顯的驅蟲作用，pf27菌劑處理組和對照組的選擇率分別是35.28％和64.72％，驅蟲效果為29.44％。同時在自然狀態下觀察pf27菌劑處理組的馬鈴薯幼苗植株對煙粉蝨的影響，發現微生物pf27菌劑處理的馬鈴薯幼苗上的煙粉蝨數量顯著少於對照組的煙粉蝨數量。

實施例4、微生物pf27菌劑對馬鈴薯黑痣病gs-3的致病力的影響

一、實驗方法

1、馬鈴薯幼苗的種植

將購買自北京首航超市內的土豆放置在潮溼黑暗的環境中，經過一周後，挑選出芽一致的健康土豆的芽，用70％的酒精滅菌消毒刀片後將其切下。然後將幼芽分別移栽到均勻添加菌劑pf27的滅菌的蛭石泥炭土基質(每kg蛭石泥炭土基質添加50mlod值為1的pf27菌劑，pf27菌劑使用終濃度為1×105cfu/ml)和對照(以不添加任何菌劑作為對照，control)的營養穴中，並置於塑料花盆(規格：上口直徑為14釐米，下口直徑為9.5釐米，高度為12.5釐米)內培養，表面覆蓋一層保鮮膜保溼，待其長出子葉後將保鮮膜去掉，放置自然條件下生長，得到馬鈴薯幼苗。

2、菌液配置

將馬鈴薯黑痣病菌gs-3接種到pda培養基上，培養到能夠在顯微鏡下觀察到成熟孢子囊的馬鈴薯黑痣病gs-3，利用含有0.01％吐溫20的蒸餾水衝洗培養皿，收集孢子，製成孢子濃度為1.0×105cfu/ml的gs-3孢子懸浮液，然後在室溫下靜置2～3小時後用於接種。

3、人工接種及病情調查

接種時取4和5葉位的葉頂端10片單葉，將葉柄插在濃度為1％的固體瓊脂培養基上平板內，每個平板內放置兩片單葉，加2ml滅菌的蒸餾水到平板上以保溼，每個單葉片中心滴20μlgs-3孢子懸浮液在葉片的上表面，最後蓋上培養皿蓋，用透氣的醫用膠帶封住，放置在溫度為20℃，光照：黑暗(12h:12h)，溼度為60％的條件下培養。同時以不滴加任何菌液的0.01％吐溫20作為對照。處理第6天調查病斑面積，病斑面積計算公式：s＝(病斑長度×病斑寬度)×π/4。每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。

二、抗病效果統計

結果如圖3所示。和對照組相比，微生物pf27菌劑處理組的馬鈴薯黑痣病gs-3發病降低，病斑面積平均顯著性降低約46.61％。說明微生物pf27菌劑對馬鈴薯黑痣病gs-3有顯著的抗病效果。

實施例5、微生物pf27菌劑對馬鈴薯晚疫病t30-4和88069兩種菌致病力的影響

一、實驗方法

1、馬鈴薯幼苗的種植

同實施例4步驟一中的1。

2、菌液配置

將馬鈴薯晚疫病菌t30-4和88069分別接種到10％v8固體培養基上，20℃黑暗環境培養2～3天後切取大小均勻的菌絲塊，置於20ml的10％v8液體培養基中，於20℃黑暗靜置培養2～3天後將菌絲叢移入無菌的培養皿中，加入適量的滅菌純水，於26℃光照靜置12h左右，即可產生大量遊動孢子囊；利用含有0.01％吐溫20的蒸餾水衝洗培養皿，收集孢子，製成孢子濃度為1.0×105cfu/ml的t30-4懸浮液和88069懸浮液，然後在室溫下靜置2～3小時後用於接種。

3、人工接種及病情調查

人工接種及病情調查同實施例4步驟一中的3。每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。

二、抗病效果統計

結果如圖4所示。和對照組相比，微生物pf27菌劑處理組的馬鈴薯葉片上接種馬鈴薯晚疫病t30-4和88069病原菌後，病斑面積顯著性降低，接種t30-4的病斑面積減少了53.85％，接種88069的病斑面積則減少了79.80％。說明微生物pf27菌劑對馬鈴薯晚疫病t30-4和88069有顯著的抗病效果。

實施例6、微生物pf27發酵液對馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病t30-4和88069的抑菌率的影響

一、實驗方法

1、將pf27發酵液按照1:50的比例加入到已經融化並冷卻至50℃左右的pda培養基中，充分混勻後鋪制平板，得到含有pf27菌劑的pda培養基。同時設置不加任何菌劑的培養基為對照。

將pf27發酵液按照1:50的比例加入到已經融化並冷卻至50℃左右的10％v8培養基中，充分混勻後鋪制平板，得到含有pf27菌劑的v8培養基。同時設置不加任何菌劑的培養基為對照。

2、抑菌實驗

將pda培養基上培養5天的馬鈴薯黑痣病gs-3病原真菌菌落邊緣打取直徑為6mm、生長均勻的菌碟，菌絲面向下，接種於含有pf27菌劑的pda培養基的中央，於20℃恆溫培養。每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。

分別將v8培養基上培養5天的馬鈴薯晚疫病t30-4和88069病原真菌菌落邊緣打取直徑為6mm、生長均勻的菌碟，菌絲面向下，接種於含有pf27菌劑的v8培養基的中央，於20℃恆溫培養。每個處理4個生物學重複，實驗重複3次。

接種後逐日觀察，並用十字交叉方法測量各供試病原真菌在培養基平板上的直徑，並按照下列公式計算抑菌率：抑菌率(％)＝(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100％，菌餅直徑為6mm。抑菌示意圖如圖5所示。

二、抑菌效果統計

結果如表1和圖7所示。在對馬鈴薯的主要病害馬鈴薯黑痣病gs-3、馬鈴薯晚疫病88069和t30-4的抑菌效果中，pf27菌劑對馬鈴薯黑痣病gs-3的抑菌率為82.56％，馬鈴薯晚疫病88069的抑菌率為47.33％，馬鈴薯晚疫病t30-4的抑菌率約為10％。

表1、pf27對馬鈴薯黑痣病、馬鈴薯晚疫病和馬鈴薯瘡痂病的抑菌率統計

實施例7、微生物pf27代謝液對馬鈴薯瘡痂病4.0076、4.1756和4.1789的抑菌率的影響

一、實驗方法

1、將pf27代謝液按照1:50的比例加入到冷卻至40℃左右的lb固體培養基中，混勻後在滅菌的超淨臺中製備固體培養平板，待平板凝固後在平板中央用打孔器打一個直徑為6mm左右的孔，得到實驗組培養基。

將大腸桿菌e.colidh5α在lb液體培養基中，37℃，200rpm振蕩培養12-16h，然後4000rpm離心20min，收集上清液，並將其用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，收集濾液，得到dh5α代謝液；將dh5α代謝液按照1:50的比例加入到冷卻至40℃左右的lb固體培養基中，混勻後在滅菌的超淨臺中製備固體培養平板，待平板凝固後在平板中央用打孔器打一個直徑為6mm左右的孔，得到對照組培養基。

同時在lb固體培養基中央用打孔器打一個直徑為6mm左右的孔，得到空白組培養基。

2、將馬鈴薯瘡痂病病菌4.0076、4.1756和4.1789分別接種到lb液體培養基中，在28℃，200rpm條件下振蕩培養12-16h後，分別獲得馬鈴薯瘡痂病病原菌液4.0076，4.1756和4.1789。取20μl的馬鈴薯瘡痂病病原菌液4.0076，4.1756和4.1789分別加入到步驟1製備的實驗組培養基、對照組培養基和空白組培養基的6mm孔內，逐日觀察，並統計抑菌率。抑菌率(％)＝(空白組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(空白組菌落直徑-菌餅直徑)×100％。處理組分別為實驗組和對照組。菌餅直徑為6mm。

二、抑菌效果統計

結果如表1和圖7所示。pf27代謝液對馬鈴薯的主要病害馬鈴薯瘡痂病的4.0076、4.1576和4.1789平均抑菌率分別達到了49.74％、39.39％和45.47％，而大腸桿菌e.colidh5α對馬鈴薯瘡痂病的4.0076、4.1576和4.1789的平均抑菌率分別只有5.73％、17.37％和11.89％。說明pf27代謝液對馬鈴薯三個細菌病害具有很好的抑菌效果。

綜上所述，pf27菌劑或pf27發酵液或pf27代謝液對馬鈴薯主要病害具有廣譜的抑菌效果。

序列表

中國科學院微生物研究所

螢光假單胞菌pf27在抗煙粉蝨和防治馬鈴薯病害中的應用

1

1

1508bp

dna

人工序列

1

agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagc60

ggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatct120

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gcgatccc1508