銀杏內生真菌代謝產物在防治植物真菌病害中的應用的製作方法

2023-08-05 19:22:46 3

專利名稱：銀杏內生真菌代謝產物在防治植物真菌病害中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物農藥技術領域，特別是涉及銀杏內生真菌代謝產物在防治植物真菌病害中的應用。
背景技術：
銀杏(Ginkgo biloba L.)又名白果，是我國特有的世界珍稀名貴樹種，是冰川運動遺留的孑遺植物，被稱為活化石。屬銀杏科，是銀杏屬現存的唯一生存種。現為廣泛栽培樹種，具有極高的研究開發價值。銀杏各組織含有抑菌物質，據報導，銀杏根、莖、葉、果肉(外種皮)及果仁的提取物對供試植物病原菌有抑制作用。但植物資源量是限制植物源殺菌劑發展規模的主要因素之一。根據宿主植物與其內生微生物由於長期的共同生活而具有相同或相似的次生代謝產物合成途徑的「內共生理論」，從銀杏中分離篩選到產黃酮的內生真菌已有報導(王梅霞等，南京師大學報，2003，26(1))，這主要涉及醫藥方面的研究。但從銀杏中分離篩選內生真菌，並將其代謝產物應用於防治植物真菌病害，這在國內外還未見有研究報導。

發明內容
本發明的目的是從銀杏中分離篩選出代謝產物有抑菌作用的內生真菌，並將該菌發酵代謝產物應用於防治植物真菌病害。
本發明的目的通過以下技術方案得以實現。
一種銀杏內生真菌的分離篩選及其代謝產物在防治植物真菌病害中的應用，具體包括以下步驟(1)銀杏組織的準備採集銀杏根、莖、葉、果肉、果仁；(2)銀杏組織的表面消毒與無菌檢測；將步驟(1)銀杏組織經表面消毒後，直接種植於PDA培養基平皿上，置26℃～28℃恆溫箱培養，從中選出表面無任何菌種生長的組織；(3)銀杏組織內生真菌的分離培養將步驟(2)的無菌組織在無菌條件下切割成小片移植於PDA培養基上，置26℃～28℃恆溫箱培養，至樣品周圍長出菌絲時，採用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌落，經純化後轉接到PDA斜面培養基，備用；(4)內生真菌液體發酵培養基的配製其各組分與每升所含的質量為蛋白腖0-5.5g、玉米粉1-8g、麩皮0-10g、可溶性澱粉0-10g、葡萄糖1-8g、黃豆餅粉1-9g、CaCO30.5-2.5g、NH4NO30.1-1.2g、MgSO40.1-0.9g、KH2PO40.1-0.9g；(5)內生真菌發酵培養將步驟(4)液體發酵培養基分裝在三角瓶中，用接種鉤挑取少許經步驟(3)分離純化的內生真菌菌絲於培養瓶中，置26℃～28℃搖床，200r/min，振蕩培養4～5天，發酵液經5000r/min離心10min，取發酵上清液；(6)有效菌株篩選取步驟(5)各上清液與冷卻至50℃的PDA培養基按毫升體積1∶9混勻於無菌培養皿內，凝固後在每個培養基平面放1個直徑為4mm的供試菌餅，置28℃培養箱培養後，計算各菌株發酵液對供試病原菌的抑制率，從中篩選出高效抑制率的內生真菌菌株，備用；(7)銀杏內生真菌代謝產物在防治植物真菌病害中的應用將步驟(6)篩選出的高效菌株，採用步驟(4)液體發酵培養基在發酵罐中發酵培養，以其上清液或發酵混合物，配以適量農用藥物輔料，製備成多種劑型的農用藥物。
所述的液體發酵培養基，其各組分與每升所含的質量為蛋白腖2.5g、玉米粉3g、麩皮5g、葡萄糖4g、可溶性澱粉4g、黃豆餅粉4g、CaCO31g、NH4NO30.6g、MgSO40.1g、KH2PO40.6g；本發明步驟(2)和(3)所述培養基為PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖培養基)，其組分與含量為馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g。馬鈴薯去皮，切成塊煮沸半小時，然後用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂，溶化後補足水至1L。
本發明步驟(6)所述供試菌餅的植物病原菌為番茄早疫病菌(Alternariasolani)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichumlindemuthianum)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris)或黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)中的一種或一種以上(均系《病原植物真菌學》中描述的與農業植物病害關係密切的病原菌)。
本發明的有益效果，一是本發明根據「內共生理論」從銀杏中篩選出其代謝產物與宿主植物提取物相同或相似的，對植物真菌病害病原菌具有抑制作用的內生真菌，這為實現由植物中提取殺菌活性物質到微生物發酵法生產殺菌活性物質的轉化，提供了有效的菌種分離篩選方法；二是本發明跟蹤測定了分離到的各內生真菌菌株代謝產物對供試植物病原菌的抑制作用，從而獲得有效菌株，為微生物農藥的進一步研製和開發提供了一批出發菌株；三是本發明重視了對植物組織的前期無菌檢測，並研製了銀杏內生真菌適用的液體發酵培養基，提高了對內生真菌分離篩選的成功率與效率；四是本發明首次將銀杏內生真菌發酵代謝產物應用於植物真菌病害的防治，效果與常規化學藥劑相仿(見試驗例)，為農用殺菌劑的開發增添了新的途徑。
具體實施例方式
下面結合實施例對本用途發明作進一步描述。
實施例1從浙江長興銀杏長廊採集銀杏莖組織，按下列程序進行表面消毒自來水衝洗，75％酒精漂洗5min，無菌水衝洗5次，再用升汞浸泡4分鐘，無菌水衝洗3次；表面消毒後的莖組織直接種植於PDA培養基平皿上，置28℃恆溫箱內培養，從中選出表面無任何菌種生長的莖組織；將經無菌檢測的莖(取韌皮部)組織，在超淨工作檯條件下切割成約0.5cm×0.5cm的小片，然後將小片種植於PDA培養基平板上，置28℃恆溫箱培養；當樣品周圍明顯長出菌絲時，採用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌落，經純化後轉接到PDA斜面培養基備用；將上述分離得的銀杏內生真菌各菌株進行液體發酵培養，其培養基各組分與每升所含的質量為蛋白腖2.5g、玉米粉3g、麩皮5g、葡萄糖4g、可溶性澱粉4g、黃豆餅粉4g、CaCO31g、NH4NO30.6g、MgSO40.1g、KH2PO40.6g；將500mL液體發酵培養基分裝在300mL的三角瓶中，每瓶裝液量為50mL；用接種鉤挑取少許菌絲接種於培養瓶中，置於28℃搖床，200r/min，振蕩培養4天；發酵液5000r/min離心10min，取上清液，棄菌絲體；發酵液抑菌活性測定取上述各菌株發酵上清液1mL於無菌培養皿內，與9mL冷卻至50℃的PDA培養基迅速混勻，冷卻後在每個培養基平面放1個供試菌黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)的菌餅(直徑為4mm)，菌餅接於培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置培養箱中28℃培養36h，以無菌水處理作為對照，重複3次；採用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率
結果表明編號為3、64、73、121、303、431、528、555、597、820、847、920、1012、1028菌株的代謝產物對黃瓜立枯病菌的抑制率分別為25％、36％、45％、26％、42％、47％、39％、41.5％、37.3％、54％、19.5％、59％、46％、68％。
實施例2取銀杏葉，按下列程序表面消毒自來水衝洗，75％酒精漂洗5min，無菌水衝洗5次，再用升汞浸泡4分鐘，無菌水衝洗3次；表面消毒後的葉片直接種植於PDA培養基平皿上，置27℃恆溫箱內培養，從中選出表面無任何菌種生長的組織；將經無菌檢測的葉片在超淨工作檯條件下切割成約0.5cm×0.5cm的小片，然後將小片種植於PDA平板上，置27℃恆溫箱培養；當樣品周圍明顯長出菌絲時，採用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌落，經純化後轉接到PDA斜面培養基，備用；將上述分離得的銀杏內生真菌各菌株進行液體發酵培養液體發酵培養基其各組分與每升所含的質量為蛋白腖5.5g、玉米粉1g、麩皮10g、葡萄糖8g、黃豆餅粉1g、CaCO30.5g、NH4NO31.2g、MgSO40.4g、KH2PO40.1g；將培養基分裝在300mL的三角瓶中，每瓶裝液量為50mL；用接種鉤挑取少許菌絲接種於培養瓶中，置於27℃搖床，200r/min，振蕩培養5天；發酵液5000r/min離心10min，取上清液，棄菌絲體；發酵液抑菌活性測定取上述各菌株發酵液1mL於無菌培養皿內，與9mL冷卻至50℃的PDA培養基迅速混勻，冷卻後在每個培養基平面放1個供試菌番茄早疫病菌(Alternaria solani)的菌餅(直徑為4mm)，菌餅接於培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置28℃培養72h，以無菌水處理作為對照，重複3次；採用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率，計算方法同實施例1。
結果表明編號為256、383、604、618、918菌株的代謝產物對番茄早疫病菌的抑制率分別為56％、38％、67％、20％、42％。
實施例3取銀杏果肉(外種皮)，按下列程序表面消毒自來水衝洗，75％酒精漂洗5min，無菌水衝洗5次，再用升汞浸泡4分鐘，無菌水衝洗3次；表面消毒後的果肉組織直接種植於PDA培養基平皿上，置26℃恆溫箱內培養，從中選出表面無任何菌種生長的果實組織；將經無菌檢測的果肉在超淨工作檯條件下切割成約0.5cm×0.5cm的小片，然後將小片種植於PDA平板上，置26℃恆溫箱培養；當樣品周圍明顯長出菌絲時，採用尖端菌絲挑取法，挑取形態不同的菌落，經純化後轉接到PDA斜面培養基，備用。
將上述分離得的銀杏內生真菌各菌株進行液體發酵培養液體發酵培養基其各組分與每升所含的質量為玉米粉8g、葡萄糖1g、可溶性澱粉10g、黃豆餅粉9g、CaCO32.5g、NH4NO30.1g、MgSO40.9g、KH2PO40.9g；將500mL培養基分裝在300mL的三角瓶中，每瓶裝液量為50mL；用接種鉤挑取少許菌絲接種於培養瓶中，置於26℃搖床，200r/min，振蕩培養5天；發酵液5000r/min離心10min，取上清液，棄菌絲體；發酵液抑菌活性測定取上述菌株發酵液1mL於無菌培養皿內，與9mL冷卻至50℃的PDA培養基迅速混勻，冷卻後在每個培養基平面放1個供試菌葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的菌餅(直徑為4mm)，菌餅接於培養皿中央(培養皿直徑為9cm)，置28℃培養72h，以無菌水處理作為對照，重複3次；採用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率，計算方法同實施例1；
結果表明編號為78、207、305、391、634、1002菌株的代謝產物對葡萄炭疽病菌的抑制率分別為25.3％、61％、64.6％、43.4％、50.9％、61.3％。
實施例4-6為本發明所述菌株的代謝產物進行殺菌劑產品的研製和在防治農作物病害上應用效果的說明；其中920菌株代謝產物為按實施例1的工藝和配方發酵4天所得上清液；604菌株代謝產物為按實施例2的工藝和配方發酵5天所得上清液；305菌株代謝產物為按實施例3的工藝和配方發酵5天所得上清液；實施例4產品含2％的920菌種代謝產物，加入3％的白炭黑作為吸附劑，並加入1％的農乳0203-B和3％的木質素磺酸鈉輔料，最後用輕質碳酸鈣補足到100％，混勻後，經氣流粉碎後製成可溼性粉劑(以下內容中稱「產品A」)。
實施例5產品含1.5％的604菌種代謝產物，用5％的甲醇溶解，並加入2％農乳601和0.5％十二烷基磺酸鈉作為分散助劑，加入1％尿素作為防凍劑，最後用水補足到100％，35℃下混勻，經高剪切乳化器乳化分散後製成微乳劑(以下內容中稱「產品B」)。
實施例6產品含3％的305菌種的代謝產物，用5％的乙醇溶解，加入6％農乳0204-C作為乳化劑，最後用二甲苯補足到100％，攪拌混勻製成乳油(以下內容中稱「產品C」)。
試驗例將實施例4-6試製的農用殺菌劑對黃瓜立枯病、蕃茄早疫病和葡萄炭疽病等作物病害進行防治試驗，以常規化學農藥、清水為對照，如表1所示，試製的農用殺菌劑與常規化學農藥的防治效果相仿或略優。
表1 產品A、B、C對幾種作物病害防效統計表(藥效試驗均於2004年5月-8月在杭州市郊試驗農田進行)

「-」為未試驗。
權利要求
1.銀杏內生真菌代謝產物在防治植物真菌病害中的應用。
2.根據權利要求1所述的在防治植物真菌病害中的應用，其特徵在於將菌株發酵培養後，以其上清液或發酵混合物，配以農用藥物輔料，製備成多種劑型的農用藥物。
全文摘要
本發明公開了銀杏內生真菌代謝產物在防治植物真菌病害中的應用，屬於微生物農藥技術領域。該發明包括銀杏組織的準備、表面消毒與無菌檢測，內生真菌的分離與培養，有效菌株的篩選、發酵及殺菌藥物的製備等步驟。本發明首次將銀杏內生真菌發酵代謝產物應用於植物真菌病害的防治，為農用殺菌劑的開發增添了一個新的途徑。
文檔編號A01N63/00GK1802925SQ200510062338
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月30日 優先權日2005年12月30日
發明者申屠旭萍, 陳列忠, 俞曉平 申請人:中國計量學院