含有cd34標誌基因用於轉染細胞分選的載體的構建及其應用的製作方法
2023-07-24 23:23:01
專利名稱：含有cd34標誌基因用於轉染細胞分選的載體的構建及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體的說是一種含有CD34細胞表面標誌基因用於轉染細胞分選的載體的構建方法及其應用。
背景技術：
在基因工程中，將外源基因通過載體攜帶入宿主細胞，並在宿主細胞中進行擴增使外源基因得以高效表達的技術有著十分廣泛的應用。但是在將載體轉染細胞後，如何從數量巨大的細胞群中檢測並分選出為數極少的轉化細胞，就成為建立真核細胞表達系統的一個關鍵。
目前所用的方法通常為利用載體中攜帶的標記基因，通過在培養基中加入相應的抗性藥物或通過其他方式來進行篩選，最常用的為G418(geneticin)篩選。G418對真核細胞具有毒性，但當載體中攜帶的新黴素抗性基因(neo)在真核細胞中表達時，可產生一種磷酸轉移酶，使得G418失活，從而轉染進載體並表達了新黴素抗性基因的細胞即可避免被殺死。此外還有胸苷激酶基因(tk)選擇系統、二氫葉酸還原酶基因(dhfr)選擇系統、氯黴素乙醯轉移酶基因(cat)檢測系統等方法，但是由於轉染細胞中標誌基因與目的基因並不一定同時表達，因此通過這類方法對轉染細胞進行篩選時，既耗時效率又低，要分選出表達了目的基因的細胞株通常需耗費一個甚至幾個月的時間。
有些情況下還可以利用轉染細胞所獲得的某些特性通過流式細胞儀來進行分選，但是流式分選所需費用較高，使其推廣應用受到限制。
近年來，通過免疫學的方法，即利用細胞表面的某些標誌分子通過抗原-抗體結合反應分選某種類型的細胞的方法在生物醫學科研及臨床研究中有著廣泛的應用，例如利用免疫磁珠法(MACS)分離CD34+造血幹/祖細胞等等。我們將免疫學的細胞分選方法與多基因共表達載體的構建策略相結合併應用於轉染細胞的分選，不僅簡化了傳統的轉染細胞分選煩瑣又耗時的過程，而且提高了轉染細胞的分選效率。
在細胞表面標誌基因的選擇中，CD34基因因其顯著的優點而受到了我們的關注。目前，對於CD34+細胞的分選已有十分成熟的方法，而且有許多商品化的試劑及設備，可以方便、高效地分選CD34+細胞。我們通過在轉入目的基因的時，將標誌基因CD34一起轉入細胞，使轉染細胞表達目的基因的同時亦獲得CD34表面標誌，從而利用CD34表面標誌，方便的分選轉染細胞。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於轉染細胞分選的載體。其特徵在於，載體中包含編碼細胞表面分子CD34的核苷酸序列，將目的核苷酸序列插入該載體多克隆位點後經轉染細胞，兩者可以實現共同表達，通過轉染細胞所新獲得的CD34表面標誌分子利用免疫結合的原理實現分選陽性細胞的目的。
採用多基因共表達載體的構建方式，實現CD34基因和目的核苷酸序列兩者的共同表達。凡是可以實現兩個或者多個不同基因共同表達的載體構建策略均可以應用於此，目前較常用的為構建雙順反子載體，兩個基因之間以一定的核苷酸序列進行連接，實現其共同表達，例如以IRES(internal ribosome entry site)、2A等序列將兩個基因進行連接的構建方法。我們利用IRES序列，來構建雙順反子載體。
經本發明中所述的載體轉染細胞後，在表達目的基因的同時，轉染細胞可獲得一種新的細胞表面標誌CD34。利用此種細胞表面標誌，採用免疫學的方法，將一定的標誌物(例如免疫磁珠)結合於細胞表面上，然後即可通過相應的細胞分選技術(例如免疫磁性分選)來實現轉染細胞的分選。
我們構建的這一載體提供了一種新的分選轉染細胞的思路和方法，簡化了以往煩瑣的轉染細胞分選過程，提高了轉染細胞的分選效率，在生物醫學領域具有極佳的應用前景。
下面以質粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的構建為例，並結合附圖對本發明做一詳細說明。
圖1是質粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的構建流程圖。
圖2是質粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的PCR鑑定。
MDL2000分子量標誌物；1pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經PCR擴增IRES的部分序列；2pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經PCR擴增CD34序列；圖3是質粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的酶切鑑定。
M1DL2000分子量標誌物；M2DL15000分子量標誌物；1pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經HindIII單酶消化。
2pcDNA3.1(+)-IRES-CD34經EcoRI、XbaI雙酶消化。
圖4是質粒載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34的圖譜。
具體實施例方式
實施例1、pcDNA3.1(+)-IRES-CD34載體的構建一、CD34-cDNA插入T-easy載體。CD34基因分離自CD34+細胞，根據CD34-cDNA編碼區的序列並分別引入NcoI和XbaI、SphI酶切位點合成引物，引物序列及其多聚酶鏈式反應(PCR)的條件如下P15′-CGCCCATGGTGCTGGTCCGCAGGGGC-3′P25′-CGCGCATGCTCTAGATTAGCGGCGATTCATCAGGAA-3′50μl反應體系包括2ul cDNA，primer1和2各2μl(10μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.5μl高保真Taq DNA聚合酶(BioDev公司)，5μl 10×PCR Buffer，34.5μl滅菌水。反應條件為94℃變性5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 80sec，33個循環；72℃ 10min。反應產物克隆至pGEM-T easy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質粒T-CD34。
二、IRES(EMCV)插入T-CD34。質粒pIRES2-EGFP用限制性內切酶NcoI、SalI消化，回收目的片段IRES插入到T-CD34載體的NcoI、SalI位點上，獲得攜帶IRES和標誌基因CD34的載體T-IRES-CD34，經SalI、XbaI雙酶消化後，TAE瓊脂糖凝膠電泳得到1.6kb的條帶，與預期結果符合。
三、pcDNA3.1(+)-IRES-CD34載體的構建。用SalI、XbaI雙限制酶消化T-IRES-CD34載體，獲得IRES-CD34片段，插入經XhoI、XbaI雙限制酶消化的pcDNA3.1(+)載體的多克隆位點。經EcoRI、XbaI雙酶消化後，獲得1.6kb條帶，與預期結果符合；經HindIII單酶消化後，獲得300bp條帶，與預期結果符合。經PCR鑑定，CD34為陽性。設計引物鑑定IRES如下P15′-CGGTGGGAGGTCTATATAAGC-3′P25′-TTATTCCAAGCGGCTTCG-3′。
20μl反應體系包括1μl質粒，primer1和2各1μl(10μM)，2μl dNTP(2.5mM)，0.2μl rTaq酶(TakaRa公司)，2μl 10×PCR Buffer，12.8μl滅菌水。反應條件為94℃變性5min；94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 30s，30個循環；72℃ 7min。IRES鑑定結果為陽性。對其進行測序及分析表明，載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34構建成功。
本實施例是構建了含有細胞表面標誌基因CD34的雙順反子載體，採用腦心肌炎病毒EMCV的內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)序列進行連接，以實現目的基因和細胞表面標誌基因的共同表達。
實施例2、重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc的構建設計引物從載體pAP1-luc上擴增luc基因，並引入NheI、EcoRI酶切位點，引物序列及其多聚酶鏈式反應(PCR)如下P15′-GCTAGCATGGAAGACGCCAAAAACA-3′P25′-GAATTCAATTACACGGCGATCTTTCC-3′。
50μl反應體系包括2μl質粒，primer1和2各2μl(10μM)，4μl dNTP(2.5mM)，0.3μl Pyrobest Taq酶(TakaRa公司)，5μl 10×pyrobest Buffer，34.7μl滅菌水。反應條件為94℃變性5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s，33個循環；72℃ 10min。反應產物克隆至pGEM-T easy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質粒T-luc。
用NheI、EcoRI雙限制酶消化質粒T-luc，得到的目的基因luc片段(約1650bp)插入經NheI、EcoRI雙限制酶消化的3.1-IRES-CD34載體的多克隆位點。經PCR鑑定、酶切鑑定正確後，對其進行序列測定。得到重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc。
實施例3、重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc轉染細胞生長狀態良好的CHO細胞常規培養至50％～75％匯合，用胰酶消化收集細胞，用預冷的電穿孔緩衝液衝洗兩次，然後將細胞重新懸浮在該緩衝液中，使細胞的終濃度為(0.5-1.0)×107個細胞/ml。取0.8ml細胞懸液放入電轉杯中，加入適量的重組載體pcDNA3.1(+)-IRES-CD34-luc並充分混合，冰浴中放置10min，電擊一次。電擊後將電轉杯放入冰浴中10min。用適當的完全培養基稀釋細胞，置於37℃，5％CO2孵箱中培養。
實施例4、運用MACS系統分選轉染細胞轉化後細胞常規培養24～48小時，使轉化的外源基因得以表達。棄去舊培養基，加入胰酶消化液消化，輕輕吸出消化液，加入10ml PBS(含2mM EDTA)輕輕吹吸，轉移入離心管中離心(800g，10min)收集細胞，用10mlPBS(含2mM EDTA)洗一次，之後採用Direct CD34 Progenitor Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec)利用免疫磁珠分選(MACS)的方法對其進行分選。分選得到的細胞可直接進行下一步的分析或者加入培養基後繼續培養。
採用本發明中的載體與常規載體相比，可以大大提高轉染細胞分選效率，縮短轉染細胞分選的周期。
權利要求
1.一種含有CD34標誌基因用於轉染細胞分選的新載體，其特徵在於載體中包含一段編碼細胞表面分子CD34的核苷酸序列，將目的核苷酸序列插入該載體的多克隆位點後經轉染細胞，可以實現目的核苷酸序列和CD34基因的共同表達。
2.根據權利要求1所述的載體的構建方法，其特徵在於採用多基因共表達載體的構建方式來實現目的核苷酸序列和CD34基因兩者的共同表達。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特徵在於可採用雙順反子載體的構建方法構建。
4.根據權利要求2所述的構建方法，其特徵在於可採用多啟動子載體的構建方法構建。
5.權利要求1所述的載體在轉染細胞分選中的應用，即利用轉染細胞在表達目的核苷酸的同時所新獲得的CD34細胞表面標誌而對目的細胞進行分選。
6.根據權利要求5所述的轉染細胞的分選方法，其特徵在於利用免疫結合的原理而進行的分選，可採用的方法包括免疫磁珠分離、免疫吸附法分離等。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體的說是一種含有CD34標誌基因用於轉染細胞分選的載體的構建方法及其應用。本發明構建了包含有編碼細胞表面分子CD34的核苷酸序列的載體，採用了多基因共表達載體的構建方式，將目的核苷酸序列插入該載體多克隆位點後轉染細胞，載體中CD34基因和目的核苷酸序列可實現共同表達。利用轉染細胞獲得的新的細胞表面標誌，採用免疫結合的原理來實現分選陽性細胞的目的。本發明提供了一種新的分選轉染細胞的方法，不僅簡化了傳統的轉染細胞分選煩瑣又耗時的過程，而且提高了轉染細胞的分選效率，在生物醫學領域具有極佳的應用前景。
文檔編號C12N15/65GK1712535SQ200410049999
公開日2005年12月28日 申請日期2004年6月25日 優先權日2004年6月25日
發明者裴雪濤, 嶽 文, 曲笑霞, 秦立篷, 高豔紅, 閆舫 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所