定量測定人體丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙的製作方法
2023-07-25 04:02:51
專利名稱：：定量測定人體丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙的製作方法
技術領域：
：本發明屬於體外臨床診斷試劑
技術領域：
，具體涉及一種適用於測定人體全血、血清或血漿等中的丙氨酸氨基轉移酶、門冬氨酸氨基轉移酶等生化指標的幹化學試紙。
背景技術：
：丙氨酸氨基轉移酶又稱谷丙轉氨酶，它催化L一丙氨酸和L一穀氨酸之間氨基的轉移。丙氨酸氨基轉移酶主要存在於肝細胞的胞漿中，在心肌、骨骼肌及其它組織中的含量較低。丙氨酸氨基轉移酶是肝臟的特異性酶，血清值升高表明肝細胞質膜存在滲漏並退化，其升高的程度與受累細胞的數量有關。臨床上測定丙氨酸氨基轉移酶的試劑可分為液體試劑和幹化學試紙兩類。幹化學試紙主要用於快速檢測。同液體試劑相比，幹化學試紙具有方便、靈活、汙染小、操作簡便等優點。目前，檢測丙氨酸氨基轉移酶的的幹化學試紙多為國外產品，主要有縱向和橫向兩類。第一類是以強生公司和富士公司為代表的多層膜乾片法，利用感光膠片的塗層技術將試劑層、輔助試劑層、光漫射層和分布層等試劑塗布在透明支持層上，從支持層的反面測定光密度的變化。如專利U.S.PAT.N0.5,508，173。第二類是羅氏公司的幹化學產品，U.S.PAT.NO.4,604,264將試劑塗布在多絲的纖維或織物上，全血通過玻璃纖維橫向過濾後與上試劑層接觸反應，通過上部覆蓋的一透明薄膜測定光密度的變化。上述這些產品，有的生產工藝複雜，需要專門的技術；有的可能存在某些缺陷，如加樣和測定在同一側可能會造成幹擾。而且目前應用的乾式生化分析儀為大中型設備，它將若干個生化項目集中在一臺儀器上測定。在測定單一的丙氨酸氨基轉移酶項目時，如流動採血車等場合，其功能和速度會受到限制。本發明旨在提供獨立的小型機和試紙，更適合丙氨酸氨基轉移酶的大規模快速篩査。
發明內容本發明的目的在於提供一種使用方便、快速的定量測定人體全血、血清或血漿中的丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙。本發明提供的定量測定丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙，為長條形，一端為手持區，另一端為測試區，其結構如圖1和圖2所示。它由上支持層1、下支持層2、底物層5和顯色層6組成。其中，上支持層1和下支持層2通過自帶的膠層粘合在一起。在上支持層1的測試區開有加樣孔3，下支持層2的對應位置開有測試孔4。底物層5和顯色層6迭合，位於加樣孔和測試孔處的上支持層1和下支持層2之間。本發明中，上支持層1和下支持層2可採用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纖維等。其中優選聚酯纖維。單片支持層的厚度為100-250ym，大小為6X50咖-12X80鵬。上下支持層上的加樣孔和測試孔為圓形，直徑相同，為4-8mm。加樣孔3用於滴加樣品，測試孔4用於觀察和測定反應區顏色的變化。本發明中，底物層5用來接受樣品，樣品在底物層擴散，將浸漬在底物層上的試劑溶解，樣品中的可檢測部分被轉運到顯色層的樣品面。底物層5優選反應區面積能容納大約10-30yl血液，並能將大約6-10iil樣品轉運至顯色層的材料。適合做底物層的材料包括玻璃纖維、各種濾紙或無紡布等，特別優選玻璃纖維，其結構疏鬆，血液樣品中的可檢測部分和試劑能快速滲透至顯色層，縮短了反應時間。本發明中，顯色層6為浸漬有檢測試劑和色原的各種濾紙、無紡布或合成膜等，優選聚碸、聚醚碸或尼龍等材料的合成膜，特別優選具有孔徑大小呈梯度變化的孔的合成膜，合成膜上的小孔孔徑範圍為0.2-10um。合成膜有一個用於點樣的樣品面，和一個可觀察到顏色變化的檢測面。當血液滲透到膜的大孔面上後，樣品逐漸穿過膜，流過的孔徑越來越小。最後，紅細胞等物質到達膜的某個位置就不再往下滲透。含有丙氨酸氨基轉移酶的剩餘樣品滲透到小孔面，通過一系列反應，使色原顏色發生變化，從而指示樣品中丙氨酸氨基轉移酶的濃度。本發明中，反應試劑分布於底物層和顯色層上。定量全血或血清/血漿滴加於加樣孔內，樣品均勻分布並滲入試劑層中。樣品中的丙氨酸氨基轉移酶(ALT)催化底物L一丙氨酸和a—酮戊二酸鈉，產生L一穀氨酸和丙酮酸。丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化產生過氧化氫。在過氧化物酶作用下，過氧化氫氧化無色色原生成有色產物，顏色變化與樣品中的丙氨酸氨基轉移酶活性成正比，用反射光度計可測定之。本發明中，反應試劑包括緩衝體系、底物、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、色原、激活劑、穩定劑等。緩衝體系可以是磷酸鹽緩衝液、Tris-HCL或Good's緩衝液等，濃度為0.05M一1.0M，反應最佳pH值在6.5-8.0。底物採用L—丙氨酸和a—酮戊二酸鈉，底物在丙氨酸氨基轉移酶的催化下產生L一穀氨酸和丙酮酸。L一丙氨酸的濃度為0.5M-1.5M，a—酮戊二酸鈉的濃度為5mM-50mM。生成的丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化產生過氧化氫。丙酮酸氧化酶的適宜濃度為30-100U/ml，FAD濃度為0.1mg/ml-0.2mg/ml，TPP濃度為0.4mg/ml-0.8mg/ml;丙酮酸氧化酶的激活劑採用Mg2Mg^的濃度為1.0g/L-3.0g/L;酶的穩定劑採用二糖、多糖類或蛋白類穩定劑等，如蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白等，在體系中的重量濃度為0.1-2.0%。在過氧化物酶作用下，過氧化氫氧化無色色原生成有色產物。過氧化物酶濃度為30-100U/ml。色原作為指示劑，可以是單一組分或兩種組分的色原物質，優選色原強吸收處的波長不同於樣品的強吸收處的波長，特別優選強吸收處的波長為610-650nm的色原，濃度為0.03%-0.5%。為定量測定丙氨酸氨基轉移酶活性，發明人還研製了反射式分光光度計(另案申請專利)，與本發明試紙條配套使用。6-30W血樣滴加於試紙條上，反應溫度控制在37±0.3。C，用該光度計測定試紙反應後在630士20nm波長下反射光密度的變化，測試在3.5-5分鐘內完成。自動報告和存儲實驗結果，並列印。本發明使用丙酮酸氧化酶法測定丙氨酸氨基轉移酶活性，採用底物層和顯色層迭合的結構，試劑穩定性好，顯色強度高，均勻度好，減少了加樣端測定產生的氣泡、過量液體、紅細胞等造成的幹擾，可使用全血和血清/血漿作為標本。本發明製造工藝簡單，與專門設計的小型反射式光度計配套，使用更為方便快速。圖1為本發明的幹化學試紙圖示。圖2為本發明的幹化學試紙剖面圖示。圖中標號1為上支持層，2為下支持層，3為加樣孔，4為測試孔，5為底物層，6為顯色層。圖3為實施例1的測定結果的回歸直線方程。具體實施例方式實施例l:上、下支持層採用PVC片，用打孔機打出加樣孔3和測試孔4，孔直徑為4mm，孔距為8mm。底物層5採用玻璃纖維，粘貼於上支持層。顯色層6採用尼龍膜，粘貼於下支持層。將配製好的底物溶液和顯色液用BIO-DOT噴點儀分別點樣於底物層5和顯色層6，每孔6ri。將噴點後的試紙放入30-5(TC的真空乾燥箱中，乾燥後取出。將上、下支持層對合粘帖在一起，加樣孔3與測試孔4對齊。用滾刀機將試紙切成8mm寬的試紙條即成。試劑組成如下磷酸鹽緩衝液50mML一丙氨酸500mMa—酮戊二酸鈉lOmMMgCl2*6H20:2.4g/L過氧化物酶30U/ml丙酮酸氧化酶30U/ml黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD):0.lmg/ml硫胺素焦磷酸(TPP):0.4mg/ml4-氨基安替比林1.2g/LDAOS(色原)0.85g/L(N-乙基一N—(2—羥基一3—磺酸基丙基)一3，5—二甲氨基苯胺)牛血清白蛋白0.2%將6iU7%牛血清白蛋白配製的丙氨酸氨基轉移酶校準品滴加於加樣孔，用反射式光度計進行測定，讀取2.5—4分鐘時的反射強度的變化。結果見表l:ALT濃度(U/L)反射強度變化15.662.51252000.0320.0500.0800.111以此建立直線回歸方程為Y(反射強度變化)二O.0004X(ALT濃度)+0.0245，r2=0.9987。如圖3所示。實施例2:上、下支持層採用PET片，用打孔機打出加樣孔3和測試孔4，孔直徑為4mm,孔距為8mm。底物層5採用玻璃纖維，顯色層6採用PES膜，寬度為8mm。將底物層5和顯色層6分別浸泡於底物溶液和顯色液中，完全浸溼後取出，刮平。將浸溼的試紙放入30-5(TC的真空乾燥箱中，乾燥後取出。將底物層5粘貼於上支持層，顯色層6粘貼於下支持層。將上、下支持層對合粘帖在一起，加樣孔3與測試孔4對齊。用滾刀機將試紙切成8mm寬的試紙條即成。試劑組成如下Good's緩衝液200mML一丙氨酸lOOOmMa—酮戊二酸鈉20mMMgCl2*6H20:2.0g/L過氧化物酶lOOU/ml丙酮酸氧化酶100U/ml黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD):0.2mg/ml硫胺素焦磷酸(TPP):0.8mg/mlKH2P04:20mM3',3',5'，5'-四甲聯苯胺(色原)0.1%海藻糖0.5%用高濃度的丙氨酸氨基轉移酶血清稀釋紅細胞，得到紅細胞壓積為20%、30%、40%、50%和60%的全血標本，加樣量為20nl，分別滴加於加樣孔，用反射式光度計進行測定，讀取3—4分鐘時的反射強度的變化。結果見表2:tableseeoriginaldocumentpage7結果說明紅細胞壓積在30%—50%的全血標本在測定時幾乎不受紅細胞的幹擾。權利要求1、一種定量測定丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙，其特徵在於形狀為長條形，一端為手持區，另一端為測試區，由上支持層(1)、下支持層(2)、底物層(5)和顯色層(6)組成；其中，上支持層(1)和下支持層(2)通過自帶的膠粘層粘合在一起；在上支持層(1)的測試區開有加樣孔(3)，下支持層(2)的對應位置開有測試孔(4)；底物層(5)和顯色層(6)迭合，位於加樣孔(3)和測試孔(4)處的上支持層(1)和下支持層(2)之間；底物層(5)和顯色層(6)上浸漬有反應試劑；該反應試劑包括緩衝體系、底物、丙酮酸氧化酶、過氧化物酶、色原、激活劑和穩定劑，其中，緩衝體系是磷酸鹽緩衝液、Tris-HCL或Good’s緩衝液，濃度為0.05M-1.0M，反應pH值在6.5-8.0；底物為L-丙氨酸和α-酮戊二酸鈉，L-丙氨酸的濃度為0.5M-1.5M；α-酮戊二酸鈉的濃度為5mM-50mM；丙酮酸氧化酶的濃度為30-100U/ml；過氧化物酶濃度為30-100U/ml；色原是單一組分或兩種組分的色原物質，濃度為0.03％-0.5％；丙酮酸氧化酶的輔酶採用黃素腺嘌呤二核苷酸和硫胺素焦磷酸，黃素腺嘌呤二核苷酸濃度為0.1mg/ml-0.2mg/ml，硫胺素焦磷酸濃度為0.4mg/ml-0.8mg/ml；丙酮酸氧化酶的激活劑採用Mg2+，濃度為1.0g/L-3.0g/L；酶的穩定劑為二糖、多糖類或蛋白類穩定劑，在體系中的重量濃度為0.1-2.0％。2、根據權利要求1所述的定量測定丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙，其特徵在於所述的上支持層和下支持層的材料為高分子聚合材料，單片支持層的厚度為100-250wm,大小為6X50mm-12X80mm，上支持層和下支持層的規格相同，其上的加樣孔(3)和測試孔(4)為圓形，直徑為4-8mm。3、根據權利要求1所述的定量測定丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙，其特徵在於所述的底物層(5)的材料採用玻璃纖維、各種濾紙或無紡布。4、根據權利要求1所述的定量測定丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙，其特徵在於所述的顯色層(6)的材料為各種濾紙、無紡布或合成膜。5、根據權利要求4所述的定量測定丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙，其特徵在於所述合成膜為聚碸、聚醚碸或尼龍。6、根據權利要求5所述的定量測定丙氨酸氨基轉移酶的幹化學試紙，其特徵在於所述合成膜具有孔徑大小呈梯度變化的孔，其中小孔的孔徑範圍為0.2-104m。全文摘要本發明屬於體外臨床診斷試劑領域，具體為一種定量測定人體丙氨酸氨基轉移酶活性的幹化學試紙。試紙由長條形的上、下支持層組成，在測試區從上到下依次為加樣孔、底物層、顯色層和測試孔。底物層可選用玻璃纖維、濾紙和無紡布等材料，浸漬有底物等試劑；顯色層為各種濾紙、無紡布或合成膜，浸漬有色原等試劑。樣品從加樣孔進入底物層，轉運至顯色層的樣品面，含有被檢測成分的液體滲透至顯色層的檢測面，通過化學反應引起色原顏色的改變，通過下支持層上的測試孔在顯色層的檢測面即可測定光密度的變化。該試紙用於快速測定人體全血、血清或血漿中的丙氨酸氨基轉移酶的活性，是肝功能檢測的重要指標之一。文檔編號G01N21/78GK101105491SQ200710044719公開日2008年1月16日申請日期2007年8月9日優先權日2007年8月9日發明者朱世成,縵王,漪田申請人:上海科華生物工程股份有限公司