一種毛細血管模型的構建方法及其微系統晶片的製作方法
2023-07-25 00:16:26 2
專利名稱：一種毛細血管模型的構建方法及其微系統晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種毛細血管模型的構建方法及其微系統晶片，此模型基於 微系統技術結合細胞生物學技術構建，可用於藥物篩選、組織工程、基礎細 胞生物學等方面，屬交叉學科技術領域。
背景技術：
毛細血管是血液循環中的末梢，毛細血管管壁主要由一層內皮細胞
(endothelial cell)和基膜(Basal Lamina)組成，細的毛細血管橫切面由一 個內皮細胞圍成，較粗的毛細血管由2 3個內皮細胞圍成。常規的毛細血管 模型一般利用生物可降解材料作為支架來培養血管壁的正常細胞，旋轉培養 重建和再生形成管狀模型。目前已有多種組織工程化血管構建模式正在研究 中，並取得一定進展，如採用交聯膠原蛋白包埋聚乙膠酯材料(PGA)為血 管支架，分層種植人骨髓間充質幹細胞來源的血管平滑肌、內皮樣細胞，並 旋轉培養，體外構建組織工程化小口徑人工血管模型，應用於臨床的血管替 代物，以期解決臨床上治療血管狹窄或閉塞導致的缺血性疾病自體血管移植 及血管來源有限的問題。
近幾年，微系統技術的發展給基於細胞培養及組織工程的研究注入活力， 基於微系統技術的細胞構圖(Cell Patterning)不僅可以根據不同要求控制細 胞的空間分布，還可以更好的模擬細胞生長的外環境(ExtracellularMatrix), 增加細胞研究的可靠性，可以集成加熱器、微環境參數測定傳感器等用於細 胞或組織功能的研究，這些在常規的細胞組織培養條件下是難以實現的。
目前，微系統技術應用於細胞水平、分子生物學水平的研究也已有很多 的報導，但是主要還是針對單個細胞或多個細胞的培養和相關性質研究。實 際上，微系統技術不僅可以對細胞進行操控，也可以根據組織結構的特點構 建特殊的物理微結構，將組織細胞按照要求導入微結構，並在片培養，形成
3具有一定組織功能的模型。目前，與內皮細胞相關的微系統技術已有少量報
道，如Fidkowshi C.等在文獻(Fidkowski C., Kaazempur畫Mofrad M.R., Borenstein J., Vacanti J.R, Langer R.， Endothelialized Microvasculature Based on a Biodegradeble Elastomer, Tissue Engineering, 2005, 11, 302~311)中利用生物 可降解材料通過微加工技術製作微管道網絡，成功實現了內皮細胞在微系統 中的培養；Song J.W.等在文獻(Song J.W.， Gu W., Futai N.， Warner K.A.， Nor J.E.， Talayama S., Computer-Controlled Microcirculatory Support System for Endothelial Cell culture and Shearing, Anal. Chem., 2005, 77, 3993~3999)中也 成功地實現了內皮細胞在微系統中的培養，並且觀察微系統中液體流動對細 胞生長狀態的影響。但是，目前的研究只是局限在細胞層面，在實現內皮細 胞培養的基礎上沒有建立類似毛細血管組織的結構，進行更深層次的組織工 程學方面的研究。
本發明擬基於微系統加工技術，針對簡單組織毛細血管，設計製作用於 內皮細胞有序排布和培養的微晶片系統，形成具有簡單生理功能的毛細血管 模型，並且建立毛細血管功能研究和檢測方法。
發明內容
本發明目的是利用微系統加工技術，設計製作用於毛細血管內皮細胞有 序排布和培養的微晶片系統，構建成具有一定正常生理功能的毛細血管模型。
本發明的目的是通過微系統晶片設計和製造、毛細血管內皮細胞的導入、 排布、固定和培養、毛細血管模型功能的測定三個主要步驟實現的。
本發明的目的是通過如下技術方案實現的
1) 根據毛細血管的組織結構結合微系統技術的特點，設計細胞培養晶片， 利用微細加工技術製作細胞培養的微系統，該系統包括下列核心單元細胞 培養微通道，給藥通道，給養分通道，出入口， NO測定電極等。根據細胞 培養要求，調節微系統中的微環境，包括流速控制、壓力控制、體積控制、 溫度控制、溶液混和、液體分配與驅動等。
2) 採用微量注射泵將培養液、內皮細胞及其它成分導入微系統中，利用 設計的物理微結構及表面特性將細胞分布在特定的區域，利用細胞培養箱的 條件進行細胞在片培養。3)在微晶片管道中設計製作NO微電極，對內皮細胞分泌的擴血管因子
NO的濃度進行實時監測；在導入使血管舒張/收縮的藥物成分的作用下，檢 測內皮細胞的形態變化，細胞之間的間距變化，選用特定的指示劑，測定藥 物作用前後指示劑在管內和管外的濃度改變，判定血管壁通透性的變化。
本發明構建的毛細血管模型可以用於毛細血管內皮細胞的培養和觀測， 能對內皮細胞分泌的擴血管因子NO的濃度進行實時測定，管壁的通透性可 隨著外加剌激的不同發生改變，大致模擬正常生理條件下毛細血管功能，該 模型可用於心血管藥物有效成分的篩選。
本發明不僅闡述了一種基於微系統技術的毛細血管模型的構建方法，還 提供一種細胞培養微系統晶片的製作方法，該微系統晶片適合於細胞的導入、 排布、固定和在片培養。
圖i為本發明實施例的毛細血管模型總體結構示意圖，其中，i和r分
別為毛細血管內皮細胞及培養基的進口和出口； 2和2'分別為毛細血管內基 質的進口和出口； 3和3'分別為毛細血管外基質的進口和出口。
圖2為本發明實施例的細胞培養晶片A-A'截面圖，其中，4為聚合物 PDMS晶片；5為載波片；6為培養中的毛細血管內皮細胞。
圖3為本發明實施例毛細血管模型晶片的俯視圖，其中，7為NO測定 電極；8為毛細血管外基質；9為單層排列毛細血管內皮細胞；10為毛細血 管內基質。
具體實施例方式
下面結合附圖進一步說明本發明的一種具體實施過程。 在下述實施例中，使用的細胞外基質、細胞內基質指的分別是兩排細胞 外側和內側的溶液環境。
如圖2所示，本方面提供的細胞培養微晶片，由聚二甲基矽氧烷(PDMS) 晶片和載玻片通過鍵合形成，該PDMS晶片包括PDMS基底以及位於其上的 2對(4個)微壩結構，2對微壩結構間距為100-120um，每對微壩結構包括2個間距為的30-40um的微壩，該微壩與載玻片間間隙高度為3-5um，從而， 微壩結構內的空間可用於細胞，如內皮細胞的固定培養，以形成2排(每個 微壩結構內可形成l排)單層細胞結構，而培養基及藥物可以自由通過。
由於PDMS晶片和載玻片進行了鍵合，因此，如圖1所示，PDMS晶片 上的微壩結構將所述細胞培養微晶片隔成5個通過微壩與載玻片間間隙相通 的微管道，分別是2對微壩結構之間的細胞內基質微管道(即毛細血管內基 質進口 2和出口 2'間的管道，寬度為100-120um，可用於加入細胞內基質、 藥物和/或檢測標記物)，微壩結構內的內皮細胞培養微管道各1條(即毛細 血管內皮細胞及培養基進口 l和出口 l，間的管道，寬度為30-40um，可用於 加入培養基和/或藥物)，以及位於2條內皮細胞培養微管道各自外側的細胞 外基質微管道各1條(即毛細血管外基質進口 3和出口 3'間的管道，寬度為 200-500um，可用於加入細胞外基質、藥物和/或檢測標記物)。
如圖3所示，該晶片還可以包括用於測定毛細血管內溶液和/或毛細血管 外溶液的物質濃度的檢測電極，如NO電極7等。
微晶片選用具有良好透氣性和生物相容性的聚二甲基矽氧垸(PDMS) 材料與常規載波片鍵合形成細胞培養微通道網絡結構。微通道和壩型微結構 採用聚合物微加工工藝(Poly-MEMS)製作，製作過程包括SU-8模具製造， PDMS塑性成型及與載玻片鍵合三個關鍵步驟，製造過程簡單闡述如下在 矽片正面甩塗一層SU-8 2050光刻膠，前烘固化；將第一塊掩膜板與基片對 準，紫外線曝光，微管道圖形轉移到第一層SU-8光刻膠上；後烘後，在第 一層SU-8表面再甩塗一層SU-8 2005光刻膠，前烘固化；將第二塊掩膜板與 基片對準，紫外線曝光，將掩膜板上的壩型微結構轉移到第二層SU-8光刻 膠上；第二層SU-8光刻膠後烘；用SU-8顯影液對兩層SU-8結構同時顯影， 異丙醇衝洗，去離子水衝洗，氮氣吹乾；得到多層SU-8模具。將PDMS前 聚體和固化劑混合物倒入SU-8模具中，放入65。C烘箱中，烘焙l小時；將 固化後的PDMS晶片4從模具上揭下來，打孔後備用。
電極7採用lift-off技術製作在載玻片5上。製作過程簡單闡述如下首 先，將載玻片清洗烘乾；甩塗正性光刻膠AZ4620,烘乾，曝光，顯影；電 子束蒸發金屬層Pt;最後在丙酮中剝離多餘金屬形成電極7的圖形。在載玻 片5上製備電極7後將其烘乾備用。最後，將製備好的PDMS和載玻片5鍵合形成完整的細胞培養晶片。 在內皮細胞導入之前將製作好的細胞培養微晶片用75%的酒精浸潤，然 後放入常規細胞培養皿(polystyrene Petri dish)中，用紫外線照射lh，進行 消毒。為利於細胞在微通道內貼壁生長，在微通道內導入含血清的培養液浸 潤過夜，使晶片表面包被蛋白。
細胞培養液為DMEM (Gibco)，加入10%的胎牛血清(杭州四季青生物 工程材料有限公司)和100ul/ml的鏈青黴素(吉諾生物醫藥技術有限公司， 杭州)，消化液為0.25%的胰酶和0.02%的EDTA (吉諾生物醫藥技術有限公 司，杭州)。
由微量注射泵將培養基和內皮細胞導入微晶片，在C02培養箱中進行培 養，每隔48小時更新一次培養液。待晶片內的內皮細胞6分裂、增值、遷移 形成緊密的雙排單層細胞結構9，如圖3所示，建立起類似毛細血管結構的 模型，進行毛細血管功能學方面的研究。
圖1中的1 口為剌激藥物的導入口，可分別選用止血類藥物，如安絡血、 維生素K等，能降低毛細血管的通透性，促使毛細血管收縮，或者選用胰激 肽原酶等可以引起毛細血管擴張的藥物導入微系統中，觀察毛細血管模型的 反應。在圖1中2 口處加入螢光標記的殼聚糖大分子物質，通過每隔半小時 在螢光顯微鏡中觀察圖3中8和IO兩處的螢光強度比值分析毛細血管模型的 通透性，也可在圖1中1 口導入異硫氰酸螢光黃標記的鬼筆環肽孵育，觀察 內皮細胞骨架的變化，驗證毛細血管模型的功能。同時可利用圖3中NO電 極7所示的測定電極測試在刺激情況下內皮細胞代謝的NO濃度變化。
本發明提供的微晶片可用於構建毛細血管模型，以進行觀測，該模型可 以大致模擬正常生理條件下的毛細血管功能，並用於心血管藥物有效成分的 篩選。
雖然本發明只提供了圖2所示的具有2對微壩結構的晶片，但對於本領 域的技術人員而言，根據本發明提供的教導和暗示，根據實際需要，可製造 具有l對或更多對微壩結構的晶片，是顯而易見的，因此，也是本發明所需 要保護的內容。所述晶片可用於細胞培養，以形成1排或多排緊密單層細胞 結構，構建所需要的模型，然後利用藥物進行刺激，以檢測所述細胞結構2 側溶液或進行其他的研究。
權利要求
1、一種細胞培養微晶片，其特徵在於，所述晶片由聚二甲基矽氧烷(PDMS)晶片和載玻片鍵合形成，所述PDMS晶片包括PDMS基底以及位於其上的1對或多對微壩結構，所述微壩結構包括2個間距為的30-40um um微壩，所述微壩與載玻片間間隙高度為3-5um。
2、 如權利要求1所述的晶片，其特徵在於，所述晶片包括2對間距為 100-120um的微壩結構。
3、 如權利要求2所述的晶片，其特徵在於，所述微壩結構將所述細胞培 養微晶片隔成5個通過微壩與載玻片間間隙相通的微管道，所述微管道分別 為2對微壩結構之間的細胞內基質微管道，微壩結構內的內皮細胞培養微管 道各1條，以及位於2條內皮細胞培養微管道各自外側的細胞外基質微管道 各1條。
4、 如權利要求3所述的晶片，其特徵在於，所述晶片還包括用於測定細 胞內基質溶液和/或細胞外基質溶液的物質濃度的檢測電極。
5、 如權利要求4所述的晶片，其特徵在於，所述檢測電極為NO檢測電 極。
6、 如權利要求1一5中任一項所述的細胞培養微晶片的製備方法，其特 徵在於，所述方法包括SU-8模型製備、PDMS塑性成型以及PDMS晶片與 載玻片鍵合的步驟。
7、 如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟 在矽片正面甩塗一層SU-8 2050光刻膠，前烘固化；將第一塊掩膜板與基片對準，紫外線曝光，微管道圖形轉移到第一層SU-8光刻膠上；後烘後， 在第一層SU-8表面再甩塗一層SU-8 2005光刻膠，前烘固化；將第二塊掩膜 板與基片對準，紫外線曝光，將掩膜板上的壩型微結構轉移到第二層SU-8 光刻膠上；第二層SU-8光刻膠後烘；用SU-8顯影液對兩層SU-8結構同時 顯影，異丙醇衝洗，去離子水衝洗，氮氣吹乾；得到多層SU-8模具。將PDMS 前聚體和固化劑混合物倒入SU-8模具中，放入65t:烘箱中，烘焙l小時； 將固化後的PDMS晶片從模具上揭下來，打孔後和載玻片鍵合形成細胞培養心片o
8、 如權利要求l一5中任一項所述的晶片用於細胞培養形成1排或多排 緊密單層細胞結構後進行刺激，並檢測所述細胞結構2側溶液的應用。
全文摘要
本發明闡述了一種毛細血管模型的構建方法及其微系統晶片，利用微系統加工技術，設計製作用於毛細血管內皮細胞有序排布和培養的微晶片系統。通過微系統晶片設計和製造、毛細血管內皮細胞的導入、排布、固定和培養、毛細血管模型功能的測定三個主要步驟，構建成具有一定正常生理功能的毛細血管模型。該毛細血管模型可以用於毛細血管內皮細胞的培養和觀測，能對內皮細胞分泌的擴血管因子NO的濃度進行實時測定，管壁的通透性可隨著外加刺激的不同發生改變，大致模擬正常生理條件下毛細血管功能，可用於心血管藥物有效成分的篩選。
文檔編號C12M3/00GK101451105SQ200810208130
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月26日 優先權日2008年12月26日
發明者吳建璋, 趙建龍, 邵建波, 鄭允煥, 金慶輝 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所