免疫調節肽的製作方法

2023-08-05 12:44:51

專利名稱：免疫調節肽的製作方法
背景技術：
發明領域本發明涉及免疫調節肽。在吞噬細胞如嗜中性白細胞以及單核細胞中表達的甲醯基肽受體家族(甲醯基肽受體(FPR)和類甲醯基肽受體1(FPRL1))，在宿主防禦病原體感染中起重要作用(1，2)。已知該受體與百日咳毒素-敏感Gi蛋白偶聯(1，2)。FPR的激活誘導Gβγ亞基從Gαi亞基上解離，並且βγ--亞基調節磷脂酶Cβ或肌醇磷脂3-激酶的激活(1，2)。這些效應分子的激活誘導複雜的下遊信號傳導，導致多種細胞響應，如趨化遷移、脫粒以及超氧化物的產生。
相關技術描述大多數完全激動劑誘導許多複雜的細胞信號，引起最終的複雜的免疫反應。在這些免疫反應中，許多反應是宿主細胞清除入侵的病原體的適當功能所基本必需的，但是一些反應是免疫反應中不必要的副作用。在藥物發展領域，減少或消除候選藥物的副作用已經成為研究的熱點。為實現這一目標，許多研究組試圖通過幾種方法開發出特定受體的選擇性免疫反應調節劑或選擇性拮抗劑(3，4)。
從內源或人工合成途徑，已經識別出多種FPR激動劑(1，2)。包括細菌肽類(N-甲醯基-甲硫氨醯基-亮氨醯基-苯丙氨酸(fMLF))，HIV-包膜結構域(T20和T21)，以及宿主源性的激動劑(AnnexinI和Aβ42)(5-7)。此前，本發明的發明者報導了一種合成肽配體，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(在下文中，以＂WKYMVm＂表示)，可以刺激白細胞，如單核細胞和嗜中性白細胞(8-11)。Le等證實WKYMVm可以與甲醯基肽受體(FPR)和類甲醯基肽受體1(FPRL1)結合(12)。由於WKYMVm是一種對廣譜受體有高度親和力的短肽，因此它可以作為研究FPR-或FPRL1-介導的信號傳導的有用物質。但是，對針對特定受體進形的選擇性免疫調節劑或選擇性拮抗劑，以及分子多樣性的篩選的研究，僅由小分子化合物組成，因此非常有限，所以還需要繼續識別新化合物。
發明概述本發明的第一個目標是提供新穎免疫調節肽，其胺基酸序列選自SEQID NO1～SEQ ID NO24；或衍生自肽的物質，所述肽的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24。
第二個目標是提供一種藥物組合物，包括胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽；或衍生自肽的物質，所述肽的胺基酸序列選自SEQID NO1～SEQ ID NO24。
第三個目標是提供一種來治療由白細胞數或活化狀態改變伴隨或引起的疾病(condition)的方法，所述方法包括給予所需治療的宿主施用治療有效量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質。
第四個目標是提供一種增加宿主白細胞數量或增強白細胞的活化狀態的方法，這種方法包括給予需要更大量白細胞或更強的白細胞活化狀態的宿主以治療有效量的肽，該肽胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質。
第五個目標是為需要這樣治療的病人提供一種誘導白細胞中細胞外鈣增加的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
第六個目標是為需要這種治療的病人提供一種誘導人單核細胞或嗜中性白細胞中超氧化物產生的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
第七個目標是為需要這種治療的病人提供一種誘導人外周血單核細胞趨化遷移的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
第八個目標是為需要這種治療的病人提供一種誘導甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中脫粒反應的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
第九個目標是為需要這種治療的病人提供一種分別與WKYMVm競爭結合甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞上甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1的肽的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
第十個目標是為需要這種治療的病人提供一種刺激甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中細胞外信號調節蛋白激酶或甲醯基肽(peptiin)的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
第十一個目標是為需要這樣治療的病人提供一種刺激甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中Akt的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
第十二個目標是提供一種分離的核苷酸，所述核苷酸編碼胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽。
第十三個目標是提供一種包含分離核苷酸的載體，所述核苷酸編碼胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽。
本發明其它的特點及優點，結合下文描述以及附圖將可以明顯地看出，其中在附圖中類似的參考字符表示相同的或相似的部分。
附圖簡述附圖，引入到並構成說明書的一部分，舉例說明了本發明的實施方案，並與說明書一起，共同解釋本發明的原理。


圖1顯示WKYMVm、本發明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)或fMLF對FPR-表達的RBL-2H3細胞(A)或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞(B)中的[Ca2+]i的效果；圖2顯示WKYMVm、本發明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)以及fMLF對結合到FPR或FPRL1上的1251-標記的WKYMVm置換；圖3顯示WKYMVm、本發明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm，對FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞中ERK磷酸化的的影響；圖4顯示WKYMVm、本發明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm，對FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞中Akt磷酸化的的影響；圖5顯示WKYMVm通過細胞內鈣增加刺激FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞的細胞外分泌；圖6顯示WKYMVm、本發明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm，對N-甲醯基-甲硫氨醯基-亮氨醯基-苯基丙氨酸(fMLF)的細胞外分泌效果、對肽-誘導的[Ca2+]增加的影響。
圖7顯示WKYMVm通過P13K和MEK的活性，刺激FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞的趨化遷移；以及圖8顯示WKYMVm、本發明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm對趨化性的影響。
優選實施方案的詳細描述甲醯基肽受體(FPR)和類甲醯基肽受體1(FPRL1)在免疫反應中發揮重要作用。本發明提供衍生自WKYMVm的肽類。許多肽可以刺激FPR或FPRL1導致鈣的增加，但是本發明的肽，如WKGMVm、WKRMVm和6thD-Met替代的肽只使FPRL1-表達的細胞中的鈣增加，而不會使FPR-表達的細胞中的鈣增加。應用125I-WKYMVm的競爭實驗表明許多肽不但使FPR-表達的細胞中的鈣增加，而且WKGMVm、WKRMVm以及6thD-Met替代的肽也可以與125I-WKYMVm競爭結合FPR。與磷脂酶C-調節的鈣增加不同，WKGMVm、WKRMVm和6thD-Met替代的肽可以刺激FPR-表達的細胞中的細胞外調節蛋白激酶(ERK)和Akt激活。WKYMVm的功能性結果是，該肽通過Ca2+和ERK通路，可以分別刺激FPR細胞中的脫粒作用和細胞的趨化作用。肽類，如WKGMVm、WKRMVm和6thD-Met替代的肽，只是通過誘導趨化遷移刺激FPR細胞，但是沒有脫粒作用。綜合來看，本發明第一次證實了，作為重要趨化物化學引誘受體，FPR可以按照配體-特異的方式被不同的肽配體進行差異調節。
根據本發明第一優選實施方案，本發明的肽包括選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的胺基酸序列或衍生自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質。SEQ ID NO1～SEQ ID NO24如下所述Trp-Lys-Gly-Met-Val-D-Met-NH2(WKGMVm；SEQ ID NO1)，Trp-Lys-Tyr-Met-Gly-D-Met-NH2(WKYMGm；SEQ ID NO2)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Gly-NH2(WKYMVG；SEQ ID NO3)，Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WRYMVm；SEQ ID NO4)，Trp-Glu-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WEYMVm；SEQ ID NO5)，Trp-His-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WHYMVm；SEQ ID NO6)，Trp-Asp-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WDYMVm；SEQ ID NO7)，Trp-Lys-His-Met-Val-D-Met-NH2(WKHMVm；SEQ ID NO8)，Trp-Lys-Glu-Met-Val-D-Met-NH2(WKEMVm；SEQ ID NO9)，Trp-Lys-Trp-Met-Val-D-Met-NH2(WKWMVm；SEQ ID NO10)，Trp-Lys-Arg-Met-Val-D-Met-NH2(WKRMVm；SEQ ID NO11)，Trp-Lys-Asp-Met-Val-D-Met-NH2(WKDMVm；SEQ ID NO12)，Trp-Lys-Phe-Met-Val-D-Met-NH2(WKFMVm；SEQ ID NO13)，Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-D-Met-NH2(WKYMYm；SEQ ID NO14)，Trp-Lys-Tyr-Met-(Phe/Trp)-D-Met-NH2(WKYM(F/W)m；SEQ ID NO15)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu-NH2(WKYMVE；SEQ ID NO16)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Val-NH2(WKYMW；SEQ ID NO17)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg-NH2(WKYMVR；SEQ ID NO18)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Trp-NH2(WKYMVW；SEQID NO19)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-NH2(WKYMV；SEQ ID NO20)，Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(KYMVm；SEQID NO21)，
Lys-Tyr-Met-Val-NH2(KYMV；SEQ ID NO22)，Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(YMVm；SEQ ID NO23)，以及Met-Val-D-Met-NH2(MVm；SEQ ID NO24).
SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽類以分離和基本上純淨的形式存在。
所述肽包括任選在羧基上被-NH2取代的胺基酸殘基。
本發明的肽至少有一種以下特性(a)由人單核細胞或嗜中性白細胞誘導超氧化物的產生；(b)由人外周血單核細胞或嗜中性白細胞誘導的細胞內鈣增加；(c)與甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1結合；(d)體外誘導人單核細胞或嗜中性白細胞的趨化遷移；(e)誘導甲醯基肽受體表達的細胞或類甲醯基肽受體1表達的細胞的脫粒作用；(f)通過激活甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1刺激細胞外信號-調節蛋白激酶磷酸化；以及(g)通過激活甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1刺激Akt磷酸化。
根據本發明第二優選實施方案，本發明提供了一種藥物組合物，包括胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質。
包括作為活性成分的肽或物質的所述組合物，可以包括超過一種藥用稀釋劑，選自鹽水、緩衝鹽、葡萄糖、水、甘油或乙醇，而且稀釋劑不限於這些。
組合物可以按照疾病和劑量，有不同的應用。應該理解活性成分的實際用量應該考慮相關因素來決定，包括治療的疾病、病人症狀的嚴重程度、與其它藥物組合應用(例如，化療藥物)、年齡、性別、病人的體重、飲食、給藥時間、選擇的給藥途徑以及組合物的比例。即使給藥劑量和途徑根據疾病的類型和嚴重程度進行調整，每天組合物仍可以單劑量或分為1-3次劑量給藥。
包含本發明肽或物質的組合物可以經口服或胃腸外途徑給藥。胃腸外給藥是指經除口外的其它途徑給藥，包括經直腸、靜脈、腹膜內和肌肉、動脈內、皮膚、鼻腔、吸入、經眼以及皮下導入給藥。
包含肽或物質的藥物製劑可以製成任何形式，如口服劑型、注射溶液或局部給藥劑型。
藥物劑型優選製成口服和可注射給藥的形式(真溶液、混懸劑或乳劑)以及最優選的口服形式，如片劑、膠囊、軟膠囊、水劑、藥丸、顆粒等。
在劑型製備中，肽可以直接加入軟膠囊而沒有任何賦型劑，或與載體混合或稀釋之後製成適當的劑型。合適的載體的實例有澱粉、水、鹽水、林格氏溶液、葡萄糖等。
根據本發明第三優選實施方案，提供了治療白細胞數量或活化狀態改變伴隨或導致的疾病的方法。所述方法包括對需要此種治療的宿主，施用治療有效量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24序肽的物質。疾病狀況可以是細菌、支原體、酵母、真菌、病毒感染或炎症反應。
根據本發明第四優選實施方案，提供了一種增加白細胞數量或提高白細胞活性狀態的方法。所述方法包括對需要更大量或更強活性白細胞的宿主給藥，施用治療有效量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24序肽的物質。
根據本發明第五優選實施方案，為需要這樣治療的病人提供一種誘導白細胞中細胞外鈣增加的方法。這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
根據本發明第六優選實施方案，為需要這種治療的病人提供一種誘導人單核細胞或嗜中性白細胞中超氧化物產生的方法。這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
根據本發明第七優選實施方案，為需要這種治療的病人提供一種誘導人外周血單核細胞趨化遷移的方法。這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
根據本發明第八優選實施方案，為需要這種治療的病人提供一種誘導甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中脫粒反應的方法。這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ IDNO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
根據本發明第九優選實施方案，為需要這種治療的病人提供一種分別與WKYMVm競爭結合甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞上甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1的肽的方法。這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
根據本發明第十優選實施方案，為需要這種治療的病人提供一種刺激甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中細胞外信號調節蛋白激酶的方法。這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
根據本發明第十一優選實施方案，為需要這樣治療的病人提供一種刺激甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中Akt的方法，這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ IDNO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
在上述第三到十一優選實施方案中，被治療的宿主或病人可能受到由於感染所致疾病的侵擾，特別是巨細胞病毒感染、類風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療(adoptive immune therapy)、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
本發明提供了分離的核苷酸，所述核苷酸編碼具有包括SEQ ID NO1～SEQ ID NO24胺基酸序列的肽。
本發明提供了包含分離的核苷酸的載體，所述核苷酸編碼包括SEQ IDNO1～SEQ ID NO24胺基酸序列的肽。
本發明提供了包含選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24胺基酸序列的多肽。
本發明將參考下列實施例進行更詳細的解釋。但是，這些例子在任何意義上都不能被解釋為本發明範圍的限制。
實施例中所用的材料Fmoc(保護的)胺基酸來自Millipore(Bedford，MA)。Rapidamide樹脂購自Dupont(Boston，MA)。外周血單核細胞(PBMC)分離培養基(Histopaque-1077)、細胞色素c和fMLF購自Sigma(St.Louis，MO)。Fura-2五乙醯氧基甲酯(fura-2/AM)購自Molecular Probes(Eugene，OR)。RPMI1640來自Life Technologies(Grand Island，NY)。已透析的胎牛血清和補充的牛血清購自Hyclone Laboratories Inc.(Logen，UT)。PTX、GF109203X和PD98059購自Calbiochem(San Diego，CA)。LY294002購自BIOMOLresearch laboratories，Inc.(Polymouth Meeting，PA)。
用上面描述的固相方法合成肽(8，9)。簡而言之，肽在rapidamide支撐樹脂上合成，並在酸敏感連接基上按照標準的Fmoc/叔丁基方法進行合成。通過前述(8)胺基酸分析確定肽的組成。
按照上述方法(13)，用補加20％FBS和200g/ml的G418的DMEM來進行RBL-2H3、FPR-表達的RBL-2H3和FPRL1-表達的RBL-2H3細胞的培養。
實施例1嗜中性白細胞分離濃縮外周血白細胞由Ulsan Red Cross Blood Center(Ulsan，Korea)贈送。根據上述(9)的葡聚糖沉澱、紅細胞低滲性裂解以及淋巴細胞梯度介質分離的標準方法分離出人嗜中性白細胞。分離的人嗜中性白細胞立即應用。
實例2肽對人嗜中性白細胞中超氧化物產生的影響測定了肽WKYMVm、SEQ ID NOs1～24的肽以及wkymvm對人嗜中性白細胞中超氧化物產生的活性。通過利用微量滴定96-孔板ELISA讀板器(Bio-Tekinstruments，EL312e，Winooski，VT)測定細胞色素c的減少，從而量化超氧化物陰離子的產生，方法如(14)中描述。人嗜中性白細胞(96-孔板每孔中含1×106細胞/100μl的RPMI1640培養基)與50μM細胞色素c在37℃預溫育1分鐘，然後與指定濃度的肽一起溫育。通過測定550nm處光吸收的變化進行超氧化物產生的測量，1分鐘間隔測定一次，測定5分鐘。每一位置上至少進行四個獨立實驗選擇有活性的胺基酸肽類。這些結果顯示在表I中。
用不同濃度的肽刺激嗜中性白細胞，發現WKYMVm以濃度依賴方式引起超氧化物的產生，用100nM的肽時活性最大(數據沒有顯示)。當一些肽，如WRYMVm、WEYMVm、WKFMVm以及KYMVm刺激細胞內超氧化物產生時，許多肽在用100nM的濃度時產生超氧化物的活性活性較弱。
表I.肽對人嗜中性白細胞中超氧化物產生的影響a
a通過監測細胞色素c的減少測量超氧化物產生。
b處理肽的濃度為100nM。
也測量了濃度為10μM的肽對超氧化物產生的影響。結果顯示在表II中。除wkymvm外，所有的肽在10μM濃度時刺激超氧化物產生的活性與WKYMVm一樣強。其中WKWMVm、WKFMV以及WKYMVW顯示出比WKYMVm更強的活性。
表II.肽對人嗜中性白細胞中超氧化物產生的影響a
a通過監測細胞色素c的減少測量超氧化物產生。
b處理肽的濃度為10μM。
實施例3肽對FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞中[Ca2+]i增加的影響測量了FPR-表達的RBL-2H3細胞中肽WKYMVm、序列為SEQ IDNOs1～24的肽以及wkymvm對[Ca2+]i增加的活性。用10μM的每種肽刺激FPR-表達的RBL-2H3細胞，然後測量[Ca2+]i。[Ca2+]i的水平利用Grynkiewicz的螢光方法用fura-2/AM測量(15)。簡而言之，製備的細胞用3μMfura-2/AM在新鮮無血清的RPMI1640培養基中37℃溫育50分鐘，持續搖動。每一個分析中，將2×106細胞等分到無Ca2+的Locke′s溶液(154mMNaCl，5.6mM KCl，1.2mM MgCl2，5mM HEPES，pH7.3，10mM葡萄糖，以及0.2mM EGTA)中。測量在雙激發波長340nm和380nm以及500nm發射波長處的螢光變化，並將校正後的螢光比轉化為[Ca2+]i。監測增加的[Ca2+]i的峰水平。結果顯示在表III和圖1A中。數據為三個獨立實驗的代表。
表III.肽對FPR-表達的RBL-2H3細胞中細胞內鈣增加的影響a
a從負載了fura-2的細胞上監測細胞內鈣的增加。
在FPR-表達的RBL-2H3細胞中，WKYMVm肽以濃度依賴的方式誘導[Ca2+]i的增加，最大活性濃度約為300nM(數據未顯示)。WKYMVm對FPR細胞中[Ca2+]i的增加活性的EC50為47nM(表III)。在本發明的肽中，儘管WHYMVm、WKWMVm以及WKFMVm與肽WKYMVm相比，顯示出對FPR更高的親和力，其它肽顯示出的活性不如WKYMVm(表III)。尤其是，WKGMVm、WKYMGm以及6thD-Met置換的肽沒有產生[Ca2+]i的增加，直到用20μM的濃度處理FPRL1-表達RBL-2H3細胞(表III和圖1A)。N-端和C-端截短的肽對FPR中的[Ca2+]i增加也無活性(表III)。這些結果表明Tyr3和D-Met6對[Ca2+]i增加中的FPR激活至關重要。
在FPRL1-表達的RBL-2H3細胞中，檢測了肽WKYMVm、序列為SEQID NOs1～24的肽以及wkymvm對[Ca2+]i增加的影響。FPRL1-表達的RBL-2H3細胞用10μM的各肽刺激，並測定了[Ca2+]i。[Ca2+]i的水平用上述同樣的方法進行測定。檢測[Ca2+]i的峰水平。結果顯示在表IV和圖1B中。數據為三個獨立實驗的代表。
在FPRL1-表達RBL-2H3細胞中，10μM濃度的WKYMVm顯示出了最大活性(數據未顯示)。WKYMVm對FPRL1細胞中[Ca2+]i增加活性的EC50為0.6nM(表IV)。與FPR細胞中不一樣的是，所有的肽對FPRL1細胞中[Ca2+]i的增加都是有活性的(表IV)。一些肽，如WRYMVm、WKWMVm、WKFMVm、WKYMYm以及WKYM(F/W)M對FPRL1顯示出高親和力(表IV)。在FPR細胞中不影響[Ca2+]i增加的WKGMVm、WKYMGm以及6thD-Met置換的肽，在FPRL1細胞中也顯示出[Ca2+]i增加的活性，具有對FPRL1較低的親和力(表IV和圖1B)。N-端和C-端截短的肽也刺激FPRL1中的[Ca2+]i增加(表IV)。這些結果表明，相對於FPR的激活而言，Tyr3和D-Met6對[Ca2+]i增加中的FPRL1激活的重要性要差一些。
表IV.肽對FPRL1-表達的RBL-2H3細胞中中細胞內鈣增加的影響a
a從負載了fura-2的細胞上監測細胞內鈣的增加。
實施例4肽對[125I]WKYMVm與FPR或FPRL1結合的影響基於一些肽(WKGMVm、WKRMVm、D-Met6置換肽)不能誘導胞質鈣增加的發現，需要進一步判斷肽是否能與FPR結合。檢測了肽對結合到FPR或FPRL1的125I-標記WKYMVm的置換情況。FPR-表達RBL-2H3細胞與[125I]WKYMVm，在無或有遞增量的未標記WKYMVm或SEQ ID NOs1～24肽存在下一起溫育。
配體結合分析按照前述報導的改良方法進行(16)。放射碘標記的WKYMVm(125I-標記)購自NEN Lifesciences(Boston，MA)。簡言之，FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞按照每孔1×105細胞分配到24-孔板中，並培養過夜。用阻斷緩衝液(33mM HEPES，pH7.5，0.1％BSA的RPMI)對細胞阻斷2小時後，在有或無50μM未標記肽存在下，將單濃度的125I-標記的WKYMVm與結合緩衝液(含0.1％BSA的PBS)一起加到細胞中，並在持續振蕩狀況下4℃溫育3小時。然後將樣品用冰冷的結合緩衝液洗滌5次，並向每孔中加入200μl的裂解緩衝液(20mM Tris，pH7.5，1％Triton X-100)。室溫裂解20分鐘後，收集裂解液。用γ-線記數器測量結合的125I-標記WKYMVm的放射活性。
配體結合分析結果顯示在圖2中。如圖2中所示，不僅未標記的WKYMVm而且WKGMVm、WKRMVm以及D-Met6置換肽的WKYMVm以濃度依賴的方式，抑制[125I]WKYMVm的結合。這些結果表明，儘管WKGMVm、WKRMVm、或WKYMVm的D-Met6-置換肽能結合到FPR，所有的肽不能誘導FPR-表達RBL細胞中的胞質鈣增加。
實施例5肽對FPR或RPRL1表達RBL-2H3細胞中ERK磷酸化的影響i)用肽刺激細胞培養的RBL-2H3細胞等分成2×106細胞，並用標明濃度的WKYMVm和本發明的肽刺激指定長的時間。FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞用1μM的WKYMVm刺激不同的時間(圖3A)。在用1μM的WKYMVm處理之前，兩種細胞用下列溶液進行預溫育，用溶媒(vehicle)或100ng/ml的PTX(24小時)、50μM的LY294002(15分鐘)、5μM的GFX(15分鐘)、10μMBAPTA/AM(60分鐘)或50μMPD98059(60分鐘)(圖3B)。FPR-或FPRL1-表達的RBL2H3細胞分別用10μM的本發明肽刺激2分鐘或5分鐘(圖3C)。
刺激後，用無血清的RPMI洗滌細胞，並用裂解緩衝液(20mM Hepes，pH7.2，10％甘油、150mM NaCl，1％ Triton X-100，50mM NaF，1mMNa3VO4，10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽，以及1mM苯甲基磺醯氟)進行裂解。離心沉澱去垢劑不溶物(12,000Xg，15分鐘，4℃)，並且將溶解的上清級分移出，並在-80℃儲存或立即使用。裂解液中的蛋白質濃度用Bradford蛋白質分析試劑進行測定。
ii)電泳及免疫印跡分析將每個樣本(含30g蛋白質)進行10％SDS-PAGE分離，並且磷酸化ERK用抗-磷酸-ERK抗體通過免疫印跡分析進行測定。通過利用濃縮樣本緩衝液，進行電泳，製備蛋白質樣品。樣品中的部分然後用Laemmli描述的緩衝系統，通過10％SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行分離(17)。
電泳後，用抗-ERK2抗體進行蛋白印跡分析以確證在實驗中所用的樣品量相同。然後將蛋白質印跡到硝酸纖維素膜上。然後通過用含5％脫脂奶粉TBS(Tris-緩衝鹽溶液，0.05％Tween-20)溫育，封閉硝化纖維膜。隨後，膜的抗-磷酸-ERK抗體、抗-磷酸-Akt抗體或抗-Akt抗體進行溫育，用TBS洗滌。進行PKC轉位(translocation)分析的時候，用PKC同工酶特異的抗體進行溫育。抗原-抗體複合物通過下列方式顯色，將膜與1∶5000稀釋的偶聯到辣根過氧化酶的山羊抗-兔IgG或山羊抗-小鼠IgG抗體進行溫育，並用增強的化學發光檢測體系進行。
iii)結果評價了肽對FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞中，通過FPR或RPRL1的細胞轉導的影響，結果在圖3中顯示。圖3的結果是3個獨立實驗的代表。
既然，儘管一些肽能與FPR結合，它們不能刺激PLC-介導的鈣增加，考察了它們對一些GPCRs下遊的其它信號傳導(ERKs和Akt)的影響，所述的其它信號傳導獨立於PLC。用1μM WKYMVm刺激FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞，誘導瞬時的ERKs激活，表明用肽處理後，分別在2分鐘或5分鐘出現最大活性(圖3A)。當在用WKYMVm刺激之前，用數種抑制劑對FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞進行預處理，WKYMVm-誘導ERKs激活對PTX和PD98059敏感，表明該事件是PTX-敏感的G-蛋白質並且是MEK-依賴性的(圖3B)。P13K抑制劑(LY294002)、PKC抑制劑(GF109203X或Ro-31-8220)或鈣螯和劑(BAPTA/AM)的預處理不能產生WKYMVm-誘導的ERK激活(圖3B)。這表明該事件獨立於P13K、Ca2+和PKC激活。因此看來WKYMVm通過獨立信號傳導途徑誘導[Ca2+]i增加和ERK激活。用抗-磷酸-ERKs抗體通過蛋白印跡分析考察了本發明的肽對ERK激活的影響。與胞質鈣增加活性不一樣的是，肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVR和WKYMVE)刺激FPR-表達RBL-2H3細胞中的ERKs磷酸化(圖3C)。應該注意地是這些肽不能影響PLC-介導的[Ca2+]i增加活性，這是一個非常有趣的結果。當FPRL1-表達RBL-2H3細胞用WKYMVm和本發明的肽進行刺激的時候，大多數所述肽也引起FPRL1細胞中的ERKs磷酸化(圖3C)。該結果與前述結果相關，所有的肽能刺激FPRL1-表達細胞中的胞質鈣增加(圖1B)。
實施例6肽對FPR-或RPRL1-表達RBL-2H3細胞中Akt磷酸化的影響眾所周知，激活的趨化物受體經P13K誘導Akt的激活(19)。用肽刺激細胞，按照實施例5中同樣的方法進行電泳和免疫印跡分析。
FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞用1μM WKYMVm刺激不同的時間(圖4A)。在用1μM的WKYMVm處理之前，兩種細胞用溶媒或100ng/ml的PTX(24hr)、50μM的LY294002(15分鐘)、5μM的GFX(15分鐘)、10μM的BAPTA/AM(60分鐘)或50μMPD98059(60分鐘)進行預溫育(圖4B)。FPR-和FPRL1-表達RBL2H3細胞用10μM的WKYMVm和本發明的肽分別刺激2分鐘或5分鐘(圖4C)。將每一種樣品(30μg的蛋白質)進行10％SDS-PAGE，並抗-磷酸-Akt抗體通過免疫印跡分析對磷酸化Akt進行測定。通過用抗-Akt抗體進行的蛋白印跡分析來確證用於實驗中同樣量的樣品。結果顯示在圖4中。圖4的結果為3個獨立實驗的代表。
觀察到在FPR-和FPRL1-表達RBL-2H3細胞中，WKYMVm刺激誘導的Akt磷酸化是時間依賴方式的(圖4A)。WKYMVm-誘導Akt磷酸化對PTX、LY294002敏感，但對GFX和BAPTA/AM不敏感，表明該事件為PTX-敏感性的G-蛋白質以及P13K-依賴性(圖4B)。不僅用WKYMVm而且用本發明肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE和WKYMVR)對FPR-表達RBL-2H3細胞進行刺激，可以引起Akt磷酸化(圖4C)。WKYMVm和本發明肽也可以刺激FPRL1-表達RBL-2H3細胞中的Akt磷酸化(圖4C)。這些結果與肽在兩種細胞中的ERKs磷酸化相關聯(圖3C)。由於WKYMVm-誘導的ERKs和Akt激活通過P13K激活而介導，似乎WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE和WKYMVR成功地誘導FPR下遊的P13K-介導的信號傳導。
實施例7肽對胞吐作用(exocytosis)的影響顆粒分泌是肥大細胞最重要的功能之一(20)。通過按照上述方法(18)檢測β-氨基己糖苷酶分泌，考察WKYMVm對顆粒分泌的影響。簡言之，表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞(2×105/well)在24-孔組織培養板中培養過夜。將細胞用Tyrode′s緩衝液(137Mm NaCl，12mM NaHO3，5.6mM葡萄糖，2.7mM KCl，1Mm CaCl2，0.5mM MgCl2，0.4Mm NaH2PO4，0.1g/100ml BSA以及25mM HEPES，pH7.4)洗滌，並用各種肽進行刺激。用各種濃度的WKYMVm處理FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞(圖5A)。在有或無10μMBAPTA/AM存在的條件下，用1μM的WKYMVm刺激兩種細胞系(圖5B)。該反應刺激20分鐘後，通過將其置於冰上進行終止。分泌到培養基中的β氨基己糖苷酶按照下列方法測定，將50μl上清液或細胞裂解液與25μl的5mM對硝基苯基-N-乙醯基-對-D-葡糖胺的0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.8)在37℃溫育2小時。在溫育結束時，加入50μl的0.4M的Na2CO3。測量405nm處的吸光度。結果顯示在圖5中。數據為三重實驗的平均值±S.E.。數值(平均值±S.E.)表示為細胞中總β-氨基己糖苷酶的百分比。
多種濃度WKYMVm對FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞進行刺激的時候，所引起的β-氨基己糖苷酶釋放是以濃度依賴的方式進行的(圖5A)。在FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞中，用100nM或10nM肽刺激時，分別可以顯示出最大活性(圖5A)。已經有報導指出胞質鈣增加對肥大細胞如RBL-2H3中顆粒分泌非常關鍵(18，20)。也證實了，用肽刺激之前，通過BAPTA/AM處理的細胞內鈣螯合幾乎完全抑制WKYMVm-誘導的顆粒分泌(圖5B)。
從這些新發現可知，WKYMVm和許多WKYMVm的置換肽可誘導胞質鈣釋放，但一些卻不能(WKGMVm、WKRMVm、D-Met6置換肽)，考察了RBL細胞中這些肽對顆粒分泌的影響。用10μM的各肽處理FPR-(圖6A)或FPRL1-表達RBL-2H3細胞(圖6B)。按照上述方法測定肽-誘導β-氨基己糖苷酶的分泌。數據為三重實驗的平均值±S.E.。
當用肽(WKYMVm、WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)刺激FPR細胞時，可以觀察到一些置換肽的顆粒分泌作用，但WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Mets-置換肽除外(圖6A)。WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Met6-置換肽不能影響FPR-表達RBL-2H3細胞中的顆粒分泌(圖6A)。這些結果與前述結果完全關聯，WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Met6-置換肽不能誘導胞質鈣釋放(圖1A)。與FPR-表達RBL-2H3細胞中不一樣的情況是，所有肽(WKYMVm、WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)，但不包括fMLF或wkymvm，刺激FPRL1-表達RBL-2H3細胞中的顆粒分泌(圖6B)。該結果也與前述結果良好關聯，肽刺激FPRL1-表達RBL-2H3細胞中的胞質鈣增加(圖1B)。
實施例8肽對細胞趨化性的影響用多孔室進行趨化性分析(改進的Boyden室分析)(Neuroprobe Inc.，Gaithersburg、MD)(18)。簡言之，聚碳酸酯濾器(8μm孔徑)用50μg/ml的大鼠I膠原質(Collaborative Biomedicals)的HEPES-緩衝的RPMI1640培養基進行預包被。將乾燥包被的濾器放置在含不同濃度肽的96-孔室中。將表達FPR或FPRL1的RBL-2H3細胞懸浮在RPMI中，濃度為1×106細胞/ml的無血清RPMI，並將25μl的懸浮液放置於96-孔趨化性室的上層孔中。37℃溫育4小時後，刮去未遷移的細胞，並將遷移過濾器的細胞進行脫水、固定、並用蘇木精(Sigma，St.Louis，MO)染色。對在所述孔中的5個隨機選擇的高倍數視野(HPF)(400X)中的染色細胞進行計數。圖7A顯示了趨化性分析的結果。溶媒、50μM LY294002(15分鐘)、以及50μM PD98059(60分鐘)預處理的細胞，進行1μM WKYMVm處理時的趨化性分析，結果顯示在圖7B中。遷移細胞數通過計數高倍數視野(400x)中的細胞進行測定。數據為三個獨立實驗的平均值±SE，每個實驗重複兩次。
已有報導，WKYMVm可以誘導吞噬細胞如單核細胞和嗜中性白細胞的趨化遷移(11)。Le等證實了通過與FPR和FPRL1結合的WKYMVm-誘導細胞趨化性(12)。正如所期望的那樣，在FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞中，WKYMVm顯示出的趨化遷移活性具有鍾(bell-)型濃度依賴性(圖7A)。WKYMVm-誘導的細胞趨化性對LY294002和PD98059敏感(圖7B)。該結果暗示WKYMVm-誘導的細胞趨化性為P13K-和MEK-依賴的。WKYMVm經P13K和MEK活性，刺激FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞的趨化遷移。
測量了本發明肽對FPR-或FPRL1-表達RBL-2H3細胞的細胞趨化性的影響。多種濃度的各種肽用於FPR-或FPRL1-表達的RBL-2H3細胞的趨化性分析。通過在高倍數視野(400x)對細胞進行計數，測定遷移細胞數。數據表示為兩個獨立實驗的平均值±SE，每個實驗重複兩次。
在FPR-表達RBL-2H3細胞中，不僅WKYMVm而且置換肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE以及WKYMVR)誘導細胞的趨化性(圖8A)。趨化性所需要的置換肽的濃度高於WKYMVm的濃度(圖8B)。針對涉及置換肽-誘導趨化性信號傳導途徑，檢驗了PI-3激酶和MEK-介導信號傳導的參與情況。當FPR-表達RBL細胞用LY294002或PD98059預處理的時候，WKYMVm和置換肽-誘導的RBL細胞遷移幾乎完全被抑制(圖7B並且數據未顯示)。在FPRL1-表達RBL-2H3細胞中，WKYMVm以及肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE和WKYMVR)誘導的細胞趨化性，也顯示出濃度依賴性(圖8B)。
在本發明中，第一次證實了FPR可用不同的配體進行調節，導致差異的細胞信號傳導和功能結果。為了證實FPR的配體-特異性調節，製備了如表I中所列出的多種肽，FPR的強活性配體。其中，WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Met6-置換肽能結合到FPR，只誘導PI-3激酶-介導的Akt和MEK-介導的ERK激活，導致細胞的趨化遷移。這些肽不會影響胞質鈣增加。由於肽WKYMVm不僅刺激ERKs激活，而且胞質鈣增加，導致趨化性以及脫粒作用，因此意味著FPR可用不同的配體進行差異調節。
最近，數篇報導證實了一些GPCRs可用不同的配體進行調節(21，22)。在GPCR的配體-特異性調節中，認為不同的配體誘導受體的不同構象改變，並誘導受體與特定的效應分子或G-蛋白的選擇性偶聯。在表III和圖1A中，證實了在FPR-表達RBL-2H3細胞中，WKGMVm、WKRMVm以及D-Met6置換肽不能刺激PLC-介導胞質鈣增加。但是，這些肽刺激FPR-表達RBL-2H3細胞中的ERKs和Akt磷酸化(圖3C)。在WKYMVm以及本發明肽-介導細胞信號傳導中，胞質鈣增加是被通過PLC-P激活的PI水解所誘導的，但是ERK和Akt磷酸化是分別通過MEK和P13的激酶的激活而介導的。基於這些結果，似乎肽配體與FPR的結合誘導FPR的構象改變，構象改變導致受體與G-蛋白質-介導PLC-β或G-蛋白質-介導PI-3激酶偶聯。由於一些本發明肽不能誘導胞質鈣增加(WKGMVm、WKRMVm以及D-Met6置換肽)，但可以經PI-3激酶-獨立的途徑刺激ERKs磷酸化，似乎肽結合到FPR並誘導了構象改變，該構象改變是PI-3激酶激活和MEK-介導的信號傳導所需要的，從而導致RBL-2H3細胞的趨化遷移。
已有報導稱甲醯基肽受體家族的兩種不同受體，FPR和FPRL1在先天性免疫反應中發揮重要作用(1，2)。至今為止，數種不同的配體來源包括甲醯基肽lipoxin A4，已有報導可以與FPR或FPRL1結合(1)。Le等報導WKYMVm可以與FPR以及FPRL1結合(12)。
在本發明中，本發明者證實了用其它胺基酸置換Tyr3或D-Met6將失去FPR而不會失去FPRL1的PLC-介導胞質鈣-增加活性(圖1)。該結果表明Tyr3和D-Met6是通過FPR激活PLC的關鍵，但對FPRL1卻不是這樣。從該結果可以推導出FPR和FPRL1的配體-結合位點不同。
GPCRs包括FPR通過結合到異質-三聚G-蛋白質而誘導細胞內信號傳導，許多研究組一直試圖揭示涉及G-蛋白質偶聯中受體的關鍵胺基酸殘基(23，24)。對FPR而言，Miettinen等構建了35種突變FPRs並考察了突變對FPR的G-蛋白質偶聯以及細胞信號傳導的影響。根據該文章，S63、D71、R123以及C124/C126對G-蛋白質與FPR的偶聯非常重要(24)。在這些突變體中，R123A突變體不能介導鈣的轉移，但能通過fMLF誘導ERKs磷酸化(24)。已經推測Asp122和Arg123，其構成了保守的(D/E)RY結構域(FPR中的DRC)，參與了穩定受體無活性形式的氫鍵網絡(24)。在該推測中，配體結合到受體引起氫鍵網絡的改變，並且某些胺基酸殘基例如DRY結構域中的精氨酸的暴露，從而能與G-蛋白質相互作用(24)。已經發現一些肽如WKGMVm可以誘導ERKs磷酸化但不能引起鈣轉移。因此判斷WKYMVm或WKGMVm與FPR的結合是否誘導差異的受體構象改變非常重要；即儘管WKYMVm能誘導FPR的構象改變，包括DRY結構域的氫鍵的改變，WKGMVm只引起了顯著的受體構象改變，而沒有影響DRY氫鍵。在FPRL1的情況下，它也包含DRY結構域(FPRL1中的DRC)，但沒有考察其在G-蛋白偶聯中的作用。在這些結果中，不僅WKYMVm而且WKGMVm誘導FPRL1-表達RBL細胞中的鈣轉移(圖1B)。這些結果表明WKYMVm或WKGMVm不影響FPR或FPRL1中DRY結構域的氫鍵。其它結合口袋也許參與肽結合，未來的工作中，識別涉及WKYMVm或WKGMVm與FPRs的差異結合模式中的殘基非常重要。
到目前為止，已經報導了一些天然配體可以差異地調節FPR。在免疫系統中，脫粒作用或趨化遷移的差異調節對更精細的調節而言是必須的。從這個角度來講，識別如本發明中的能夠差異地調節FPR配體的工作非常重要。
參考文獻1.Le，Y.，Li，B.，Gong，W.，Shen，W.，Hu，J.，Dunlop，N.M.，Oppenheim，J.J.，and Wang，J.M.(2000)Immunol Rev.177，185-194.
2.Le，Y.，Oppenheim，J.J.，and Wang，J.M.(2001)Cytokine Growth FactorRev.12，91-105.
3.White，J.R.，Lee，J.M.，Young，P.R.，Hertzberg，R.P.，Jurewicz，A.J.，Chaikin，M.A.，Widdowson，K.，Foley，J.J.，Martin，L.D.，Griswold，D.E.，andSarau，H.M.(1998)J.Biol.Chem.273，10095-10098.
4.Zagorski，J.，and Wahl，S.M.(1997)J.Immunol.159，1059-1062.
5.Prossnitz，E.R.，and Ye，R.D.(1997)Pharmacol.Ther.74，73-102.
6.Su，S.B.，Gong，W.H.，Gao，J.L，Shen，W.P.，Grimm，M.C.，Deng，X.，Murphy，P.M.，Oppenheim，J.J.，and Wang，J.M.(1999)Blood 93，3885-3892.
7.Walther，A.，Riehemann，K.，and Gerke，V.(2000)Mol.Cell.5，831-840.
8.Baek，S.H.，Seo，J.K.，Chae，C.B.，Suh，P.G.，and Ryu，S.H.(1996)J.Biol.Chem.271，8170-8175.
9.Seo，J.K.，Choi，S.Y.，Kim，Y.，Baek，S.H.，Kim，K.T.，Chae，C.B.，Lambeth，J.D.，Suh，P.G.，and Ryu，S.H.(1997)J.Immunol.158，1895-1901.
10.Bae，Y.S.，Ju，S.A.，Kim，J.Y.，Seo，J.K.，Baek，S.H.，Kwak，J.Y.，Kim，B.S.，Suh，P.G.，and Ryu，S.H.(1999)J.Leukoc.Biol.65，241-248.
11.Bae，Y.S.，Kim，Y.，Kim，Y.，Kim，J.H.，Suh，P.G.，and Ryu，S.H.(1999)J.Leukoc.Biol.66，915-922.
12.Le，Y.，Gong，W.，Li，B.，Dunlop，N.M.，Shen，W.，Su，S.B.，Ye，R.D.，and Wang，J.M.(1999)J.Immunol.163，6777-6784.
13.He，R.，Tan，L.，Browning，D.D.，Wang，J.M.，and Ye，R.D.(2000)J.Immunol.165，4598-4605.
14.Bae，Y.S.，Bae，H.，Kim，Y.，Lee，T.G.，Suh，P.G.，and Ryu，S.H.(2001)Blood 972854-2862.
15.Grynkiewicz，G.，Poenie，M.，and Tsien，R.Y.(1986)J.Biol.Chem.260，3440-3450.
16.Hu，J.Y.，Le，Y.，Gong，W.，Dunlop，N.M.，Gao，J.L.，Murphy，P.M.，and Wang，J.M.(2001)J.Leukoc.Biol.70，155-1561.
17.King，J.，andLaemmli，U.K.(1971)J.Mol.Biol. 62，465-477.
18.Haribabu，B.，Zhelev，D.V.，Pridgen，B.C.，Richardson，R.M.，Ali，H.，and Snyderman，R.(1999)J.Biol.Chem.274，37087-37092.
19.Franke，T.F.，Yang，S.I.，Chan，T.O.，Datta，K.，Kazlauskas，A.，Morrison，D.K.，Kaplan，D.R.，and Tsichlis，P.N.(1995)Cell.81，727-736.
20.Jin，X.，Shepherd，R.K.，Duling，B.R.，and Linden，J.(1997)J.Clin.Invest.100，2849-2857.
21.Thomas，W.G.，Qian，H.，Chang，C.S.，and Karnik，S.(2000)J.Biol.Chem.275，2893-2900.
22.Palanche，T.，lien，B.，Zoffmann，S.，Reck，M.P.，Bucher，B.，Edelstein，S.J.，andGalzi，J.L.(2001)J.Biol.Chem.276，34853-34861.
23.Prossnitz，E.R.，Quehenberger，O.，Cochrane，C.G.，and Ye，R.D.(1993)Biochem.J.294，581-587.
24.Miettinen，H.M.，Gripentrog，J.M.，Mason，M.M.，and Jesaitis，A.J.(1999)J Biol.Chem.274，27934-27942.
序列表110POSCO(POSCO公司)POSTECH Foundation120免疫調節肽130OPP030092KR150US60/352,9301512002-01-2916024170Kopatentin 1.7121012116212PRT213人工序列220
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220
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Trp-Lys-His-Met-Val-Met1521092116212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES(修飾殘基)222(6)223D-Met4009Trp-Lys-Glu-Met-Val-Met15210102116212PRT213人工序列220
223免疫調節肽220
221MOD_RES(修飾殘基)222(6)223D-Met40010Trp-Lys-Trp-Met-Val-Met15
210112116212PRT213人工序列220
223免疫調節肽220
221MOD_RES(修飾殘基)222(6)223D-Met40011Trp-Lys-Arg-Met-Val-Met15210122116212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES(修飾殘基)222(6)223D-Met40012Trp-Lys-Asp-Met-Val-Met1 5210132116212PRT
213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES(修飾殘基)222(6)223D-Met40013Trp-Lys-Phe-Met-Val-Met1 5210142116212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES222(6)223D-Met40014Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-Met15210152116212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES222(6)223D-Met40015Trp-Lys-Tyr-Met-(Phe/Trp)-Met-1 5210162116212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
40016Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu15210172116212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
40017Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Val15210182116
212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
40018Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg15210192116212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
40019Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Trp15210202115212PRT213A220
免疫調節肽223
40020Trp-Lys-Tyr-Met-Val15210212115212PRT
213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES222(5)223D-Met40021Lys-Tyr-Met-Val-Met15210222114212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
40022Lys-Tyr-Met-Val1210232114212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES222(4)
223D-Met40023Tyr-Met-Val-Met15210242113212PRT213人工序列220
免疫調節肽223
220
221MOD_RES222(3)223D-Met40024Met-Val-Met權利要求
1.一種包含胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽。
2.權利要求1的肽，其中所述肽激活白細胞，並且是分離的和基本上是純的形式。
3.一種衍生自肽的物質，所述肽的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQID NO24。
4.權利要求1的肽，其中所述肽具有至少一項下列性質(a)由人單核細胞或嗜中性白細胞誘導超氧化物的產生；(b)由人外周血單核細胞或嗜中性白細胞誘導細胞內鈣增加；(c)與甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1結合；(d)體外誘導人單核細胞或嗜中性白細胞的趨化遷移；(e)誘導甲醯基肽受體表達的細胞或類甲醯基肽受體1表達的細胞中的脫粒作用；(f)通過激活甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1刺激細胞外信號-調節蛋白激酶磷酸化；以及(g)通過激活甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1刺激Akt磷酸化。
5.一種藥物組合物，包括胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽；或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質。
6.一種治療由改變白細胞數量或激活狀態伴隨或引起的疾病的方法，所述方法包括對需要這種治療的宿主施用治療有效量的肽，所述肽的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24，或衍生自胺基酸序列選自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24肽的物質。
7.權利要求14所述的方法，其中疾病為細菌、支原體、酵母、真菌或病毒感染。
8.權利要求14所述的方法，其中疾病為炎症。
9.一種增加宿主中白細胞數或提升白細胞激活狀態的方法，包括向需要增加更大量白細胞數或更高白細胞激活狀態宿主施用治療有效量的肽，所述肽的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質。
10.一種誘導需要這種治療的病人的白細胞細胞外鈣增加方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ IDNO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
11.一種在需要這種治療的病人中由人單核細胞或嗜中性白細胞誘導超氧化物產生的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
12.一種在需要這種治療的病人中由人外周血單核細胞誘導趨化遷移的方法，所述這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
13.一種為需要這種治療的病人提供誘導甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中脫粒作用的方法，所述這種方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
14.一種為需要這種治療的病人提供與WKYMVm競爭結合甲醯基肽受體表達細胞中甲醯基肽受體的肽的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
15.一種為需要這種治療的病人提供與WKYMVm競爭結合類甲醯基肽受體1表達細胞中類甲醯基肽受體1的肽的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
16.一種為需要這種治療的病人提供刺激甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中細胞外信號調節蛋白激酶的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
17.一種為需要這樣治療的病人提供刺激甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中Akt的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自胺基酸序列選自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物質，所用量為對這種誘導或脫敏作用的治療或預防有效。
18.權利要求所述6的方法，其中所述宿主受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
19.權利要求9所述的方法，其中所述宿主受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
20.權利要求10所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
21.權利要求11所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球性腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
22.權利要求12所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
23.權利要求13所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
24.權利要求14所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
25.權利要求15所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
26.權利要求16所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
27.權利要求17所述的方法，其中所述病人受由下列導致的疾病侵擾，感染、風溼性關節炎、蘭姆氏關節炎、痛風、膿毒症症候群、體溫過高、潰瘍性結腸炎、小腸結腸炎、骨質疏鬆症、巨細胞病毒、牙周疾病、腎小球腎炎、肺慢性非感染性炎症反應、結節病、吸菸者者肺、肉芽腫形成、肝纖維化、肺纖維化、移植排斥反應、移植物對宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支氣管哮喘、I型胰島素依賴型糖尿病、動脈硬化、動脈粥樣硬化、牛皮癬、慢性B淋巴細胞白血病、普通可變型免疫缺陷病、播散性血管內凝血、全身性硬皮病、腦脊髓炎、肺炎症反應、高IgE症候群、癌症轉移、癌症生長、繼承性免疫治療、獲得性呼吸窘迫症候群、膿毒症、再灌注症候群、術後炎症反應、器官移植或禿頭症。
28.一種分離的核苷酸，包括的鹼基序列編碼胺基酸序列選自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24序列的肽。
29.包含權利要求25核苷酸的載體。
全文摘要
本發明公開了具有SEQ ID NOs 1～24的肽，所述肽能誘導人單核細胞或嗜中性白細胞產生超氧化物；能誘導人外周血單核細胞或嗜中性白細胞中細胞內鈣增加；能與甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1結合；能誘導人單核細胞或嗜中性白細胞的體外趨化遷移；能誘導甲醯基肽受體表達細胞或類甲醯基肽受體1表達細胞中的脫粒作用；能經甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1的激活，從而刺激細胞外信號調節蛋白質激酶磷酸化；或能經甲醯基肽受體或類甲醯基肽受體1的激活，刺激Akt磷酸化。
文檔編號C07K7/06GK1533399SQ03800414
公開日2004年9月29日 申請日期2003年1月28日 優先權日2002年1月29日
發明者柳成浩, 徐判吉, 裵外植, 宋芝英 申請人:Posco公司, 學校法人浦項工科大學校