一種快速定量檢測肌鈣蛋白t的免疫螢光試紙條組件及其製成的檢測卡組件和製備方法

2023-08-05 19:30:11

專利名稱：一種快速定量檢測肌鈣蛋白t的免疫螢光試紙條組件及其製成的檢測卡組件和製備方法
技術領域：
本發明屬於醫學檢驗領域，具體涉及ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T(cTnT)的免疫螢光試紙條以及其製備與應用。
背景技術：
冠心病已成為影響人群健康的主要疾病。急性心肌梗死則是造成冠心病人死亡的主要原因。如何及時地發現急性心肌梗死病人及其相應的治療是挽救心肌梗死病人生命的關鍵所在。傳統的診斷主要是根據典型的臨床表現，心電圖的改變及實驗室酶學檢查。但相當一部分心肌梗死病人臨床表現不明顯，早期心電圖無明顯改變。在這種情況下，心肌損傷特異性標誌物的應用對心肌梗死的早期確診就起到了關鍵的作用。肌鈣蛋白T(Cardiactroponin T，cTnT)是ー重要的心肌組織損傷特異性標識物，臨床用於急性心肌梗死及其它心肌損傷性疾病的診斷。肌鈣蛋白是橫紋肌的結構蛋白，由Tnl、TnT和TNC三種亞單位組成。TnT是與原肌球蛋白結合的亞單位，Tnl是肌原纖維ATP酶的抑制性亞單位，TNC是鈣離子結合亞単位。這三種亞單位與原肌球蛋白一起構成肌凝蛋白(Tm)-肌鈣蛋白(Tn)複合體。在鈣離子的誘導下，調節肌肉收縮和舒張的力量和速度。骨骼肌與心肌中的TnT和TnI是由不同的基因編碼的，導致其胺基酸組成序列的差異，因此可以用免疫學的方法加以區分。TNC在骨船肌和心肌中則是相同的。cTnT是僅存在於心肌細胞中的特異性調節蛋白，分兩種形式存在游離形式存在於細胞胞漿中，佔6% 8% ;結合形式存在於心肌收縮單位中肌纖維的細肌絲上，佔92% 94%。當出現可逆性心肌缺血，心肌細胞尚未壞死，但細胞膜受到損傷，胞漿中的cTnT可短暫釋放入血；當發生不可逆性心肌缺血，心肌細胞壞死，細肌絲降解，可導致結合池cTnT釋放入血。因此不穩定型心絞痛(UAP)患者血液中cTnT僅短暫輕度升高隨後恢復正常；而AMI患者血中cTnT可顯著升高且維持較長時間。cTnT在心肌損傷後2 8小時釋放入血，12 24小時達高峰，在血中可維持14天左右，所以它的最大有效診斷窗ロ寬至2小時 14天。在心肌損傷後,cTnT較cTnl更早釋放入血,更易被檢測到,血中濃度更高，對檢測心肌損傷的價值也就可能更高。cTnT僅存在於心肌細胞中，可用免疫酶標定量法測得，對心肌損傷的診斷具高度敏感和特異性。雖然早期的測定方法不成熟，使cTnT與骨骼肌TnT有微量交叉反應，採用心臟特異和非心臟特異兩種抗體測定cTnT，發現cTnT與骨骼肌TnT有1% 2%的交叉反應。檢測方法改進後，採用兩種均為心臟特異的單克隆抗體作為檢測抗體測定cTnT時，與骨骼肌TnT的交叉反應陽性率 O. lng/ml)，胸痛發作24小時內cTnT診斷AMI的敏感性和特異性分別為99%和93%，第2天敏感性和特異性均為100%，因cTnT的升高在血清中持續時間較長，故到第6天仍均達100%;而頭24小時內CK和CK-MB的敏感性分別為99%和98%，特異性分別為75%和92%。cTnT的價值優於CK、CK-MB，在AMI後，cTnT升高幅度是CK-MB升高幅度的5倍，診斷AMI的絕對敏感窗(以症狀發作後時間計)在cTnT也遠較CK和CK-MB寬，cTnT為10. 5 140小時，CK和CK-MB為9 31小時。cTnT診斷AMI的價值優於CK,CK-MB的可能原因有(I)心肌中cTnT的含量較高，每克心室肌(溼重)含10-8mg的cTnT，cTnT總量中的6% 8%存在於胞漿中，而這胞漿中的cTnT量已經相當於心肌中CK的總量，所以cTnT在AMI後的升高幅度要遠高於CK(cTnT可達30 40倍，而CK僅升高9倍)。(2) cTnT在心肌損傷後釋放入血也較CK要早，它最早可在症狀發作後I小時在血中檢出，3 4小時其敏感性可達50%。(3)其在血中持續升高的時間較長。cTnT大部分(94%)以結合形式存在於心肌細胞收縮單位中，它從細肌絲的肌鈣蛋白複合物中分離出來的過程是ー個消耗時間的過程，且此過程不斷進行，因此雖然cTnT在血漿中的半衰期只有120分鐘，但卻可在血中持續升高達2周左右。在10. 5 140小時的絕對敏感診斷窗中，100%的AMI患者cTnT均升高，敏感性是CK的6倍。cTnT的測定始於20世紀90年代初，多採用雙抗體競爭放射免疫法和競爭性ELISA測定法。有研究者將金標記或硒標記單克隆抗體與免疫層析技術相結合，用紙條法半定量床邊檢測cTnT濃度，最低檢測值為O. I μ g/L。目前cTnT的檢測多採用化學發光法，用化學發光物質標記後作為檢測抗體，大大提高了測定的精確性和敏感性，但需要昂貴的檢測設備。目前的床旁檢測方法(膠體金試紙法)，不能滿足臨床診斷準確定量的要求，無法對AMI的病程起到很好的療效監測作用。因此，建立ー種檢測時間儘量縮短，並且檢測除了能在實驗室進行外，還要求能夠進行床旁檢測，同時能定量測定cTnT的檢測方法，從而為臨床提供準確的診斷依據，是十分必要的。申請號200610130403. 3公開了ー種化學免疫分析檢測心肌鈣蛋白T的方法，主要是用辣根過氧化物酶促化學發光體系，採用雙單抗夾心法和/或競爭法檢測，該方法需要將樣品和與酶的複合物(固化與固相載體上)置於在反應池內，再經過洗滌後加入酶的底物、氧化劑以及增強劑便可發光，這種方法的過程複雜，且耗時長。

發明內容
為克服現有cTnT檢測技術的不足，本發明提供ー種快速檢測cTnT的試紙條組件，以及由該試紙條組件製成的檢測卡。本發明根據免疫螢光技術特點和cTnT抗原抗體系統特點，設計新的原材料，試劑和エ藝流程，應用本發明提供的試紙條檢測cTnT水平，具有簡單，快速，靈敏和特異性好等特點，可同時定量檢測高值和低值樣品，並且性價比高，適用於臨床快速檢測。本發明提供的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的檢測反應原理為固相雙抗體夾心法的免疫螢光層析法。待測樣品與適當比例的螢光標記抗體在液相均質介質中充分混和均勻，在此過程中樣品中的cTnT能專ー性地與螢光標記抗cTnT抗體充分結合，然後再轉加到檢測卡上，流經檢測卡中的硝酸纖維膜(NC膜)時，其中所含的、已反應結合在一起的cTnT-抗cTnT螢光抗體複合物能為膜上檢測線上固定的抗cTnT的另ー個抗體特異性捕獲，所發出的螢光可用專用儀器定量測定，螢光強度與樣品中cTnT濃度成正比。本發明採用如下技術方案ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯、依次接合在底襯上的吸水墊、包被分析膜及樣品墊，該包被分析膜上設有檢測線和質控線，檢測線包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質控線包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標記特異抗體為抗肌I丐蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體。優選地，所述底襯一面塗覆黏膠或雙面膠，用以固定所述的吸水墊、包被分析膜及 樣品墊，其中，硝酸纖維膜粘附在所述底襯的中間，兩端分別與所述吸水墊和樣品墊連接。優選地，所述吸水墊為ー種濾紙，為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊粘附在所述底襯上，同時吸水墊與硝酸纖維膜重疊l_2mm連接。優選地，所述包被分析膜為硝酸纖維膜，且在所述包被分析膜上噴塗抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和兔IgG抗體。優選地，所述樣品墊為玻璃纖維膜，且用含O. 01% -O. 5% PEG聚こニ醇、I % ~5%牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡處理過，其中，磷酸鹽緩衝液PH為7. 2，浸泡處理後，放置在25-40°C溫度下乾燥過夜，所述樣品墊與硝酸纖維膜重疊l_2mm連接。優選地，所述的獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，並分別用含有如下組分的O. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋後用塑料瓶密封而得O. 01% -O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性齊 。優選地，所述獨立包裝的鉬卟啉標記的激發光光源範圍為390_420nm，發射光波長範圍為 600nm-700nm。一種製備上述定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件的方法，包括以下步驟I)抗體的製備選用純化的基因工程表達的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ；2)包被分析膜的製備採用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上畫檢測線和質控線，劃線細緻均勻，檢測線與質控線間隔5mm ；用檢測線包被緩衝液稀釋抗肌鈣蛋白T單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將抗肌鈣蛋白T單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10_20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG抗體對應噴印在硝酸纖維膜的質控線上；
將噴膜後的硝酸纖維膜放入25_40°C的真空乾燥箱內，乾燥後取出密封備用；3)樣品墊的製備將玻璃纖維膜用含O. 01 % -O. 5 %聚こニ醇、I % -5 %牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡，放入30-50°C的真空乾燥箱內，乾燥後即成樣品墊，取出密封備用；4)鉬卟啉標記特異抗體的製備將肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至Img/ml,分別加入30-50mg鉬卩卜啉溶解液,攪勻，室溫孵育I小時，姆隔15分鐘混勻一次,最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的鉬卟啉標記抗體，用O. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋混勻後於4 C保存；5)免疫螢光試紙條的製備 先將包被分析膜粘附在底襯中間位置上，在包被分析膜一端粘附吸水墊，二者重疊l_2mm ;在包被分析膜另一端粘附樣品墊，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜、吸水墊和樣品墊的底襯裁切成細條；，即成ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙。優選地，所述檢測線包被緩衝液為含有O. 8-1 %的甲醇、1-1. 5%海藻糖或者蔗糖、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的50mM pH值為7. 6的磷酸鹽緩衝液或三羥甲基甲胺基丙磺酸緩衝液。優選地，所述質控線包被緩衝液為含O. 7-1 %的甲醇、O. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗體O. 5mg/ml50mM的pH值為7. 6磷酸鹽緩衝液。應用上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的免疫螢光檢測卡組件，所述檢測卡組件包括試紙條組件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板和用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的背板組成的卡盒，所述背板包括放置所述試紙條的卡槽和用幹與所述蓋板結合的卡齒，所述蓋板包括可觀測檢測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔和用幹與所述背板的卡齒結合的固定孔，所述試紙條通過所述卡齒與所述固定孔結合而嵌合在所述背板和所述蓋板之間，其中，所述包被硝酸纖維膜正對所述檢測窗，所述樣品墊正對所述加樣孔；另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。製備上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件的方法，包括以下步驟I)背板和蓋板的製備用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質製成背板和蓋板，所述背板包括放置所述試紙條組件的卡槽和用幹與所述蓋板結合的卡齒，所述蓋板包括可測結果的檢測窗、可滴加樣品的加樣孔以及用幹與所述背板的卡齒結合的固定孔；2)組裝將試紙條放在所述背板的所述卡槽內，通過所述背板的卡齒與所述蓋板的固定孔結合，將試紙條嵌合在背板和蓋板之間，其中，包被分析膜正對所述檢測窗，樣品墊正對所述加樣孔；3)包裝將I人份的檢測卡與一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，將多組所述鋁箔塑膠袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入一個包裝盒，在2°C _8°C環境下避光不凍存的進行保存。本發明的有益效果本發明採用免疫螢光快速檢測技術，利用螢光的高靈敏特點，且樣品與螢光標記抗體在試劑瓶內反應後再加入檢測卡。由於樣品與螢光標記抗體在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高反應靈敏度，同時增加了樣品的稀釋倍數，去除了樣品的基質效應，使定量結果有很好的可重複性，而且此方法省略了直接加樣步驟，提高了定量結果的精密度和準確度，可滿足同時檢測高值和低值的臨床診斷要求。應用本發明提供的試紙條檢測人體內cTnT水平，成本低廉，操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，只需要配套專用螢光檢測儀，因此可廣泛應用於各級醫療檢驗場所，尤其是基層醫療機構，包括鄉鎮衛生院等均可開展。本發明對於心腦血管事件發生的預防有極為重要的意義。


圖I為本發明的試紙條的結構示意圖；圖2為本發明的檢測卡結構示意圖；圖3是鉬卟啉發光材料的發射光譜曲線；圖4為本發明的反應方式示意圖；圖5為本發明的檢測結果示意圖；圖6為本發明的肌鈣蛋白T檢測標準工作曲線。附圖標記1 :底襯；2 :吸水塾；3 :包被分析I旲；4 :檢測線；5 :質控線；6 :樣品塾；7 :加樣孔；8 :檢測窗；9 :項目名稱；10 :固定孔；11 :蓋板；12 :卡槽；13 :背板；14 :卡齒；15 :怕B卜琳標記抗體；16 :肌韓蛋白T ； 17 :檢測線抗肌韓蛋白T單克隆抗體；18 :質控線兔IgG抗體。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進ー步說明，凡依照本發明公開內容所作出的本領域等同替換，均屬於本發明的保護範圍。實施例一參照附圖I，ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯I、依次接合在底襯I上的吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，該包被分析膜上3設有檢測線4和質控線5，檢測線4包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質控線5包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體。其中，底襯I 一面塗覆黏膠或雙面膠，用以固定吸水墊2、包被分析膜3及樣品墊6，其中，包被分析膜3附在底襯I的中間，兩端分別與吸水墊2和樣品墊6連接。吸水墊2為ー種濾紙，為吸水紙或濾油紙；吸水墊2粘附在底襯I上，同時吸水墊2與包被分析膜3重疊1-2_連接。包被分析膜3為硝酸纖維膜。樣品墊6為玻璃纖維膜，且用含O. 01% -O. 5% PEG (聚こニ醇)、I % _5 %牛血清白蛋白、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡處理過，其中，磷酸鹽緩衝液PH為7. 2，浸泡處理後，放置在25-40°C溫度下乾燥過夜，樣品墊6與硝酸纖維膜3重疊I-2mm連接。獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，並分別用含有如下組分的O. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋後用塑料瓶密封而得0. 01%-O. 5%聚こニ醇、1% -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性剤。製備上述定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件的方法，包括以下步驟I)抗體的製備選用純化的基因工程表達的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和純化的兔IgG。2)包被分析膜3的製備
取硝酸纖維膜，調試BIO-DOT噴膜機，膜液量為25ul/35cm，機器劃線，檢測線與質控線間隔5mm，劃線細緻均勻；用檢測線包被緩衝液稀釋抗肌鈣蛋白T單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用BIO-DOT噴膜機將抗肌鈣蛋白T單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線上；其中檢測線包被緩衝液的製備50mM pH7. 6PBS緩衝液，含甲醇I %、海藻糖I %、牛血清白蛋白O. 5%、ICll抗體lmg/ml ο用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG至濃度為10_20ug/ml，採用BIO-DOT噴膜機將純化的兔IgG分別對應噴印在硝酸纖維膜的和質控線上；其中質控線包被緩衝液的製備50mM pH7. 6PB緩衝液，含甲醇I %、牛血清白蛋白O. 8%、兔 IgG 抗體 O. 5mg/ml。將噴印好的硝酸纖維膜放置25°C _37°C真空乾燥箱處理I小時，裝袋密封備用。3)樣品墊6的製備將玻璃纖維膜用含O. 2% PEG、2. 5%牛血清白蛋白、O. 03%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡，放入30-50°C的真空乾燥箱內，乾燥3小時後，即成樣品墊6，取出密封備用；4)鉬卟啉標記特異抗體的製備將抗cTnT單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至Img/ml，各取5ml抗體溶液，分別加入30mg鉬卟啉鉬卟啉溶解液，攪勻，室溫孵育I小時，每隔15分鐘混勻一次。最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的鉬卟啉標記抗體，用含O. 01% -O. 5% PEGU % -5%牛血清白蛋白、5% -20%甘油、O. 01% -O. 05%表面活性劑的O. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋，用塑料瓶密封包裝，於4°C保存。5)免疫螢光試紙條的製備先將包被分析膜粘附在底襯I中間位置上，在包被分析膜3 —端粘附吸水墊2，ニ者重疊l-2mm ;在包被分析膜3另一端粘附樣品墊6，二者重疊l_2mm ;再將黏貼好包被分析膜3、吸水墊2和樣品墊6的底襯I裁切成細條；即成ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫突光試紙。參照附圖2，一種應用上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的免疫螢光檢測卡組件，包括試紙條組件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板11和用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的背板13組成的卡盒，背板13包括放置試紙條的卡槽12和用於與蓋板11結合的卡齒14，蓋板11包括可觀測檢測結果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7和用幹與背板的卡齒14結合的固定孔10,試紙條通過卡齒14與固定孔10結合而嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被硝酸纖維膜3正對檢測窗8，樣品墊6正對加樣孔7 ;另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。製備上述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件的方法，其特徵在於包括以下步驟I)製成背板13和蓋板11 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質製成背板13和蓋板11，背板13包括放置所述試紙條組件的卡槽12和用於與蓋板11結合的卡齒14，蓋板11包括可測結果的檢測窗8、可滴加樣品的加樣孔7以及用幹與背板的卡齒14結合的固定孔10 ；2)組裝 將試紙條放在背板13的卡槽12內，通過背板13的卡齒14與蓋板11的固定孔10結合，將試紙條嵌合在背板13和蓋板11之間，其中，包被分析膜3正對檢測窗8，樣品墊6正對加樣孔7 ；3)包裝將I人份的檢測卡與一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，將多組所述鋁箔塑膠袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入一個包裝盒，在2°C _8°C環境下避光不凍存的進行保存。本發明的檢測原理參照附圖3，對鉬卟啉發光材料的發射光譜曲線進行分析，發現鉬卟啉所具有的特徵光譜的激發光光源範圍為390_420nm,發射光波長範圍為600_700nm。由於鉬B卜啉發光標記物的特點，使得以其作為標記物的免疫螢光試紙條可與儀器結合，使得基於鉬卟啉發光技術的免疫層析試紙條可進行靈敏度極高的多重分析、且對目標被檢測物進行靈敏度極高的精確定量檢測。另外，本發明的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條及檢測卡，利用螢光的高靈敏特點，使待測樣品與鉬卟啉標記先在試劑瓶內反應，由於待測樣品與鉬卟啉標記在液相中全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高反應靈敏度，同時增加了待測樣品的稀釋倍數，去除了待測樣品的基質效應，使定量結果有很好的可重複性；而且鉬卟啉標記上的特異抗體與待測樣品充分結合形成ー複合物，然後將複合物轉加到檢測卡的加樣孔7的樣品墊6上，實現鉬卟啉發光材料與免疫層析技術相結合從而檢測人體內肌鈣蛋白T水平。如圖4所示，當複合物加到檢測卡的加樣孔7的樣品墊6上後，在吸水墊2的吸カ下鉬卟啉標記抗體15流經到檢測卡中的包被分析膜3上，如果該複合物具有肌鈣蛋白T，其能被檢測線4上的肌鈣蛋白T單克隆抗體17捕獲，在緑色光照射下以紅外光光信號的形式表現出來，所發出的螢光可用專用儀器定量測定，螢光強度與樣品中肌鈣蛋白T的濃度成正比。如果複合物中肌鈣蛋白T低於最低檢測標準，則檢測線4不會發出螢光。另外，參閱圖5的a、b、c所示，試紙條有效的情況下，檢測線4上的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體17與質控線5上的兔IgG抗體18均會與複合物反應發出螢光，即檢測線4與質控線5均發光，試紙條檢測結果呈 陽性；只有質控線5發光，試紙條檢測結果呈陰性；兩條線均未發光，試紙條檢測結果無效。標準工作曲線的繪製
首先，將提純的肌鈣蛋白T標準品用I : 10稀釋的正常人血清(採用pH7.20.02MPB緩衝液稀釋)作為稀釋液配製系列濃度標準品，濃度為Ong/ml、IOng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的6份樣品。其次，姆個樣品分別用10個肌I丐蛋白T試紙條檢測10次，10次檢測儀器判讀的樣品檢測T值和對照C值分別取平均值，最終根據二者的比值得出每個濃度對應的T/C結果，列於表I。表I、不同濃度下的T/C值
權利要求
1.ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於 包括試紙條和與試紙條配合使用且獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，試紙條包括底襯(I)、依次接合在底襯(I)上的吸水墊(2)、包被分析膜(3)及樣品墊(6)，該包被分析膜上(3)設有檢測線(4)和質控線(5)，檢測線(4)包被的特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質控線(5)包被的特異抗體為兔IgG抗體；鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體。
2.根據權利要求I所述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述底襯(I) 一面塗覆黏膠或雙面膠，用以固定所述的吸水墊(2)、包被分析膜(3)及樣品墊(6)，其中，包被分析膜(3)粘附在所述底襯(I)的中間，兩端分別與所述吸水墊(2)和樣品墊(6)連接。
3.根據權利要求I或2所述快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述吸水墊(2)為ー種濾紙，為吸水紙或濾油紙；所述吸水墊(2)粘附在所述底襯(I)上，同時吸水墊(2)與包被分析膜(3)重疊l-2mm連接。
4.根據權利要求I或2所述的ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條，其特徵在於包被分析膜(3)為硝酸纖維膜，且在包被分析膜(3)上噴塗抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和兔IgG抗體。
5.根據權利要求I或2所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述樣品墊(6)為玻璃纖維膜，且用含O. 01%-0. 5%PEG聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、O. 01%-0. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡處理過，其中，磷酸鹽緩衝液PH為7.2，浸泡處理後，放置在25-40°C溫度下乾燥，所述樣品墊(6)與包被分析膜(3)重疊l_2mm連接。
6.根據權利要求I所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述的獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體為抗肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，並分別用含有如下組分的O. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋後用塑料瓶密封而得0. 01%-0. 5%聚乙ニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、5%-20%甘油、O. 01%-0. 05%表面活性剤。
7.根據權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件，其特徵在於所述獨立包裝的鉬卟啉標記的激發光波長範圍為390-420nm，發射光波長範圍為600nm-700nmo
8.ー種製備權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件的方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)抗體的製備 選用純化的基因工程表達的抗肌鈣蛋白T單克隆抗體、抗兔IgG抗體和純化的兔IgG ； 2)包被分析膜(3)的製備 採用噴膜機分別在ー硝酸纖維膜上畫檢測線(4)和質控線(5)，劃線細緻均勻，檢測線(4)與質控線(5)間隔5mm； 用檢測線包被緩衝液稀釋抗肌鈣蛋白T單克隆抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將抗肌鈣蛋白T單克隆抗體噴印在硝酸纖維膜的檢測線(4)上； 用質控線包被緩衝液稀釋純化的兔IgG抗體至濃度為10-20ug/ml，採用噴膜機將純化的兔IgG抗體對應噴印在硝酸纖維膜的質控線(5)上；將噴膜後的硝酸纖維膜放入25-40°C的真空乾燥箱內，乾燥後取出密封備用； 3)樣品墊(6)的製備 將玻璃纖維膜用含O. 01%-0. 5%聚こニ醇、1%-5%牛血清白蛋白、O. 01%-0. 05%表面活性劑的O. 04M磷酸鹽緩衝液浸泡，放入30-50 V的真空乾燥箱內，乾燥後即成樣品墊(6 )，取出密封備用； 4)鉬卟啉標記特異抗體的製備 將肌鈣蛋白T單克隆抗體和抗兔IgG抗體，分別用O. IM碳酸氫鈉溶液稀釋至lmg/ml，分別加入30-50mg的鉬卟啉溶解液，攪勻，室溫孵育I小時，每隔15分鐘混勻一次，最後用G25凝膠柱過柱分離純化，收集標記好的鉬卟啉標記抗體，用O. 02M磷酸鹽緩衝液稀釋混勻後於4 C保存； 5)免疫螢光試紙條的製備 先將包被分析膜粘附在底襯(I)中間位置上，在包被分析膜(3) —端粘附吸水墊(2)，二者重疊1_2_ ;在包被分析膜(3)另一端粘附樣品墊(6)，二者重疊1-2_ ;再將黏貼好包被分析膜(3)、吸水墊(2)和樣品墊(6)的底襯(I)裁切成細條，即成ー種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙。
9.根據權利要求8所述的ー種製備權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的方法，其特徵在於，所述檢測線包被緩衝液為含有O. 8-1%的甲醇、1-1. 5%海藻糖或者蔗糖、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的50mM pH值為7. 6的磷酸鹽緩衝液或三羥甲基甲胺基丙磺酸緩衝液。
10.根據權利要求8所述的ー種製備權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的方法，其特徵在於，所述檢測線包被緩衝液為含甲醇O. 8%、蔗糖I. 5%、牛血清白蛋白O. 6%、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的20mM pH值為7. 6的三羥甲基甲胺基丙磺酸緩衝液。
11.根據權利要求8所述的ー種製備權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的方法，其特徵在於，所述檢測線包被緩衝液為含含甲醇1%、海藻糖1%、牛血清白蛋白O. 5%、抗肌鈣蛋白T單克隆抗體lmg/ml的20mM pH值為7. 6的磷酸鹽緩衝液。
12.根據權利要求8所述的ー種製備權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的方法，其特徵在於，所述質控線包被緩衝液為含O. 7-1%的甲醇、O. 5-0. 8%的牛血清白蛋白、兔IgG抗體O. 5mg/ml50mM的pH值為7. 6磷酸鹽緩衝液。
13.根據權利要求8所述的ー種製備權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的方法，其特徵在於，所述質控線包被緩衝液為含甲醇1%、牛血清白蛋白O. 8%、兔IgG抗體O. 5mg/ml的50mM pH值為7. 6磷酸鹽緩衝液。
14.根據權利要求8所述的ー種製備權利要求I所述的定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的方法，其特徵在於，所述質控線包被緩衝液為含甲醇O. 7%、牛血清白蛋白O. 5%、兔IgGO. 5mg/ml的50mM pH值7. 6的磷酸鹽緩衝液。
15.ー種應用權利要求I所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條的免疫螢光檢測卡組件，其特徵在於所述檢測卡組件包括試紙條組件、用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的蓋板(11)和用聚苯こ烯或聚氯こ烯製成的背板(13)組成的卡盒，所述背板(13)包括放置所述試紙條的卡槽(12)和用幹與所述蓋板(11)結合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可觀測檢測結果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)和用幹與所述背板的卡齒(14)結合的固定孔(10)，所述試紙條通過所述卡齒(14)與所述固定孔(10)結合而嵌合在所述背板(13)和所述蓋板(11)之間，其中，所述包被分析膜(3)正對所述檢測窗(8)，所述樣品墊(6)正對所述加樣孔(7 );另外，獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體分裝在塑料試劑瓶中並密封瓶蓋。
16.權利要求15所述的快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件製成的檢測卡組件的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 1)製成背板(13)和蓋板(11) 用聚苯こ烯或聚氯こ烯等塑料材質製成背板(13)和蓋板(11)，所述背板(13)包括放置所述試紙條組件的卡槽(12)和用幹與所述蓋板(11)結合的卡齒(14)，所述蓋板(11)包括可測結果的檢測窗(8)、可滴加樣品的加樣孔(7)以及用幹與所述背板的卡齒(14)結合的固定孔(10)； 2)組裝: 將試紙條放在所述背板(13)的所述卡槽(12)內，通過所述背板(13)的卡齒(14)與所述蓋板(11)的固定孔(10)結合，將試紙條嵌合在背板(13)和蓋板(11)之間，其中，包被分析膜(3)正對所述檢測窗(8)，樣品墊(6)正對所述加樣孔(7)； 3)包裝 將I人份的檢測卡與一包幹燥劑封裝在鋁箔塑膠袋內，並配備I瓶獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體，將多組所述鋁箔塑膠袋和所述獨立包裝的鉬卟啉標記特異抗體裝入ー個包裝盒，在2°C _8°C環境下避光不凍存的進行保存。
全文摘要
本發明公開了一種快速定量檢測肌鈣蛋白T的免疫螢光試紙條組件及其製成的檢測卡，紙條組件包括了試紙條和獨立包裝的鉑卟啉標記特異抗體，該試紙條包括了底襯，粘附於底襯上的包被分析膜、粘附於底襯上且與硝酸纖維膜的其中一端接合的樣品墊和粘附於底襯上且與硝酸纖維膜的另一端接合的吸水墊，包被分析膜上設有檢測線和質控線；所述檢測線包被抗肌鈣蛋白T單克隆抗體，質控線包被兔IgG抗體，檢測卡則將一卡盒和試紙條組件結合即可，應用本發明所提供的試紙條以及檢測卡檢測人血液、血清或血漿中肌鈣蛋白T，操作簡單、快速、靈敏和特異性好等特點，具有良好的臨床應用前景。
文檔編號G01N33/558GK102692508SQ201210133789
公開日2012年9月26日 申請日期2012年4月28日 優先權日2012年4月28日
發明者李必松, 梁萬興, 羅琪, 謝愛武 申請人:廣州鴻琪光學儀器科技有限公司