葉瓜參多糖a及其在製備防治糖尿病藥物中的應用的製作方法

2023-08-05 17:42:26 2

專利名稱：葉瓜參多糖a及其在製備防治糖尿病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，是葉瓜參多糖A在製備防治糖尿病藥物及保健功能食品中的應用。
背景技術：
糖尿病是一種由遺傳、免疫、毒素和精神等因素作用於機體導致胰島功能減退和胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質。脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂綜合症。研究開發高效的抗糖尿病新藥是 目前醫藥保健中迫切需要解決的課題。葉瓜參(Cucumariafrondosa Gunnerus)屬棘皮動物門(Echinodermata)海參綱(Holothurcidea)枝手目(Dendrochirotida)瓜參科(Cucumariidae)海洋動物。一般體長50mm左右，體呈圓筒狀，體色棕色或黑色，體壁較厚，角質且堅硬，觸手5個。該物種廣泛分布於俄羅斯、加拿大、挪威和英國，我國的南方海域亦有分布。此外從格陵蘭到麻薩諸塞的西大西洋水域也有分布。國外學者曾對該種海參中的多糖類成分有過研究(JohnA. Findlay, Hurettin Yayli. J. Natural Products. 1992，55 (I) : 93-101),但未見有關該多糖類提取物具有抗糖尿病活性的報導。

發明內容
在上述研究結果的基礎上，本申請的發明人進一步對從葉瓜參中所獲得的多糖類提取物的活性進行了深入的研究。本發明首先提供一種葉瓜參多糖A，所述葉瓜參多糖A由D-木糖、L-奎諾糖、D-葡萄糖和3-甲基-O-D-葡萄糖所組成。進一步優選地，所述葉瓜參多糖A中D-木糖、L-奎諾糖、D-葡萄糖和3-0-甲基-D-葡萄糖的克分子比為2:1:1: I。更具體地，本發明所述的葉瓜參多糖A通過下述方法製備①將葉瓜參幹品粉碎至20目，以體積百分含量為60%的乙醇充分提取，提取液減壓回收乙醇後得流浸膏；②將步驟①獲得的流浸膏均勻分散在蒸餾水中，用正丁醇萃取51次，每次所用正丁醇體積與水相體積比為1:2 ;③水相加入其5倍體積量的95%乙醇，離心得到沉澱，並使丙酮洗滌脫水後，將沉澱用蒸餾水溶解，冷凍乾燥，得葉瓜參多糖提取物粗品；④將步驟③所得的葉瓜參多糖提取物粗品溶解於蒸餾水中，先使用分子量5000的超濾膜超濾，濾液再經分子量3000的超濾膜超濾，上層截留液經冷凍乾燥，得分子量3000-5000的葉瓜參多糖A。本發明另一方面提供本發明的葉瓜參多糖A在製備防治糖尿病藥物中的應用。再一方面，本發明的葉瓜參多糖A也可以用於製備具有抗糖尿病功能的保健品，尤其是保健食品。
本發明所提供的關於葉瓜參多糖A對蛋白酪氨酸磷酸酶PTPlB具有顯著的抑制活性，可用於製備防治糖尿病的藥物及保健功能食品，為新的防治糖尿病的藥物及保健功能食品的研製開發提供了重要的參考信息，對開發利用新的海洋藥用生物資源具有重要意義。
具體實施例方式以下非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。下面結合實施例，對本發明作詳細描述，但保護範圍不局限於實施例。如無特殊說明，本發明中用作標準品的D-木糖購自上海恆信化學試劑有限公司，L-奎諾糖和3-0-甲基-D-葡萄糖購自瑞士 FLUKA公司，D-葡萄糖購自美國SUPELC0公司。實施例I I、葉瓜參多糖提取物的製備和鑑定將葉瓜參(Cucumaria frondosa Gunnerus)幹品700克、粉碎至20目，用體積百分含量為60%的乙醇加熱回流提取7次，減壓回收乙醇提取液得流浸膏。將流浸膏均勻分散在200毫升蒸餾水中，用正丁醇萃取6次，每次100毫升；向水層中加入5倍體積量的95%乙醇，離心得沉澱，並用丙酮洗滌脫水後，將沉澱用20毫升蒸餾水溶解，冷凍乾燥，得葉瓜參多糖提取物粗品15. 2克，該粗品為黃色粉末。將上述葉瓜參多糖提取物粗品溶解於100毫升蒸餾水中，採用分子量5000的超濾膜超濾，通過液再經分子量3000的超濾膜超濾，截留液冷凍乾燥，得分子量3000-5000的葉瓜參多糖A 3. 7克。所得的葉瓜參多糖A為白色粉末。2、葉瓜參多糖提取物的組成鑑定①葉瓜參多糖A酸水解取實施例I製備的葉瓜參多糖A 10mg，溶於2M三氟乙酸2ml中，置2ml安瓿中，充氮氣，封管，於烘箱中120°C加熱反應2h後，40°C減壓蒸乾，加甲醇Iml後減壓抽乾以除去三氟乙酸，重複3次，殘渣以二氯甲烷/水為5ml/5ml分配，水層再以5ml 二氯甲烷洗滌I次，取水層水浴上蒸乾，得葉瓜參多糖A的酸水解物；②酸水解物的矽膠薄層色譜分析a.試劑本發明所使用的高效薄層層析板購自煙臺芝罘黃務矽膠開發試驗廠。b.展開劑的配製氯仿甲醇水=30 12 4 (體積比，下同)混合後在分液漏鬥靜置分層，待澄清後取下層澄清液，以下層澄清液乙酸=9 :1作為展開劑。c.顯色劑的配製鄰苯二甲酸I. 6g溶於水飽和的正丁醇IOOml中，加苯胺0. 93g。d.矽膠薄層色譜將步驟①所得的葉瓜參多糖A的酸水解物用水配製成濃度為5mg/ml的溶液，用高效薄層層析板按常規進行矽膠薄層色譜，展開後用苯胺-鄰苯二甲酸顯色劑噴霧，於105°C加熱10分鐘顯色。e.結果矽膠薄層色譜顯示的斑點全為棕色斑點，分別與標準品D-木糖、L-奎諾糖、D-葡萄糖和3-0-甲基-D-葡萄糖的Rf值一致，表明葉瓜參多糖提取物中含有上述4種糖。③葉瓜參多糖A樣品的酸水解產物的氣相-質譜鑑定a.試劑本發明以D-木糖、L-查諾糖、D-匍萄糖和3_0_甲基-D-匍萄糖為標準品。b.製備標準糖糖腈乙酸酯衍生物取上述標準品糖各IOmg分別與IOmg鹽酸羥胺均勻混合，加入0. 5ml吡啶，90°C水浴加熱30分鐘並振蕩，生成糖肟。反應物冷卻至室溫,加入0. 5ml乙酸酐，90° C水浴加熱30分鐘進行乙醯化，即生成各標準糖糖腈乙酸酯衍生物溶液，將溶液減壓濃縮至原體積的1/3，即可用於氣相-質譜分析。
c.製備葉瓜參多糖A的酸水解物糖腈乙酸酯衍生物將步驟①所得的葉瓜參多糖A的酸水解物IOmg與IOmg鹽酸羥胺均勻混合，加入0. 5ml吡啶，90° C水浴加熱30分鐘，生成糖肟。反應物冷卻至室溫，加入0. 5ml乙酸酐，90° C水浴加熱30分鐘，生成葉瓜參多糖A酸水解物糖腈乙酸酯衍生物溶液。將溶液減壓濃縮至原體積的1/3，即可用於GC-MS分析。d.糖腈乙酸酯衍生物的氣相-質譜分析條件檢測儀器美國Finnigan Voyager氣相色譜_質譜聯用儀檢測條件
色譜柱 HP-5石英毛細管色譜柱(30 mxQ.25 mm, 0.25 pm)
柱溫 150 0C (保持2分鐘)-300 0C (保持10分鐘)
升溫速度 15 °C/分鐘汽化溫度 250 °C進樣量 I^il
載氣(流量)氦氣(1.0 ml/分鐘)
分流比 30: I
質譜檢測器EI電離源、電離電壓70 eV、源溫200 0C質譜標準庫NIST庫e.氣相-質譜分析結果葉瓜參多糖A的酸水解物氣相-質譜分析顯示與上述4種標準糖的氣相-質譜分析有相同的吸收峰，表明葉瓜參多糖A由上述4種糖所組成。從峰面積推算糖的克分子比為；D-木糖L-奎諾糖D-葡萄糖3-0-甲基-D-葡萄糖=2:1:1: I。實施例2.葉瓜參多糖提取物的活性檢測蛋白酪氨酸磷酸酶PTPlB試驗PTP1B是第一個被鑑定的蛋白酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatase),通過PTPlB剔除的老鼠實驗表明，PTPlB通過對胰島素受體的脫磷醯化，進而在調節胰島素敏感性和脂肪代謝過程中起著非常重要的作用。因而，選擇性的、高活性的PTPlB抑制劑在糖尿病和肥胖症的治療中有重要的價值。
篩選方法PTP1B為應用大腸桿菌表達系統得到GST融合蛋白。採用光吸收檢測法，在96孔平底透明微孔板中加入實施例I中所獲得的葉瓜參多糖A樣品，濃度為20 u g/ml、設3個復孔。並設相應濃度的生理鹽水溶媒對照。樣品用DMSO溶解，低溫保存，DMSO在最終體系中的濃度控制在不影響檢測活性的範圍之內。底物PNPP經PTPlB水解得到的游離產物通過酶標儀監測405nm處光吸收強度，計 算得百分抑制率。計算所用軟體為GraphpadPrism4。實驗中採用的陽性對照化合物為釩酸鈉。試驗結果葉瓜參多糖A的抑制率為94. 57%，表明葉瓜參多糖A對蛋白酪氨酸磷酸酶PTPlB具有顯著的抑制活性，可用於製備防治糖尿病的藥物及保健功能食品。
權利要求
1.葉瓜參多糖A，其特徵在於所述的葉瓜參多糖A由D-木糖、L-奎諾糖、D-葡萄糖和3-甲基-O-D-葡萄糖所組成。
2.權利要求I所述的葉瓜參多糖A，其特徵在於所述的D-木糖、L-奎諾糖、D-葡萄糖和3-0-甲基-D-葡萄糖的克分子比為2:1:1: I。
3.權利要求廣2中任ー權利要求所述的葉瓜參多糖A在製備防治糖尿病藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開一種葉瓜參多糖A及其在製備防治糖尿病藥物中的應用。自葉瓜參得到的葉瓜參多糖A由D-木糖、L-奎諾糖、D-葡萄糖和3-甲基-O-D-葡萄糖所組成。對蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B具有顯著的抑制活性，可用於製備防治糖尿病的藥物及保健功能食品，為新的防治糖尿病的藥物及保健功能食品的研製開發提供了重要的參考信息，對開發利用新的海洋藥用生物資源具有重要意義。
文檔編號C08B37/00GK102731675SQ20121024642
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月16日 優先權日2012年7月16日
發明者易楊華, 焦健, 邵俊傑 申請人:大連海晏堂生物有限公司