一種利用溴化己二甲胺提高基因轉染豬皮轉染效率的方法

2023-07-24 23:04:16

專利名稱：：一種利用溴化己二甲胺提高基因轉染豬皮轉染效率的方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學
技術領域：
，具體涉及一種提高攜帶外源基因的重組腺病毒載體轉染豬皮效率的方法。
背景技術：
：燒傷是一類發生率及致殘率均較高的特殊類型創傷，其根本問題就是創面問題，如果燒傷創面得不到及時有效的覆蓋、封閉，必將引起患者機體內環境的紊亂、感染及多臟器功能障礙的發生；此外，還可能出現創面的非生理性癒合，使痣痕形成增加，殘疾程度加劇。因此，對燒傷創面進行皮膚移植的研究是現代燒傷治療的迫切需要；也是燒傷研究的熱點及》,點。深度燒傷創面需經皮膚移植才能癒合，而大面積、特大面積燒傷患者自體皮源嚴重不足，需經非自體(同種異體或異種)皮覆蓋創面方能取得較好的臨床效果，同種異體皮(主要是屍體皮)是目前燒傷創面治療中公認效果較好的生物敷料，但由於來源和倫理等多種條件限制，同種異體皮無法滿足臨床需求。豬皮由於與人皮在組織結構和生理功能上的高度相似性，是臨床使用最為廣泛的異種皮膚，但由於豬和人之間的種屬差異，其排斥反應比較嚴重，無法起到長期覆蓋作用。專利申請號為00103528.2,發明名稱是"一種用重組基因轉染的異體皮膚"的專利申請公開了利用傳統的Ad5腺病毒載體攜帶免疫抑制基因CTLA4Ig對豬皮膚進行體外轉染，可使CTLA4Ig蛋白在豬皮組織活細胞內表達，從而起到抑制免疫排斥的發生，在燒傷創面誘導移植皮膚局部特異性免疫耐受，達到延長移植異種皮膚成活的目的。但是，由於Ad5腺病毒載體和被轉染細胞表面均帶負電荷，相互之間存在靜電排斥力，所以上述利用Ad5腺病毒載體攜帶免疫抑制基因CTLA4Ig對豬皮膚組織細胞的轉染效率較低，需要較高滴度的病毒感染才能發揮效果，使得基因轉染豬皮的生產成本較高。
發明內容本發明的目的是提供一種提高基因轉染豬皮轉染效率的方法，該方法可以提高Ad5重組腺病毒載體對豬皮膚細胞的轉染效率。實現本發明目的的技術方案如下一種利用溴化己二甲銨提高基因轉染豬皮轉染效率的方法，包括如下步驟1)製備待轉染的豬皮膚；2)使用濃度為5000-15000jug/ml溴化己二甲銨對108pFU/mlAd5重組腺病毒載體進行震蕩混合，孵育後製備成轉染液；3)將步驟2)製備的轉染液對步驟1)製備的豬皮膚進行轉染。其中，步驟l)所述豬皮膚是任何一種品系的豬皮膚，優選巴馬香豬皮膚，進一步優選小於6個月豬齡的豬皮膚，最優選4-6月齡的巴馬香豬皮膚。所述豬皮膚的厚度為0.1-1.0毫米，優選0.4-0.6毫米。其中，步驟2)中所述Ad5重組腺病毒載體含有CTLA4Ig重組基因，可按照專利申請號為00103528，發明名稱是"一種用重組基因轉染的異體皮膚"的專利申請公開的方法製備CTLA4Ig重組基因和含有CTLA4Ig重組基因的Ad5腺病毒載體。其中，步驟2)中所述孵育具體為4。C孵育10-20分鐘。其中，步驟3)中所述轉染具體是在C02培養箱內37。C轉染1-3小時。其中，步驟3)具體為將步驟2)中處理後的轉染液按0.8-2.2ml/cm2的比例對步驟1)中處理後的豬皮膚在C02培養箱內37。C轉染1-3小時。其中步驟3)優選將步驟2)製備的轉染液按lml/cm2的比例對步驟l)製備的豬皮膚在C02培養箱內37。C轉染2小時。本發明中使用的溴化己二曱銨(hexadimethrinbromide)具有中和肝素的作用，溶解後產生許多正電荷，凝聚胺(Polybrene)是溴化己二甲胺多聚物，帶有多價陽離子。當溴化己二甲銨與Ad5重組腺病毒載體採用適合的比例混合後轉染豬皮膚細胞時，可中和腺病毒載體和細胞表面的陰離子基團，降低了腺病毒載體和細胞表面之間的靜電排斥力，從而增加腺病毒與細胞的相互接觸，提高腺病毒載體對豬皮膚細胞的轉染效率。本發明在體外利用溴化己二曱銨對Ad5重組腺病毒載體轉染液進行處理，以此處理後的腺病毒轉染液對豬皮組織進行轉染，與未經處理的腺病毒轉染相比，發現可以提高轉染效率4-12倍，大大的提高了基因轉染的效率，降低了生產成本。而且試驗表明，溴化己二甲銨不會引起腺病毒載體和細胞的變性或失活，因此可以^艮好地發揮協助腺病毒載體對豬皮膚的轉染作用。圖l為CTLA4Ig標準品的吸光值標準曲線圖。具體實施例方式以下通過實施例詳細說明本發明。在下面的實施例中所涉及的實驗材料如無特別說明均可通過市場購得或通過本領域常規的製備方法獲得。本發明所使用的含有CTLA4Ig重組基因的Ad5腺病毒載體，可按照專利申請號為00103528,發明名稱是"一種用重組基因轉染的異體皮膚"的專利申請^^開的方法製備。實施例1利用本發明方法製備CTLA4Ig基因轉染豬皮步驟l:取皮消毒將豬處死後用洗衣粉清洗外部皮膚，手術刀刮毛，再用5%碘伏消毒，酒精脫色後無菌取皮，在潔淨環境下用皮鼓將豬皮剖成厚度層為0.6mm厚度皮塊備用。步驟2:溴化己二甲銨對Ad5-CTLA4Ig腺病毒載體的處理使用濃度為5000-15000nig/ml的溴化己二曱銨(FLUKA公司產品)對108PFU/mlAd5-CTLA4Ig腺病毒載體進行震蕩混合，在4。C下孵育10-20分鐘，製備成轉染液。步驟3:腺病毒載體轉染將步驟2中處理後的轉染液按lml/lci^的比例對步驟1中處理後的皮片進行轉染，轉染條件為C02培養箱內37。C轉染2h,同時以未經溴化己二曱銨處理的腺病毒轉染液為對照對步驟1中處理後的皮片進行轉染，對照組處理措施除腺病毒轉染液未經溴化己二曱銨處理外，其餘處理措施及轉染條件和溴化己二曱銨處理組完全一致。實施例2溴化己二曱銨處理組與對照組的目的基因轉入量比較提取實施例1中溴化己二曱銨處理組和對照組中的基因組總DNA(提取方法參照《分子克隆實驗指南》(第3版)463-471。科學出版社)。然後進行目的基因轉染的定量檢測，以確定目的基因的轉入量。目的基因轉染的定量檢測的方法如下用目的引物與內參引物分別對樣品DNA進行擴增。目的引物5，AGGTCAAGTTCAACTGGTACG3，，見SEQIDNO:1。5，CTTGTACTCCTTGCCATTCA3，，見SEQIDNO:2。內參引物:5，TTTAACTCTGGCAAAGTGGAC3，，見SEQIDNO:3。5，GGTGGAATCATACTGGAACAT3，，見SEQIDNO:4。定量PCR反應程序95°C3min94°C30s60°C30s讀板40個循環72°C3min95。Clmin55°Clmin熔解曲線/人55。C到95°C,每0.5。C循環一次10s。目的基因的量比上內參基因的量即為目的基因的導入量。實驗結果表明經用溴化己二曱銨處理的腺病毒轉染豬皮後目的基因導入量較未經處理的腺病毒轉染豬皮提高了4-12倍。實施例3ELISA檢測溴化己二甲銨處理組和對照組的腺病毒轉染豬皮後豬皮組織中CTLA4Ig的表達量的比較1)樣品準備將實施例1轉染後的豬皮組織繼續培養48小時，然後將不同處理的豬皮組織在滅菌燒杯或一次性培養亞中用滅菌PBS漂洗三次，在一次性培養jnr內剪碎，每張皮片加1.5ml滅菌PBS用勻漿器在離心管內製備勻漿，再離心5000r/min,3min取上清作為樣品；培養皮片後的培養基也作為樣品。2)ELISA檢測CTLA4Ig標準品標定曲線用CTLA4Ig標準品(R&DSystemUSA)製做標定曲線和曲線方程，結果見表l,根據表l結果製作CTLA4Ig標準品的吸光值標準曲線圖，見圖1。表明隨標準品濃度增加，吸光值也隨之增力口，並呈線性相關趨勢，相關係數112=0.9622，表明相關程度較高，說明利用此圖可以準確4全測樣品中0-24|ug的CTLA4Ig濃度。樣品中CTLA4Ig測試酶標板每孔加入100jal(1|ag/ml)大鼠抗CTLA4Ig的一抗(Abnova),4。C包被過夜，洗板，然後每孔加入200iul封閉液(l°/。BSA+0.02%Tween-20+PBS)4。C過夜，洗-f反，每孔加入100|al樣品室溫反應2h,洗板，每孔加入100p1(1|ug/ml)羊抗大鼠二抗(southernbiotech),室溫反應2h,洗板，每孔加入100|a1底物顯色液(雙氧水+鄰苯二胺)，室溫反應30min，力口入100ju12MH2S04,用酶標儀在49Qnm波長測定吸光度。。實驗結果見表2，將表2數值帶入CTLA41g標準品的吸光值標準曲線方程(Y=0.0444X+0.1621)，得出溴化己二曱銨處理組勻漿中表達CTLA4Ig量為139ng/ml;對照組勻漿中含量為130ng/ml，說明溴化己二曱銨處理組的Ad5-CTLA4Ig腺病毒轉染豬皮組織勻漿中表達CTLA4Ig量比對照組的高9ng/ml;溴化己二曱銨處理組的Ad5-CTlJUIg腺病毒轉染豬皮組織培養基中分泌的CTLA4Ig為135ng/ml，對照組的培養基中分泌的CTLA4Ig為70ng/ml，處理組比對照組多65ng/ml。表1用CTLA4Ig標準品3次重複測試吸光值標準品(ng)024681012141618202224吸光值(重複l)0.1240.2160.3270.3920.5860.540.7080.9370.8391.060.8991.0321.254吸光值(重複2)0.1350,2380.3380.3940.6550.540.7060.9890.8411.0751.0571.0411.243吸光值(重複3)0.1620.2170.3250.40.6650.530.7340.6410.8661.0711.0570.9831.289平均值0.14030.2240.330.3950.6350.540.7160.8560,8491.0691.0041.0191.262表2溴化己二曱銨處理組與對照組轉染豬皮CTLA4Ig吸光值比較tableseeoriginaldocumentpage10以上實施例只是用於進一步說明本發明，而不是用來限制本發明的保護範圍。凡是在本發明保護範圍內所做出的具體實施方式及應用範圍上的些許變動，也屬於本發明的保護範圍。序列表重慶宗申軍輝生物技術有限公司—種利用溴化己二甲銨提高基因轉染豬皮轉染效率的方法MP0807724Patentlnversion3.3121腿Artificial目的引物1aggtcaagttcaactggtacg21220DNAArtificial目的引物2cttgtactccttgccattca20321DNAArtificial內參引物3tttaactctggcaaagtggac21421腿Artificial內參引物4ggtggaatcatactggaacat2權利要求1、一種利用溴化己二甲銨提高基因轉染豬皮轉染效率的方法，其特徵在於包括如下步驟1)製備待轉染的豬皮膚；2)使用濃度為5000-15000μg/ml溴化己二甲銨對108PFU/mlAd5重組腺病毒載體進行震蕩混合，孵育後製備成轉染液；3)將步驟2)製備的轉染液對步驟1)製備的豬皮膚進行轉染。2、根據權利要求l所述的方法，其特徵在於所述豬皮膚是巴馬香豬皮膚。3、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述豬皮膚是小於6個月豬齡的豬皮膚。4、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述豬皮膚是4-6月齡的巴馬香豬皮膚。5、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述豬皮膚的厚度為0.1-1.0亳米。6、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟2)中所述Ad5重組腺病毒載體含有CTLA4Ig重組基因。7、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟2)中所述孵育具體為4。C孵育10-2G分鐘。8、根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟3)中所述轉染具體是在C02培養箱內37"轉染1-3小時。9、權利要求l所述的方法，其特徵在於步驟3)具體為將步驟2)製備的轉染液按0.8-2.2ml/cm2的比例對步驟1)製備的豬皮膚在C02培養箱內37。C轉染l-3小時。10、權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟3)具體為將步驟2)製備的轉染液按lml/cm2的比例對步驟1)製備的豬皮膚在C(U告養箱內37匸轉染2小時<全文摘要本發明涉及一種利用溴化己二甲銨提高基因轉染豬皮轉染效率的方法，包括如下步驟1)製備待轉染的豬皮膚；2)使用濃度為5000-15000μg/ml溴化己二甲銨對108PFU/mlAd5重組腺病毒載體進行震蕩混合，孵育後製備成轉染液；3)將步驟2)製備的轉染液對步驟1)製備的豬皮膚進行轉染。本發明中溴化己二甲銨與Ad5重組腺病毒載體混合後轉染豬皮膚細胞時，其攜帶的陽離子可中和腺病毒載體和細胞表面的陰離子，降低了腺病毒載體和細胞表面之間的靜電排斥力，從而增加腺病毒載體與豬皮膚細胞的相互接觸，提高腺病毒載體對豬皮膚的轉染效率。文檔編號C12N15/67GK101613710SQ20081012682公開日2009年12月30日申請日期2008年6月24日優先權日2008年6月24日發明者志劉,軍吳,葛良鵬,泓魏申請人:重慶宗申軍輝生物技術有限公司