細胞體外收集方法及其應用、體外細胞材料及其應用的製作方法

2023-07-24 14:00:36

細胞體外收集方法及其應用、體外細胞材料及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種細胞收集方法、細胞材料。針對現有Transwell遷移研究對實驗結果提示的科學內容利用有限的缺陷，本發明首先提供了一種細胞體外收集方法。本方法在Transwell細胞遷移培養結束並去除Transwell上室、下室內培養液後，採用胰酶消化並結合機械振蕩的方法分別對Transwell細胞遷移實驗後上室、下室中的細胞進行消化、收集；胰酶細胞消化操作中，洗滌液為pH?7.35～7.45磷酸鹽緩衝液，胰酶細胞消化液含0.25％胰酶和0.01％EDTA。本發明同時提供一種包括由相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料。本發明還提供上述收集方法與細胞材料在細胞生物學行為分析試驗中的應用。本發明能夠使Transwell體外遷移實驗拓展到細胞遷移的細胞生物學行為與分子生物學研究。
【專利說明】細胞體外收集方法及其應用、體外細胞材料及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細胞收集方法、細胞材料，特別是涉及一種細胞體外收集方法，以及體外細胞材料。屬於生物、醫學細胞體外實驗【技術領域】。
【背景技術】
[0002]細胞遷移是細胞在外源性信號刺激下產生的趨化移動，通常是細胞感受到某些物質的濃度梯度後從低濃度王高濃度區域移動。在生理狀態下，細胞遷移在細細胞覓食、傷口癒合、胚胎發生、組織修復、免疫反應等過程中發揮著重要作用；在病理狀態下，細胞遷移也推動了癌症轉移、動脈粥樣硬化和關節炎等疾病的發生和發展。因而，細胞遷移是當前生命科學的一個重要研究方向。
[0003]Transwell遷移技術是目前應用最廣泛的研究體外細胞遷移的實驗方法。實驗所需Transwell遷移體系採用Transwell小室(Transwell insert)與普通多孔細胞培養板共同搭建完成。Transwell小室外形為一個可放置在普通細胞培養板孔板裡的杯狀裝置，底部帶通透性膜，膜上帶有孔徑大小0.1 - 12.0μπι的微孔。研究中根據不同的實驗目的，選用不同的微孔直徑。細胞遷移研究通常選用帶8.0 μ m或12.0 μ m微孔的Transwell體系。實驗中將Transwell小室放入普通細胞培養板中，Transwell小室內稱上室或內室，細胞培養板內稱下室或者外室。實驗中，通過在下室添加各種趨化因子，誘導細胞從上室往下室遷移。根據生產廠商不同，Transwell小室又稱Boyden Chamber或者Thincert小室。由於領域內一般採用美國Corning公司生產的Transwell小室，因而，目前這類體外細胞遷移研究方法廣泛採用「Transwell法」作為其常規名稱。Transwell遷移技術可靠性強、重複性好，是目前最廣泛的細胞遷移研究方法。但是目前Transwell遷移研究中對實驗結果採用的分析方法均比較簡單，通常是單純分析計算細胞遷移率，對實驗結果提示的科學內容利用有限。
[0004]細胞體內研究中已經揭示細胞遷移活性高和低的細胞的各種細胞生物學行為，包括細胞黏附、增殖、分化、凋亡等均勻顯著不同，國內外學者們對此已經進行了深入研究。然而受體內研究的限制，研究者很難獲取具有不同遷移活性的細胞進行進一步研究。從Transwell遷移實驗的設計原理分析，Transwell體外遷移實驗能將細胞材料區分為遷移能力強和遷移能力弱的兩群細胞，已為完成上述細胞體外行為研究創造了前提條件。但是，細胞在Transwell小室中的遷移是一個非常複雜的過程:細胞內部的蛋白質和離子在感知上下小室的濃度梯度後重新排列，並變性伸出極狀足，形成粘著斑，牽拉細胞向前，從而穿過狹小的Transwell微孔,逐漸從Transwell膜的上室遷移到下室。由於真核細胞的直徑一般在10 μ m~100 μ m之間，遠大於Transwell遷移實驗8.0 μ m~12.0 μ m的微孔直徑。因而在Transwell細胞遷移實驗中，細胞除了粘附在Transwell膜的上下兩個底面上,還會有大量的細胞會「陷」在Transwell膜上的微孔內，難以有效收集用於後繼研究。尤其Transwell小室面積較小，採用常規的化學消化方式無法進行批量化操作，細胞收集量較低，不足以用於後續細胞生物學和分子生物學研究。另外，在常規的細胞消化方法中細胞是從其培養平面上脫落，細胞消化時只需要破壞細胞之間的連接即可；而在Transwell遷移體系中，細胞要穿過孔徑小於其直徑的狹小的微孔，消化收集細胞時需要細胞從其嵌附的微孔中快速脫離，此過程很易損傷細胞，甚至導致細胞裂解、碎片化。因此，整體上，儘管體外細胞研究技術具有幹預因素單純、實驗條件易控、經濟快速、重複性好，且能夠進行深入的機制研究等優點，但受現有技術條件的制約，使得體外細胞遷移實驗通常只能簡單地通過分析細胞遷移率來了解細胞的遷移能力，而研究者所希望的將遷移實驗的結果細胞進一步利用，例如獲取高遷移活性的細胞進一步研究，在細胞體外實驗條件下比較遷移細胞與非遷移細胞的生物學行為的研究始終難以開展。

【發明內容】

[0005]本發明的目的就是針對現有技術的不足，提供一種細胞體外收集方法，該方法針對性與細胞遷移實驗相結合，對遷移實驗結束後的細胞進行有效收集；收集到的細胞是在相同趨化因子誘導下具有不同遷移活性的細胞，可應用於細胞體外實驗條件下遷移細胞與非遷移細胞的比較研究；該細胞體外收集方法可應用於細胞克隆、增殖，凋亡、基因和蛋白表達、形態學檢測等試驗。
[0006]為實現上述目的，本發明首先提供一種細胞體外收集方法，其技術方案如下: [0007]一種細胞體外收集方法，其特徵在於:應用於Transwell細胞遷移實驗；Transwell細胞遷移培養結束並去除Transwell上室、下室內培養液後，採用胰酶消化並結合機械振蕩的方法分別對Transwell細胞遷移實驗後上室、下室中的細胞進行消化、收集；胰酶細胞消化操作中，洗滌液為PH 7.35~7.45磷酸鹽緩衝液，胰酶細胞消化液含0.25%胰酶和 0.01% EDTA。
[0008]本發明細胞體外收集方法技術基本技術原理是將Transwell體外遷移實驗與體外細胞培養方法相結合。Transwell細胞遷移培養結束並去除TranswelI上室、下室內培養液後，殘留並附著在Transwell通透性膜上層表面的細胞是非遷移細胞(遷移能力低)，而附著於Transwell通透性膜下層表面以及嵌附在Transwell通透性膜微孔內的細胞是遷移細胞(遷移能力高)，通過胰酶消化並結合機械振蕩的方法可將附著於通透性膜表面以及鑲嵌於微孔內的細胞消化並收集，從而獲得Transwell體外細胞遷移實驗條件下無遷移行為的細胞與有遷移行為的細胞而進行下一步研究。
[0009]在優選方式下，上述細胞體外收集方法可依照如下步驟實施:
[0010]步驟S1、初次洗滌
[0011]Transwell細胞遷移培養結束並去除Transwell上室、下室內培養液後，在上室、下室中分別加入磷酸鹽緩衝液洗滌培養室，收集上室與下室中洗滌液分別存入二離心管中，分別標記為離心管A、離心管B ;
[0012]步驟S2、消化收集
[0013]向Transwell上室、下室中分別加入胰酶細胞消化液，待細胞分散懸浮，分別收集上室、下室中消化液對應加入離心管A、離心管B中，分別向離心管A、離心管B中加入牛血清終止細胞消化；
[0014]步驟S3、再次洗滌收集
[0015]分別向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩衝液，水平振蕩，分別收集上室、下室中洗滌液對應加入離心管A、離心管B中；
[0016]步驟S4、離心收集細胞
[0017]將離心管A、離心管B離心，去除上清液，分別向離心管A、離心管B中加入磷酸鹽緩衝液，重懸並收集離心管底部細胞團塊，得收集細胞。
[0018]上述細胞體外收集方法，在必要時需重複步驟S3、再次洗滌操作一次，即在消化收集操作之後進行兩次洗滌收集。
[0019]上述細胞體外收集方法共進行2~3次貼壁細胞的收集，只有第1次，即步驟S2中，在胰酶消化液中進行，其餘均採用磷酸鹽緩衝液洗滌結合水平搖床機械振蕩的方法進行收集，這樣的操作既能減少細胞暴露在胰酶中的時間，又能提高細胞的收集效率。
[0020]上述方法藉助前後主要操作步驟間的配合能夠最大程度提高收集效率。具體是:
[0021]在步驟SI中，向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩衝液洗滌，收集少量漂浮的非貼壁細胞。
[0022]在步驟S2中，向Transwell上室、下室中分別加入胰酶細胞消化液可以消化貼附在Transwell膜上下兩側的細胞，向收集有磷酸鹽緩衝液和胰酶液的離心管中加入牛血清終止消化反應，而非直接在Transwell上室、下室中加入含牛血清的細胞培養基終止消化反應，可以避免在上室與下室中產生氣泡，既減少對細胞的損傷，又提高細胞收集率。在常規的胰酶消化細胞的過程中，是將含牛血清的培養基加入胰酶中終止細胞消化反應，而在本方法中若照此操作，由於血清成分的存在，在吹打收集細胞過程中很容易產生氣泡，直接產生3方面危害:第一，氣泡在破裂時機械應力很容易損傷細胞；第二，氣泡一旦產生會影響液體的收集，導致細胞收集不徹底；第三，氣泡一旦產生影響視野的清晰度，不易在在倒置顯微鏡下觀察細胞的消化程度。而在本發明方法步驟S2中，由於不需要吹打細胞，可以徹底避免氣泡產生。同時，由於直接加入牛血清中和消化反應，而不是加入含少量牛血清的培養基，也可以減少整個收集液的體積，從而減少後續離心收集的時間。
[0023]在步驟S3中，通過向Transwell上室、下室中再次加入磷酸鹽緩衝液洗滌並結合機械水平振蕩，便於殘留的細胞脫離，能夠再次收集殘留於Transwell膜兩側的細胞以及嵌於Transwell膜微孔內的細胞。洗漆中採用水平機械振蕩使細胞從Transwell通透性膜上、上表面脫離而非常規的吸管吹打細胞致其脫離，可以有效減少對細胞的損傷、提高收集率，並可簡化操作，提高操作效率。
[0024]在步驟S4中，經離心、重懸操作，分別收集得到目標細胞。
[0025]在優選條件下，上述細胞體外收集方法可以分別做如下優化:
[0026]優化一:方法中使用洗滌液為pH 7.4的磷酸緩衝溶液。
[0027]優化二:步驟S2中，在胰酶細胞消化液含0.25%胰酶和0.01 % EDTA條件下，胰酶細胞消化液加入量以分別覆蓋Transwell上室與下室底部為宜。胰蛋白酶對細胞的分離作用與細胞的類型和細胞的性質關係密切，不同的組織或細胞系對胰蛋白酶的作用反應不一樣，胰蛋白酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關。經前期試驗確定，本發明方法中，在與Transwell細胞遷移實驗相結合的條件下，Transwell上室、下室中胰酶細胞消化液的量是重要的細胞分散控制條件。針對常用Transwell培養室，建議的胰酶細胞消化液加入量為:24孔Transwell培養室(Transwell小室直徑6.5mm)上室加0.1ml、下室加
0.6ml ； 12 孔 Transwell 培養室(Transwell 小室直徑 12mm)上室加 0.5ml、下室加 1.5ml ；6孔Transwell培養室(Transwell小室直徑24mm)上室加1.5ml、下室加2.6ml。
[0028]優化三:步驟S2中，使用100%牛血清終止消化反應，其目的是減少離心管中液體總體積，減少後續離心時間提高細胞收集量。由於步驟S2中採用向收集有磷酸鹽緩衝液和胰酶液的離心管中加入牛血清終止消化反應，離心管中事先收集的磷酸鹽緩衝液已對胰酶液起到分散作用，因此使用100%牛血清可以順利終止消化反應，並在此基礎上控制離心管中液體總體積，提高收集效率。
[0029]優化四:步驟S3中，水平振蕩採用水平搖床振蕩，條件為100r/min~150r/min、振蕩5min。在細胞消化操作中，採用吸管吹打細胞是使貼壁細胞脫落分散的常規方式，但本發明經前期試驗發現，由於Transwell小室底部通透性膜結構的特殊性，採用吸管吹打很難使嵌附在通透性膜微孔內的細胞完全脫落下來，並且容易產生氣泡，對細胞損壞大，細胞收集效率不高。而採用水平搖床實現的輕微機械振蕩並有效控制振蕩幅度，避免吹打細胞時細胞受力不均，同時避免產生氣泡，利於附著在微孔材料內與通透性膜表面的細胞均勻脫落。既能較少細胞損傷，又顯著提高了收集率。
[0030]優化五:步驟S4中，將Transwell上室、下室離心管離心，離心條件為:轉速200RCF(xg)~250RCF(xg)、時間 lOmin。 [0031]優化六:步驟S4中，向離心管中加入pH 7.35~7.45磷酸鹽緩衝液0.5ml~1ml。
[0032]本發明細胞體外收集方法可應用於細胞生物學行為分析試驗，包括但不限於細胞克隆、細胞增殖，細胞凋亡、細胞基因和蛋白的表達試驗、細胞形態學檢測試驗等。
[0033]採用本發明體外細胞收集方法收集到的細胞是在相同趨化因子誘導下表現出高、低兩種遷移活性的細胞，可作用理想的細胞材料應用於細胞遷移的細胞生物學行為與分子生物學研究，包括細胞克隆、增殖，凋亡、基因和蛋白的表達，以及形態學檢測等。基於此，本發明提供一種體外細胞材料，其技術方案如下:
[0034]一種體外細胞材料，其特徵在於:包括由相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料；所述體外細胞材料的製備首先採用Transwell遷移實驗使原始細胞材料在趨化因子誘導下遷移培養，當Transwell細胞遷移培養結束後採用上述體外細胞收集方法收集細胞，自Transwell上室中收集得到的細胞材料是所述低遷移性活細胞材料，自Transwell下室中收集得到的細胞材料是所述高遷移性活細胞材料。
[0035]上述體外細胞材料可應用於細胞生物學行為分析試驗，包括但不限於細胞克隆、細胞增殖，細胞凋亡、細胞基因和蛋白表達、細胞形態學檢測試驗等。
[0036]本發明體細胞收集方法可與多種細胞生物學行為實驗方法相結合，包括細胞克隆實驗、細胞增殖實驗，細胞凋亡實驗、基因和蛋白的表達實驗，以及細胞形態學檢測等。其技術方案如下:
[0037]—種細胞生物學行為分析方法，是一種細胞形態學檢測方法，其特徵在於:首先採用Transwell遷移實驗使原始細胞材料在趨化因子誘導下遷移培養，當Transwell細胞遷移培養結束後採用上述體外細胞收集方法收集細胞，分別得到高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料；其次分別將所述高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料接種至細胞培養基進行細胞體外培養；當體外細胞培養結束分別檢測高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料形態；所述細胞體外培養中選用的培養基及培養條件根據原始細胞材料特性確定。[0038]一種細胞生物學行為分析方法，是一種細胞骨架形態學檢測方法，其特徵在於:首先採用Transwell遷移實驗使原始細胞材料在趨化因子誘導下遷移培養，當Transwell細胞遷移培養結束後採用上述體外細胞收集方法收集細胞，分別得到高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料；其次分別對所述高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料的細胞骨架染色；染色結束後觀察檢測細胞骨架形態；所述細胞骨架染色方法根據原始細胞材料特性確定。
[0039]一種細胞生物學行為分析方法，是一種細胞自我更新能力檢測方法，其特徵在於:首先採用Transwell遷移實驗使原始細胞材料在趨化因子誘導下遷移培養，當Transwell細胞遷移培養結束後採用上述體外細胞收集方法收集細胞，分別得到高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料；其次分別對高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料進行細胞克隆培養；克隆培養結束後染色檢測細胞自我更新能力；所述細胞克隆培養條件根據原始細胞材料特性確定。
[0040]一種細胞生物學行為分析方法，是一種細胞增殖能力檢測方法，其特徵在於:首先採用Transwell遷移實驗使原始細胞材料在趨化因子誘導下遷移培養，當Transwell細胞遷移培養結束後採用上述體外細胞收集方法收集細胞，分別得到高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料；其次分別檢測高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料的細胞增殖能力，檢測方法根據原始細胞材料特性確定。
[0041]與現有技術相比，本發明的有益效果是:(I)本發明體外細胞收集方法將Transwell體外遷移實驗與體外細胞培養方法相結合,對Transwell體外遷移以後的細胞進行消化與收集，分別收集得到高遷移活性與低遷移活性的細胞，使Transwell體外遷移實驗從簡單的分析細胞的遷移能力和遷移效率拓展到細胞遷移的細胞生物學行為與分子生物學研究；(2)本發明外細胞收集方法在各操作步驟中，通過設計不同細胞收集方法(在胰酶消化液中收集或在磷酸鹽緩衝液中收集)、控制胰酶細胞消化液濃度與消化時間、選擇加入牛血清終止細胞消化反應的步驟與環境、結合機械振蕩輔助細胞從培養室中脫落分散的方法等六方面主要條件的優化，整體上保證了在Transwell遷移實驗的精細條件下能夠對遷移結果的微量細胞進行有效收集，保證收集到足量的細胞用於後繼研究；(3)本發明提供了由相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料，該材料是理想的細胞遷移材料，能夠應用於細胞生物學行為與分子生物學研究；(4)本發明提供了與體細胞收集方法相結合的多種細胞生物學行為實驗方法；(5)本發明方法為體外細胞遷移機制與行為研究提供新的技術手段，且該技術手段建立在成熟的Transwell體外遷移實驗之上，應用範圍廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1-1:實施例1細胞接種-收集量曲線。結果顯示細胞的收集量與接種量成正相關。
[0043]圖l-2a、圖l_2b顯示細胞收集效率。圖l_2a顯示實施例1中細胞經過Transwell培養16h後，遷移至下室的人骨髓間充質幹細胞結晶紫染色圖片，可見遷移細胞良好鋪展在小室的膜底面；圖l_2b顯示實施例1中採取本發明所用的細胞消化方法收集上室非遷移細胞和下室遷移細胞，Transwell膜表面結晶紫染色圖片。可見Transwell膜上幾乎沒有細胞餘留，說明本發明的細胞收集效率較高。
[0044]圖2a、圖2b顯示實施例2中細胞材料分別培養24h後的倒置顯微鏡照片。圖2a表示上室非遷移細胞，圖2b表示下室遷移細胞。從圖片中可見，與上室非遷移細胞不同，遷移的細胞中有大量細胞碎片，可見細胞在遷移過程中有一定程度的機械損傷。
[0045]圖3a、圖3b顯示實施例3中細胞材料骨架染色結果。圖3a表示上室非遷移細胞，圖3b表示下室遷移細胞。可見細胞在遷移過程中細胞形態發生改變，使得上室非遷移細胞和下室遷移細胞呈現明顯不同的細胞骨架形態特徵。
[0046]圖4a、圖4b顯示實施例4中細胞材料進行克隆形成實驗的結果。圖4a表示上室非遷移細胞，圖4b表示下室遷移細胞。結果顯示，上室非遷移細胞形成的細胞克隆較小而稀疏，下室遷移細胞形成的克隆較大而緻密，說明不同遷移活性的細胞的自我更新能力不
O
[0047]圖5顯示CKK-8法檢測實施例5中細胞材料的增殖曲線。從圖中可以看出，不同遷移活性的細胞的增殖能力也明顯不同。
【具體實施方式】
[0048]下面結合附圖，對本發明的優選實施例作進一步的描述。
[0049]實施例一
[0050]如圖1-1、圖1-2所示，用本發明方法對Transwell體外遷移培養結束的細胞進行收集。
[0051]本實施例米用人骨髓來源的間充質幹細胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,以下簡稱hMSCs)作為研究對象，採用人來源的重組TOGF-BB(血小板衍生生長因子)作為趨化因子誘導細胞遷移。
[0052]1、實驗材料及試劑
[0053]Transwell小室(即Transwell上室):Coring公司的適用於6孔細胞培養板的Transwell小室，小室面積4.67cm2，直徑24mm ;貨號:#3428、#354576 ;膜材料為聚碳酸脂(Polycarbonate, PC)或者聚對苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Terephthalate, PET),孔隙大小8.0um。
[0054]細胞培養板(即Transwell下室):Corning公司的6孔細胞培養板，貨號CLS3516-50EA
[0055]DMEM低糖培養基:Gibco公司產品，貨號11885-076
[0056]磷酸鹽緩衝液:pH 7.35~7.45
[0057]預備趨化培養基:將血小板衍生生長因子(I3DGF-BB)以20ng/ml加入DMEM溶液製得，現用現配。
[0058]血小板衍生生長因子(I3DGF-BB):R&D公司產品，貨號220_ΒΒ_050
[0059]胰酶細胞消化液:含0.25%胰酶和0.01% EDTA的磷酸鹽緩衝液，Gibco公司產品，貨號 R-001-100
[0060]牛血清:Gibco公司產品，貨號10082147
[0061]結晶紫:Sigma公司產品，貨號HT90132
[0062]離心機:Eppendorf公司產品，型號5810[0063]離心管:材料為聚碳酸酯，50ml, Corning公司產品
[0064]血球計數器:sigma公司產品，貨號Z359629-1EA
[0065]移液槍:Eppendorf公司產品，規格Iml
[0066]Leica倒置顯微鏡(型號DMI3000B)
[0067]2、實驗操作
[0068]2.1Transwell體外遷移培養(實驗)
[0069]I)細胞預處理
[0070]進行細胞遷移實驗前換DMEM低糖培養基讓細胞飢餓24h。
[0071]2)製作細胞懸液，預備細胞遷移
[0072]飢餓培養的細胞棄去培養液，用PBS洗I遍，加入胰酶細胞消化液Iml~2ml，加入的量以覆蓋細胞培養板底部為宜，待細胞變圓後加入含10% FBS的低糖DMEM培養基終止消化，採用血球計數器計數，離心收集細胞，轉速200RCF(xg)~250RCF(xg),離心時間5min,用DMEM低糖培養基重懸，並調整細胞密度至2.5 X 105/ml得細胞懸液，待用。 [0073]3)接種細胞及培養
[0074]將Transwell小室加入細胞培養板內，構成Transwell培養室的上室與下室；向Transwell下室中加入預備趨化培養基,加入量2ml/孔；
[0075]取細胞懸液Iml加入Transwell上室,接種時注意動作緩慢,使細胞均勻接種，並避免產生氣泡；
[0076]將細胞在37°C 95%二氧化碳培養箱中培養16h~24h。
[0077]2.2Transwell體外遷移培養細胞收集
[0078]步驟S1、初次洗滌收集
[0079]Transwell細胞遷移培養結束並去除Transwell上室、下室內培養液後，在上室、下室中分別加入磷酸鹽緩衝液洗滌培養室，加入量為上室、下室各Iml ；
[0080]收集上室與下室中洗滌液分別存入兩支50ml離心管中，標記為離心管A、離心管B0
[0081]步驟S2、消化收集
[0082]向Transwell上室、下室中分別加入37°C預熱的胰酶細胞消化液，加入量為上室1.5ml/孔，下室2.6ml/孔^fTranswell培養室置於95 % 二氧化碳培養箱，37°C培養2min~5min ;期間可取出Transwell培養室於倒置顯微鏡下觀察，待細胞呈圓形且分散懸浮後，分別收集上室、下室中消化液對應加入離心管A、離心管B中；若發現細胞在倒置顯微鏡下未呈圓形且分散懸浮，可放入碳培養箱中繼續培養直至細胞呈圓形且分散懸浮。
[0083]分別向離心管A、B中加入100%牛血清終止細胞消化，加入量為胰酶細胞消化液的 10%~20%。
[0084]步驟S3、再次洗滌收集
[0085]分別向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩衝液洗滌培養室，加入量同步驟SI ；
[0086]將Transwell培養室(裝有Transwell培養小室的Corning6孔細胞培養板)置於水平搖床，100r/min~150r/min、時間5min,
[0087]分別收集上室、下室中洗滌液對應加入離心管A、離心管B中；
[0088]重複以上操作。[0089]步驟S4、離心收集細胞
[0090]將離心管A、離心管B離心，轉速200RCF(xg)~250RCF(xg)，時間IOmin ；
[0091]分別去除上清液，向離心管A、離心管B中加入磷酸鹽緩衝液0.5ml~Iml ;分別收集並重懸離心管A、B底部細胞團塊，收集到目標細胞。其中，離心管A中是以人來源的重組TOGF-BB為趨化因子誘導下分離產生的低遷移活性細胞，離心管B中是以人來源的重組TOGF-BB為趨化因子誘導下分離產生的高遷移活性細胞。
[0092]用血球計數器計數，計算上室、下室的細胞比率、細胞遷移率、以及細胞收集效率(圖1-1);通過結晶紫染色分析細胞收集效率(圖l-2a、圖l-2b)。
[0093]本實施例中，結晶紫染色濃度0.1 %,時間10分鐘；採用Leica倒置顯微鏡DMI3000 B進行拍照。
[0094]實施例二
[0095]相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞與低遷移活性細胞的形態學檢測實驗。
[0096]細胞培養基:含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基
[0097]DMEM低糖培養基:同實施例一
[0098]倒置顯微鏡:同實施例一
[0099]以實施例一收集所得離心管A、離心管B中細胞為材料，分別接種至細胞培養基，置於37°C、95%二氧化碳培養箱中，分別培養24h後在倒置顯微鏡下檢測細胞形態學特徵(圖 2a、圖 2b)。
[0100]實施例三
[0101]相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞與低遷移活性細胞的細胞骨架形態學檢測實驗。
[0102]四甲基羅丹明標記的鬼筆環妝(Phalloidin - Tetramethylrhodamine Bisothiocyanate:Sigma 公司產品，貨號 P1951
[0103]倒置顯微鏡:同實施例一
[0104]以實施例一收集所得離心管A、離心管B中細胞為材料，分別採用四甲基羅丹明標記的鬼筆環肽對細胞染色，倒置顯微鏡下檢測細胞骨架形態特徵(圖3a、圖3b)。
[0105]本實施例中，鬼筆環肽染色方法參照Sigma產品說明書操作。
[0106]實施例四
[0107]相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞與低遷移活性細胞的自我更新能力檢測實驗。
[0108]細胞培養板、倒置顯微鏡、結晶紫均同實施例一
[0109]以實施例一收集所得離心管A、離心管B中細胞為材料，分別接種至細胞培養板，接種密度100個/孔，培養時間8d~IOd ;見到明顯可見的細胞克隆後結束培養，採用結晶紫對細胞克隆進行染色採用倒置顯微鏡進行觀察(圖4a、圖4b)。
[0110]本實施例中，細胞培養條件和結晶紫染色方法同實施例一。
[0111]實施例五
[0112]相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞與低遷移活性細胞的增殖能力檢測實驗。[0113]CCK-8 試劑:Sigma 公司產品，貨號 96992-500TESTS
[0114]以實施例一收集所得離心管A、離心管B中細胞為材料，分別採用CCK-8法檢測細胞增殖能力(圖5)。
[0115]本實施例中，採用96孔板進行檢測，細胞接種量為2000個/孔，檢測時間點為1、
3、5、7、9天。檢測時CCK-8加入量為IOul/孔，檢測吸光度為450nm。
【權利要求】
1.一種細胞體外收集方法，其特徵在於:應用於Transwell細胞遷移實驗；Transwell細胞遷移培養結束並去除Transwell上室、下室內培養液後，採用胰酶消化並結合機械振蕩的方法分別對Transwell細胞遷移實驗後上室、下室中的細胞進行消化、收集；胰酶細胞消化操作中，洗滌液為PH 7.35~7.45磷酸鹽緩衝液，胰酶細胞消化液含0.25%胰酶和0.01% EDTAo
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:依如下步驟實施: 步驟S1、初次洗滌 Transwell細胞遷移培養結束並去除Transwell上室、下室內培養液後，在上室、下室中分別加入磷酸鹽緩衝液洗滌培養室，收集上室與下室中洗滌液分別存入二離心管中，分別標記為離心管A、離心管B ; 步驟S2、消化收集 向Transwell上室、下室中分別加入胰酶細胞消化液，待細胞分散懸浮，分別收集上室、下室中消化液對應加入離心管A、離心管B中，分別向離心管A、離心管B中加入牛血清終止細胞消化； 步驟S3、再次洗滌收集 分別向Transwell上室、下室中加入磷酸鹽緩衝液,將Transwell培養室水平振蕩，分別收集上室、下室中洗滌液對應加入離心管A、離心管B中； 步驟S4、離心收集細胞 將離心管A、離心管B離心，去除上清液，分別向離心管A、離心管B中加入磷酸鹽緩衝液，重懸並收集離心管底部細胞團塊，得收集細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述步驟S2中，胰酶細胞消化液加入量為分別覆蓋Transwell上室與下室底部。
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述步驟S2中，胰酶細胞消化液加入量是如下之一: 24孔Transwell培養室，上室加0.1ml、下室加0.6ml ； 12孔小室Transwell培養室，上室加0.5ml、下室加1.5ml ； 6孔小室Transwell培養室，上室加1.5ml、下室加2.6ml。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述步驟S2中，分別向離心管中加入100%牛血清終止細胞消化反應，加入量是胰酶細胞消化液加入量的10%~20%。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於:所述步驟S3中，所述水平振蕩是水平搖床振蕩，100r/min ~150r/min、時間 5min。
7.根據權利要求1~6任一所述的細胞體外收集方法，其特徵在於:應用於細胞生物學行為分析試驗。
8.一種利用權利要求1~6任一所述的細胞體外收集方法實現的細胞生物學行為分析方法，是一種細胞檢測方法，其特徵在於:依如下步驟實施: 步驟S1、首先採用Transwell遷移實驗使原始細胞材料在趨化因子誘導下遷移培養，當Transwell細胞遷移培養結束後採用上述體外細胞收集方法收集細胞，分別得到高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料； 步驟S2、實施如下檢測方法之一之一、細胞形態學檢測:分別將所述高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料接種至細胞培養基進行細胞體外培養；當體外細胞培養結束分別檢測高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料形態；所述細胞體外培養中選用的培養基及培養條件根據原始細胞材料特性確定； 之二、細胞骨架形態學檢測:分別對所述高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料的細胞骨架染色；染色結束後觀察檢測細胞骨架形態；所述細胞骨架染色方法根據原始細胞材料特性確定； 之三、細胞自我更新能力檢測:分別對高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料進行細胞克隆培養；克隆培養結束後染色檢測細胞自我更新能力；所述細胞克隆培養條件根據原始細胞材料特性確定； 之四、細胞增殖能力檢測:分別檢測高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料的細胞增殖能力，檢測方法根據原始細胞材料特性確定。
9.一種體外細胞材料，其特徵在於:包括由相同趨化因子誘導下分離產生的高遷移性活細胞材料與低遷移活性細胞材料；所述體外細胞材料的製備首先採用Transwell遷移實驗使原始細胞材料在趨化因子誘導下遷移培養，當Transwell細胞遷移培養結束後採用上述體外細胞收集方法收集細胞，自Transwell上室中收集得到的細胞材料是所述低遷移性活細胞材料，自Transwell下室中收集得到的細胞材料是所述高遷移性活細胞材料。
10.根據權利要求9所述的體外細胞材料在細胞生物學行為分析試驗中的應用。
【文檔編號】C12N5/00GK104017768SQ201410280422
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月20日 優先權日:2014年6月20日
【發明者】李娟 , 郝晉, 趙志河, 王婭婷, 方善寶 申請人:四川大學