短串聯重複基因座的多重擴增的製作方法

2023-07-25 01:24:31

專利名稱：短串聯重複基因座的多重擴增的製作方法
相關申請的交叉參考本申請是1994年9月30日申請的美國專利申請08/316,544的部分繼續申請。該母申請的全文引入本文作參考。關於聯邦政府贊助的開發研究的聲明無。發明背景本發明一般地涉及對基因組系統中的遺傳標記的檢測，更具體地，本發明涉及用聚合酶鏈反應或其它擴增系統對多個獨立的多態遺傳基因座的同時擴增以在一個反應中確定在多重系統中所含的每個基因座的等位基因。
近年來，作為遺傳標記的多態短串聯重複序列(STR)的發現和開發刺激了下列方面的進展，即連鎖圖譜的開發、疾病基因的鑑別和鑑定以及DNA分型的簡化和精確。
至少在人類基因組中的許多基因座含有多態STR區(Adamson,D.等，(1995)「從人類基因組中收集的有序四核苷酸重複標記」，美國人類遺傳學雜誌57:619-628；Murray,J.C.等，(1994)「具有分摩密度的複雜人類連鎖圖譜」，科學285:2049-2054；Hudson,TJ.,Engelstein,M.,Lee,M.K.,Ho,E.C.,Rubenfield,M.J.,Adams,C.P.,Housman,D.E.,Dracopoli,N.C.(1992)，「100個高信息含量的人類簡單序列重複多態性的分離和染色體定位」，(Genomics 13:622-629)。STR基因座由長度為3-7個鹼基對的短的重複序列元件組成。預計在人類基因組中有2000000個三聚和四聚的STR存在，每15kb就會出現1個(Edwards等(1991)，「用三聚和四聚的串聯重複序列進行DNA分型和遺傳作圖」，美國人類遺傳學49:746-756；Beckman,J.S.,Weber,J.L.(1992)，「人和大鼠微衛星的調查」，基因組12:627-631)。由Edwards等(1991)研究的STR基因座有近一半是多態的，它們提供了遺傳標記的豐富來源。
在一特定基因座的短串聯重複單元的數目變化導致在該基因座的DNA的長度在各等位基因之間及在個體之間有變化，這種長度多態性與可變數目串聯重複(VNTR)基因座(Nakamura,Y.等(1987)，「用於人類基因作圖的可變數目串聯重複(VNTR)標記」，科學235:1616-1622)和小衛星基因座(Jeffieys,A.J.等，(1985)「人DNA中的高度可變「小衛星區」區」，自然314:67-73)有關，這兩種基因座均含有比STR基因座長得多的重複單元。這種長度多態性也與微衛星基因座的二核苷酸重複形式類似(Litt,M.,Luty,J.A.(1989)，「通過體外擴增心肌激動素基因內的二核苷酸重複揭示的高度可變的微衛星體」，美國人類遺傳學44:397-401,Tautz,D.等(1986),「DNA的密碼簡易性是遺傳變異的主要來源」，自然322:652-656,Weber,J.L.,May,P.E.(1989)，「可用聚合酶鏈反應分型的一大類人DNA多態性」，美國人類遺傳學44:388-396；Beckman and Weber(1992))，該形式的微衛星基因應具有比STR基因座短的重複單元。
多態STR基因座是用於人類鑑別，父系測試和遺傳作圖特別有用的標記。通過採用在串聯重複序列側翼區鑑別的特異引物序列進行聚合酶鏈反應(PCR)可以擴增STR基因座。
這些基因座的等位基因是由在擴增區域內所含的重複序列的拷貝數而區分，並在電泳分離後由任何合適的檢測方法如放射性、螢光、銀染或顏色而彼此區分。
為使勞動力、材料和分析時間最小化，希望的是同時分析多個基因座和/或較多的樣品，達到這一目的的一個途徑是在一個單一反應中同時擴增多個基因座。文獻中已廣泛描述了這種「多重」擴增。多重擴增系列已被廣泛開發用於分析與人類遺傳疾病有關的基因，所述疾病如Duchenne肌營養不良症(Chamberlain,J.S.等(1989)，「通過多重DNA擴增對Duchenne肌營養不良症基因座進行缺失掃描」，核酸研究16:11141-11156；Chamberlain,J.S.等(1989)，「用於診斷Duchenne肌營養不良症的多重PCR」,PCR方案，方法和應用指南(編輯Gelfand,D.H.等)第272-281頁，學術出版社，San Diego,CA；Beggs,A.H.等(1990)「由PCR檢測98％DMD/BMD基因缺失」，人類遺傳學86:45-48；Clemens,P.R.等(1991)，「用二核苷酸重複多態性對Duchenne和Becker肌營養不良症家族進行攜帶者檢測和產前診斷」，美國人類遺傳學雜誌49:951-960；Schwartz,J.S.等(1992),「Duchenne/Becker’s肌營養不良症的螢光多重連鎖分析和攜帶者檢測」，美國人類遺傳學雜誌51:721-729；Covone,A.E.等(1992)，「通過三重PCR篩選Duchenne和Becker肌營養不良症患者以檢測營養不良蛋白基因的30個外顯子中的缺失」，美國人類遺傳學雜誌51:675-677),Lesch-Nyhan症候群(Gibbs,R.A.等(1990),「Lesch-Nyhan家族的次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶基因的多重DNA缺失檢測和外顯子測序」，基因組7:235-244)，囊性纖維化(Estivill,X.等(1991)，「由突變和微衛星體等位基因的多重PCR產前診斷囊性纖維化」，柳葉刀338:458；Fortina,P.等(1992)「由多重聚合酶鏈反應對囊性纖維化跨膜傳導調節物基因中的最常見突變進行非放射性檢測」，人類遺傳學90:375-378；Ferrie,R.M.等(1992)，「用於檢測CFTR基因中的常見突變的ARMS試驗的開發、多重化及應用」，美國人類遺傳學雜誌51:251-262；Morral,N.和Estivill,X.(1992),「CFTR基因內的三個微衛星體的多重PCR擴增」，基因組51:1362-1364)，以及成視網膜細胞瘤(Lohmann,D等(1992)，「由多重PCR和高分辨凝膠電泳檢測成視網膜細胞瘤中的小RBl基因缺失」，人類遺傳學89:49-53)。多態微衛星體標記的多重擴增(Clemens等(1991):Schwartz等(1992)；Huang,T.H.-M.等(1992)，「用多重聚合酶鏈反應對X染色體上的4個二核苷酸重複基因座DXS435,DXS45,DXS454,DXS424進行遺傳作圖」，基因組13:375-385)，甚至是ST12標記的多重擴增(Edwards,A等(1992)，「4個人群組中的5個三聚和四聚串聯重複基因座的遺傳變異」，基因組12:241-253；Kimpton,C.P.等(1993)，「採用短串聯重複基因座的多重擴增的自動DNA歸類」，PCR方法和應用3:13-22；Hammond,H.A.等(1994)，「13個STR基因應用於個人識別應用的評價」，美國人類遺傳學雜誌55:175-189；Schumm,J.W.等(1994)，「用於分析多態STR基因座的非同位素多重擴增反應的開發」，第四屆人類鑑定國際研討會1993，第177-187頁；Oldroyd,N.J.等(1995)，「適用於人類個體鑑定的高分辨性十重短串聯重複聚合酶鏈反應系統」，電泳16:334-337)已有描述。
這些擴增產物通常由本領域技術人員公知的幾種電泳方法中的一種而分離，幾種熟知的檢測擴增產物的方法也已有描述。儘管在某些情況下採用擴增片段的溴乙錠染色或銀染，但在其它情況下優選使用僅標記擴增材料的兩條鏈中的一條鏈的方法，後者的例子包括在擴增基因座之前放射標記或螢光標記兩個引物中的一個。一種更複雜的檢測方法是利用不同的螢光標記以檢測代表不同基因座但在電泳後位於同一空間的擴增材料。使用濾膜或其它區分性檢測劑區分不同基因座的產物，使得在一個時間顯示一種螢光標記。
請參照國際公開WO93/18177和WO93/18178(Fortina等)，其涉及使用等位基因特異性多重聚合酶鏈反應系統分別診斷如囊性纖維化和β一地中海貧血等疾病的方法和試劑盒，根據Fortina等，多重PCR也已被用於同時擴增多個靶序列，用瓊脂糖凝膠的兩條泳道進行突變等位基因掃描。
Ballabio,A.等(1991)，「囊性纖維化缺失的PCR測試」，自然343:220，公開了使用兩個不同染料標記的螢光引物檢測F508囊性纖維化突變的單管多重等位基因特異性PCR測試。
儘管對於特異的基因座有多重擴增程序，但是仍需要用於檢測其它類型的基因座如特異STR基因座的等位基因的多重擴增程序。還需要鑑別能多重擴增這種基因座的引物。發明簡述因此，本發明的一個目的在於提供使用PCR或其它擴增系統同時擴增多個獨立的多態短串聯重複(STR)基因座的方法和材料，以在一個反應中確定在多重系統中所含的每個基因座的等位基因。本文所公開的特異STR基因座的多重分析在現有技術中未見描述。本文下述公開的許多引物的序列也未見描述，所有這些引物對於這種STR基因座的多重擴增均是有用的。
本發明的另一個目的在於提供特異於包含特異基因座的多重擴增的方法、試劑盒和引物。
這些和其它目的通過本發明而實現，本發明涉及用於同時分析或確定存在於每個多重系統中的每個基因座的等位基因的方法和材料。一般來說，本發明的方法包括下述步驟(a)獲得至少一個待分析的DNA樣品，其中該DNA樣品具有至少兩個可一起擴增的基因座；(b)擴增DNA樣品中的STR序列；和(c)以揭示所採用的系統的多態性的方式檢測擴增出的材料。
更具體地，本發明的方法是一種用於同時確定存在於來自或多個DNA樣品的至少3個串聯重複基因座中的等位基因的方法，所述方法包括下述步驟(a)獲得至少一個待分析的DNA樣品，其中該DNA樣品具有可一起擴增的一套至少3個基因座，其中該套基因座選自特異一組或本文公開的基因座套；(b)在一多重擴增反應中共擴增該套基因座，其中反應產物是來自該套共擴增的基因座中的每一個基因座的擴增的等位基因的混合物；以及(c)評價混合物中的擴增的等位基因以確定在DNA樣品內該套被分析的每一個基因座上存在的等位基因。
在本發明的一個實施方案中，3個STR基因座被一起擴增，並且該套3個共擴增的基因座選自如下一組D3S1539,D19S253,D13S317；D10S1239,D9S930,D20S481；D10S1239,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368；D16S539,D7S820,D13S317；和D10S1239,D9S930,D13S317。
在本發明方法的一個更優選的方案中，DNA樣品具有至少4個可一起擴增的STR基因座，並且該套共擴增的基因座選自如下一組基因座D3S1539,D4S2368,D5S818,D7S820,D9S930,D10S1239,D13S317,D14S118,D14S548,D14S562,D16S490,D16S539,D16S753,D17S1298,D17S1299,D19S253,D20S481,D22S683,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMFESFPS,HUMF13A01,HUMBFXIII,HUMLIPOL,HUMvWFA31。
可一起擴增的該套至少4個STR基因座更優選地是選自如下一組4個基因座套的一套基因座D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818；D20S481,D7S820,D13S317,D5S818；D9S930,D7S820,D13S317,D5S818；D10S1239,D7S820,D13S317,D5S818；D14S118,D7S820D13S317,D5S818；
D14S562,D7S820,D13S317,D5S818；D14S548,D7S820,D13S317,D5S818；D16S490,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818；D22S683,D7S820,D13S317,D5S818；D16S753,D7S820,D13S317,D5S818；D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481；D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481；和D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31。
更優選地，一起擴增的該套STR基因座是一套6個基因座，選自如下基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS。
還更優選地，一起擴增的該套STR基因座是一套7個基因座，選自如下基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII。
還更優選地，一起擴增的該套STR基因座是一套8個基因座，選自如下基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII,HUMLIPOL。
本發明方法的多重擴增反應步驟優選地用位於在反應中共擴增的該套基因座的每個基因座兩側的引物對進行。更優選地，多重擴增反應所用的引物對的選擇是能從每個基因座產生當用凝膠電泳分離時不與共擴增的其它基因座的等位基因重疊的等位基因。更優選地，多重擴增反應中所用的每個引物對中的一個引物的序列選自如下引物序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，當該套基因座中的一個基因座是D7S820時；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，當該套基因座中的一個基因座是D13S317時；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，當該套基因座中的一個基因座是D5S818時；SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:49，當該套基因座中的一個基因座是D3S1539時；SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10，當該套基因座中的一個基因座是D17S1298時；SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53，當該套基因座中的一個基因座是D20S481時；SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:61，當該套基因座中的一個基因座是D9S930時；SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:54，當該套基因座中的一個基因座是D10S1239時；SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18，當該套基因座中的一個基因座是D14S118時；SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20，當該套基因座中的一個基因座是D14S562時；SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22，當該套基因座中的一個基因座是D14S548時；
SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24，當該套基因座中的一個基因座是D16S490時；SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:26，當該套基因座中的一個基因座是D16S753時；SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28，當該套基因座中的一個基因座是D17S1299時；SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:58，當該套基因座中的一個基因座是D16S539時；SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32，當該套基因座中的一個基因座是D22S683時；SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34，當該套基因座中的一個基因座是HUMCSF1PO時；SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36，當該套基因座中的一個基因座是HUMTPOX時；SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38，當該套基因座中的一個基因座是HUMTH01時；SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60，當該套基因座中的一個基因座是HUMvWFA31時；SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42，當該套基因座中的一個基因座是HUMF13A01時；SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44，當該套基因座中的一個基因座是HUMFESFPS時；SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46，當該套基因座中的一個基因座是HUMBFXIII時；SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48，當該套基因座中的一個基因座是HUMLIPOL時；SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51，當該套基因座中的一個基因座是D19S253時；和SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57，當該套基因座中的一個基因座是D4S2368時。
在本發明方法中，擴增的等位基因優選地通過將其與分子量大小標準相比較而評價，其中分子量大小標準選自DNA標記物和基因座特異性等位基因梯。等位基因的評價優選地用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離等位基因，由此形成分離的等位基因的聚丙烯醯胺凝膠而進行。聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因優選地通過用合適的技術如銀染，更優選地用螢光分析而顯色等位基因來確定。
螢光分析優選地通過在用於反應中之前用螢光標記物標記多重擴增反應中所用的每個引物對中的一個引物來進行。用於標記每個這種引物的螢光標記物優選地是螢光素標記物或四甲基羅丹明標記物。最優選地，使用至少兩種不同的標記物標記用於多重擴增反應中的不同的引物。
使用本發明方法的待分析的至少一個DNA樣品優選地從人組織中分離，優選下述組織血液、精液、陰道細胞、頭髮、唾液、尿液、骨骼、口腔樣品、含有胎盤細胞或胚胎細胞的羊膜液，以及上述組織的混合物。
在另一個實施方案中，本發明是用於同時分析至少3個基因座中的STR序列的試劑盒，該試劑盒包括一個容器，容器中具有用於擴增一套至少3個短串聯重複基因座的寡核苷酸引物對，其中該套基因座選自如下D3S1539,D19S253,D13S317；D10S1239,D9S930,D20S481；D10S1239,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368；D16S539,D7S820,D13S317；D10S1239,D9S930,D13S317；
D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818；D20S481,D7S820,D13S317,D5S818；D9S930,D7S820,D13S317,D5S818；D10S1239,D7S820,D13S317,D5S818；D14S118,D7S820,D13S317,D5S818；D14S562,D7S820,D13S317,D5S818；D14S548,D7S820,D13S317,D5S818；D16S490,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818；D22S683,D7S820,D13S317,D5S818；D16S753,D7S820,D13S317,D5S818；D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481；D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481；D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII,HUMLIPOL,
試劑盒中包括的每個引物對中的至少一個引物優選地具有選自上述描述本發明方法時所列的一組序列中的一個序列。
在第三個實施方案中，本發明是用於擴增人類DNA的特異STR基因座的引物序列和引物對。本文以下描述了使用本發明的引物和引物對對人類DNA進行多重分析。本發明的引物適合用於本發明的方法中，其中根據在方法的評價步驟中確定擴增的等位基因的方式，它們可以以標記的或未標記的形式使用。
在上述簡要描述的各種實施方案中，本發明提供了使用特定組合的基因座和特定條件檢測和分析多態性遺傳標記的高效方法和材料。通過選擇用於評價步驟的合適的檢測技術，本發明的材料和方法可以在僅具有電力供應和聚丙烯醯胺凝膠電泳標準裝置的實驗室中應用，也可在具有最新的用於螢光凝膠掃描設備的實驗室中應用，這些最新設備例如FluorImagerTM575(MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)或日立FMBIOTM(San Bruno,CA)螢光掃描儀或ABI373和ABI PrismTM377 DNA測序儀(Applied BiosystemsDivision,Perkin Elmer,Foster City,CA)。因此，本發明的方法適應於各種用途和實驗室。
本發明描述的途徑在分析多重體系中所含的基因座時節省時間、勞力和材料。本發明的方法使得能用一個單一擴增反應在一個試管中一起擴增3個或更多，甚至8個或更多個基因座，而不必在不同的試管中單獨擴增每個基因座。
本發明在法醫學分析、親子鑑定、骨髓移植監視、連鎖作圖及檢測遺傳疾病和癌症等領域有特殊用途。通過能同時擴增和分析3個或更多個基因座，本發明的材料和方法明顯提高了將從兩個不同個體的血液或其它組織分離的DNA進行匹配的肯定性。在法醫學應用中急需精確區分不同個體的少量組織，在該應用中許多有罪宣判(或無罪宣判)取決於DNA分型分析，包括STR基因座分析。
科學家，特別是法醫學科學家很久以來就意識到需要分析DNA的多個多態性基因座以保證兩個組織樣品之間的匹配是統計學明顯的(Presley,L.A.等(1993)，「由FBI實驗室進行的聚合酶鏈反應(PCR)，HLA DQα分型」，第三屆人類鑑定國際研討會1992，第245-269頁；Bever,R.A.等(1992)，「由Hae Ⅲ RFLP分析鑑定5個VNTR基因座，用於親子鑑定測試」，第二屆人類鑑定國際研討會1991，第103-128頁)。然而，直至本發明完成之前，僅有少數方法能用於在一個單一反應中同時分析3個或更多個STR基因座。為理解這種多重能力的重要性，有必要了解一些DNA分型分析的數學。
舉例來說，假定每個STR的基因型(即兩個等位基因模式)機率為十分之一，也就是說，假定兩個隨機選擇的個體具有單一STR的匹配類型的機率是1/10。然而如果分析兩個不同STR基因座，則兩個系統隨機匹配的機率為1/100。如果分析3個STR基因座，則3個系統中每一個的隨機匹配的機率變為1/1000，以此類推。結果是，很容易看到增加所分析的STR基因座數目至超過三個基因座以上能明顯降低一般人群中隨機匹配的可能性，從而通過將犯罪嫌疑人的類型與犯罪現場證據相比較就可增加精確鑑別(或排除)該人的機率。使用類似的推導可以得出如下結論，本發明的方法也可增加精確鑑定親子案件中受懷疑的父親，骨髓組織的正確匹配，來自連鎖作圖研究的顯著結果，以及檢測遺傳疾病和癌症的可能性。
本發明的其它目的、特徵和優點將根據以下的詳細描述和附圖而變得清楚。
附圖簡述

圖1是一雷射列印的圖象，顯示了實施例1中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D3S1539,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖2是一雷射列印的圖象，顯示了實施例2中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynarics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖3是一雷射列印的圖象，顯示了實施例3中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynarics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖4是一雷射列印的圖象，顯示了實施例4中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynarics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖5是一雷射列印的圖象，顯示了實施例5中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynarics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖6是一雷射列印的圖象，顯示了實施例6中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dyramics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D9S930,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖7是一雷射列印的圖象，顯示了實施例7中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖8是一雷射列印的圖象，顯示了實施例8中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynanics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖9是一雷射列印的圖象，顯示了實施例9中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D14S118,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖10是一雷射列印的圖象，顯示了實施例10中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D14S562,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖11是一雷射列印的圖象，顯示了實施例11中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D14S548,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖12是一雷射列印的圖象，顯示了實施例12中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynarics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D16S490,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖13是一雷射列印的圖象，顯示了實施例13中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D16S753,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖14是一雷射列印的圖象，顯示了實施例14中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynarics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D17S1299,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖15是一雷射列印的圖象，顯示了實施例15中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖16是一雷射列印的圖象，顯示了實施例16中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D22S683,D7S820,D13S317和D5S818的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖17是一雷射列印的圖象，顯示了實施例17中用FMBIOTM螢光掃描儀TM(Hitachi Software Engineering,San Bruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO」)和HUMTPOX(「TPOX」)的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖18是一雷射列印的圖象，顯示了實施例18中用FMBIOTM螢光掃描儀TM(Hitachi Software Engineering,San Bruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820，D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO,」),HUMTPOX(「TPOX」)和HUMTH01(「TH01」)的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖19是一雷射列印的圖象，顯示了實施例19中用FMBIOTM螢光掃描儀TM(Hitachi Software Engineering,San Bruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO」),HUMTPOX(「TPOX」),HUMTH01(「TH01」)和HUMvWFA31(「vWA」)的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖20是一雷射列印的圖象，顯示了實施例20中用FMBIOTM螢光掃描儀TM(Hitachi Software Engineering,San Bruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01(「F13A01」)和HUMFESFPS(「FESFPS」)的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖21是一雷射列印的圖象，顯示了實施例21中用FMBIOTM螢光掃描儀TM(Hitachi Software Engineering,San Bruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01(「F13A01」),HUMFESFPS(「FESFPS」)和HUMBFXIII(「F13B」)的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖22是一雷射列印的圖象,顯示了實施例22中用FMBIOTM螢光掃描儀TM(Hitachi Software Engineering,San Bruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01(「F13A01」),HUMFESFPS(「FESFPS」),HUMBFXIII(「F13B」)和HUMLIPOL(「LPL」)的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖23是一雷射列印的圖象，顯示了實施例23中用FMBIOTM螢光掃描儀TM(Hitachi Software Engineering,San Bruno,CA)檢測的基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO」),HUMTPOX(「TPOX」),HUMTH01(「TH01」)和HUMvWFA31(「vWA」)的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖24是一雷射列印的圖象，顯示了實施例24中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖25是一雷射列印的圖象，顯示了實施例25中用FluoImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測的基因座D10S1239,D9S930,D4S2368和D20S481的同時擴增產物的螢光檢測圖。
圖26是一幅顯示了實施例26中3個基因座D16S539,D7S820和D13S317的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖27是一幅顯示了實施例27中4個基因座D16S539,D7S820,D13S317和HUMvWFA31(「vWA」)的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖28是一幅顯示了實施例28中3個基因座D10S1239,D9S930和D13S317的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖29是一幅顯示了實施例29中3個基因座D10S1239,D9S930和D4S2368的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖30是一幅顯示了實施例30中4個基因座D10S1239,D9S930和D4S2368和D20S481的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖31是一幅顯示了實施例31中3個基因座D3S1539,D19S253和D13S317的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖32是一幅顯示了實施例32中4個基因座D3S1539,D19S253,D4S2368和D20S481的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖33是一幅顯示了實施例33中4個基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖34是一幅顯示了實施例34中3個基因座D10S1239,D9S930和D20S481的同時擴增產物的銀染檢測照片。
圖35是一幅顯示了實施例35中3個基因座D10S1239,D4S2368和D20S481的同時擴增產物的銀染檢測照片。發明的詳細描述A．定義以下定義有助於清楚地理解下述術語的範圍和細節等位基因梯由從基因座擴增的等位基因組成的標準分子量大小標記。
等位基因與DNA區段相關的基因變異，即佔據同一基因座的兩或多種不同形式的DNA序列中的一種。
生物化學命名本文使用標準的生物化學命名，其中核苷酸鹼基記作腺嘌呤(A)；胸腺嘧啶(T)；鳥嘌呤(G)；和胞嘧啶(C)。相應的核苷酸例如是脫氧鳥苷-5』-三磷酸(dGTP)。
DNA多態性在一種DNA序列中有兩或多種不同核苷酸序列共存在同一種間雜交群體中的狀態。
基因座染色體上的特定位置，基因座的等位基因位於同源染色體的相同位點上。
基因座特異性引物在擴增方法所用的條件下，至少對於所述基因座的一個等位基因而言，與該基因座的一部分或其互補鏈特異雜交但不與其它DNA序列有效雜交的一種引物。
聚合酶鏈反應(PCR)用變性、與引物退火及DNA聚合酶延伸的多個循環將靶DNA序列的拷貝數擴增約106倍或更多倍的技術。用於擴增核酸的聚合酶鏈反應方法由美國專利4,683,195和4,683,202覆蓋，兩篇專利引入本文用於描述該方法。
多態性短串聯重複基因座是這樣一種STR基因座，其中在基因組DNA的一特定區域中重複序列單元數(及序列淨長度)由等位基因的不同而不同，由個體的不同而不同。
多態性信息含量(PIC)在一個基因座存在的多態性的量的量度(Bostein等，1980)。PIC值從0至1.0，值越高表示多態性程度越高。這一量度通常比其它常用的量度即雜合度顯示出較小的值。對於高信息含量的標記(雜合度超過約70％)，雜合度和PIC之間的差異很小。
一級反應用純化的人基因組DNA作為PCR模板的初始反應。
引物，兩個單鏈寡核苷酸或DNA片段，其與基因座的對應鏈雜交從而引物的3』末端位於最近端。
引物對兩個引物，包括引物1，其與待擴增的DNA序列的一端的單鏈雜交，以及引物2，其與待擴增的DNA序列的互補鏈的另一端雜交。
引物位點，引物與之雜交的靶DNA的區域。
二級反應使用初級反應物的稀釋液作為PCR模板利用相同或不同引物對進行的再擴增。
短串聯重複基因座(STR基因座)含有長度為3-7bp的短的重複序列單元的人基因組區域。B．多重反應成分的選擇本發明方法涉及選擇一套合適的基因座、引物及擴增方案以從多個共擴增的基因座產生擴增的等位基因，這些擴增的等位基因或者大小互不重疊，或者大小重疊但以某種方式被標記而使它們相互能區分開。另外，本發明方法還涉及選擇能使用一單擴增方案的短串聯重複基因座。本文描述的基因座的特異組合是本申請特有的。基因座的組合可由上述兩種原因的任一種而否決，或者由於結合考慮一或多個基同座不能產生合適的產物產率或在這一反應中產生不能代表真正的等位基因的片段而加以否決。
除了本文公開的那些組合外，可以通過反覆試驗基因座組合、通過選擇引物對序列及通過調整引物濃度以達到所有包括的基因座均可被擴增的平衡而產生成功的組合。一旦公開了本發明的方法和材料，本領域熟練技術人員很容易想到各種選擇本發明方法和試劑盒中所用的基因座、引物對及擴增技術的方法，所有這些方法均屬於所附權利要求書的範圍內。
在本發明方法實施中特別重要的是從在多重擴增反應步驟中一起擴增的各個基因座產生的擴增的等位基因的大小範圍。為了便於用目前的技術分析，最優選的是能通過擴增小於500個鹼基的片段檢測的系統。在上述發明簡述部分描述了基因座、引物和擴增技術的最優選組合。
引物選擇不合適會產生若干不希望的結果如缺少擴增、在多個位點擴增、形成引物二聚體、來自不同基因座的引物序列的不希望的相互作用、從一個基因座產生與另一個基因座的等位基因重疊的等位基因、或者對於在多重體系中不相容的不同基因座需要不同的擴增條件或方案。本方法所用的引物的合成可使用本領域技術人員公知的任何寡核苷酸合成標準程序來進行。C．使用3個基因座的多重體系開發利用多於3個基因座的多重體系可用許多不同技術中的任一種選擇待分析的一套STR基因座。以下描述了一種優選的用於開發用於這種分析方法中的有用的基因座套的技術。一旦開發了含有3個基因座的多重體系，可以其為核心創建含有多於3個基因座的多重體系。創建了新的組合，包括開始的3個基因座。使用含有基因座D7S820,D13S317和D5S818的核心多重體系產生下述衍生的多重體系D16S539,D7S820,D13S317和D5S818；HUMCSF1PO,HUMTPOX,D16S539,D7S820,D13S317和D5S818；HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,D16S539,D7S820,D13S317和D5S818；以及HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31,D16S539,D7S820,D13S317和D5S818。
應理解的是基因座核心套可用於產生其它合適的STR基因座衍生套，以用於用本發明方法進行多重分析。無論用何種方法選擇用本發明方法分析的基因座，選擇用於多重分析的所有基因座均應具有下述特徵(1)它們應產生最小的損耗(例如在擴增步驟中由錯誤重複序列而導致的損耗)，(2)在多重擴增步驟中由使擴增的等位基因添加或缺失一個鹼基所致的假象很少或沒有，(3)由聚合酶進行的擴增反應的未成熟終止所致的假象很少或沒有，以及(4)沒有低於給定的真擴增的等位基因的較小分子量的「拖後」帶，所述的「拖後」帶來自連續的單鹼基缺失。見例如Schumm等，「用於多態性STR基因座的分析的非同位素多重擴增套的開發」，第四屆人類鑑定國際研討會1993，第177-187頁(Promega公司出版，1993)。
D．DNA樣品的製備可使用與擴增單個基因座相容的任何DNA製備方法製備用於本發明方法中的人基因組DNA樣品，有許多這類方法適用於製備用於本發明方法中的基因組DNA樣品，包括但不限於Patel,P.I.等(1984)，「人基因組中的HPRT基因和相關序列的組織」，體細胞分子遺傳學10:483-493，和Gill,P.等(1985)，「DNA「指紋」的法醫學應用」，自然318:577-579描述的DNA樣品製備方法。
在用於本發明方法之前，可用任何DNA檢測標準方法測定DNA濃度。然而，優選使用如Brunk C.F.等，4(1979)，「分析細胞勻漿物中的納克量的DNA」，分析生物化學92:497-500所述的測量技術經螢光測定DNA濃度。DNA濃度更優選通過比較DNA標準與人特異性探針的雜交量而測定，如Waye等(1979),Waye,J.S.等(1991)，「法醫學樣本中的人基因組脫氧核糖核酸(DNA)的靈敏特異性定量案例」，J.Forensic Sci.,36:1198-1203所述。在擴增反應中使用太多的模板DNA會產生假象，它們以另外的條帶顯示，但不代表真正的等位基因。E.DNA的擴增分離出人基因組DNA樣品並如上述測定其濃度後，可在本方法的多重擴增步驟中共擴增靶基因座。可使用各種不同擴增方法擴增基因座，包括但不限於聚合酶鏈反應(PCR)(Saiki)P.K.等(1985),「β一珠蛋白基因組序列的酶促擴增及限制位點分析以用於診斷鐮刀細胞貧血症」，科學230:1350-1354)，基於轉錄的擴增(Kwoh,D.Y.,Kwoh,T.J.(1990)，「在基於核酸的診斷途徑中的靶擴增系統」，美國生物技術實驗室，1990年10月)以及鏈置換擴增(SDA)(Walker,G.T.等(1992)，「由限制酶-DNA聚合酶系統進行的等溫體外擴增」，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.89:392-396)。優選地，使用特異於該套基因座中每個基因座的引物對和熱循環條件經PCR擴增DNA樣品。下述實施例中使用的引物序列的詳情請見本說明書最後的序列表，這些序列中的一些是本發明的另外的實施方案。
下述實施例中給出了用於本發明方法中的針對每個最優選基因座組合的最優選擴增方案的詳情。關於每個多重體系的特殊程序的附加細節也請見實施例。在實施例中使用的基因座特異性引物的序列包括的核苷酸數目在雜交所用條件下足以使之與待擴增的基因座的一個等位基因雜交並基本上不擴增其它基因座的等位基因，請參見Simons的美國專利5,192,659，該專利引入本文作參考，其更詳細地描述了基因座特異性引物。F.DNA片段的分離和檢測從本發明的多重擴增步驟產生一套擴增的等位基因後，評價擴增的等位基因。本方法的評價步驟可用各種不同方式完成，以下描述最優選的方式。
優選使用電泳分離多重擴增反應的產物，更優選變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(例見Sambrook,J.等(1989)，分子克隆實驗手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，第13.45-13.57頁)。實施例1中描述了本發明方法的評價步驟中使用的最優選的凝膠製備和電泳程序及條件。在變性聚丙烯醯胺凝膠中的DNA片段的分離是基於片段的大小。
擴增的等位基因在聚丙烯醯胺凝膠中分離後，可顯色凝膠中的等位基因和任何其它DNA(例如，DNA標記或等位基因梯)並進行分析。凝膠中的DNA的顯色可用任一種現有技術完成，包括銀染或報導者如放射性同位素、螢光物、化學發光物及與可檢測底物組合的酶。銀染是優選的顯色凝膠中的等位基因的方法(例見，Bassam,B.J.等(1991)，「聚丙烯醯胺凝膠中的DNA的快速而靈敏的銀染」，分析生物化學196:80-83)。更優選的方法是在多重反應中使用針對每個基因座的放射性標記的引物(例見，Hammond等(1994))或螢光標記的引物(例見，Schumm等(1994))，之後分別用放射自顯影或螢光檢測劑檢測標記的產物。上述三篇描述顯色等位基因的現有技術的參考文獻均引入本文。
DNA樣品中存在的等位基因優選通過與分子量標準如DNA標記或基因座特異性等位基因梯比較而確定，從而確定樣品內每個基因座上存在的等位基因。用於評價含有2個或多個多態性STR基因座的多重擴增反應的最優選的分子量標記由針對被評價的每個基因座的等位基因梯的組合而構成。例見，Schumm等，文獻同上，第178頁的關於等位基因梯及其構建方法的描述。
用於評價含有由使用針對每個基因座的螢光標記引物而產生的2個或多個多態性STR基因座的多重反應的優選的分子量標記由針對被評價的每個基因座的螢光標記的等位基因梯的組合而構成，見上述。
構建了針對各個基因座的等位基因梯後，可將它們混合併在上樣擴增的樣品的同時將它們上樣進行凝膠電泳。每個等位基因梯與樣品中的來自相應基因座的等位基因共遷移。
使用Automatic Processor Compatible(APC)膜(STP系統手冊#TMD004,得自Promega公司，Madison,WI)或使用螢光檢測儀器(STP系統手冊#TMD006,得自Promega公司，Madison,WI)可以產生數據的永久記錄。G．優選的檢測技術螢光檢測在本發明方法的一個最優選實施方案中，使用螢光檢測法評價由多重擴增反應產生的混合物中的擴增的等位基因。以下簡述了如何優選地實施該檢測方法。
由於自動螢光成像的出現，可以實現更快的多重擴增產物的檢測和分析。對於螢光分析，可以將一個螢光素化的引物包括在每個基因座的擴增反應中。下述實施例中描述了兩種優選的螢光標記引物的應用，即螢光素標記的(FL-)和四甲基羅丹明標記的(TMR-)引物。用這種標記的引物產生的擴增片段的分離與用銀染檢測法相同的方式進行。得到的凝膠可用Fluor ImagerTM分析儀(商購自MolecularDynamics,Sunnyvale,CA)或FMBIOTM(商購自Hitachi Corporation,SanBruno,CA)分析，兩種儀器可在非常短的時間內例如3-20分鐘掃描凝膠並記錄數據。
總之，本發明方法最優選在評價步驟使用螢光檢測來進行，在這一優選的檢測方法中，多重擴增反應中所用的每對引物對中的一個引物附著有一個螢光標記，因此由擴增反應產生的擴增的等位基因是螢光標記的。在本發明的這一最優選實施方案中，擴增的等位基因隨後在聚丙烯醯胺凝膠上分離並用螢光成像分析儀顯色分析分離的等位基因。
螢光檢測要優於放射性標記的檢測方法是因為它不需使用放射性物質，所有與使用這種物質相關的規章和安全問題也不存在。
螢光檢測還優於其它非放射性檢測方法如銀染，是因為螢光檢測方法通常比染色法產生較少的假象，較少的凝膠假象可能很大程度上歸因於在螢光檢測中僅有附著標記的DNA擴增片段被檢測，而使用銀染檢測方法時，從多重擴增反應中產生的每個DNA擴增片段均被染色和檢測。用銀染染色的聚丙烯醯胺凝膠還有明顯較高的背景，這是由於銀染染料與凝膠本身的非特異性結合所致，從而降低了檢測凝膠內的DNA條帶的靈敏性。下述兩套實施例中比較了銀染和螢光檢測方法。H．試劑盒本發明還涉及使用上述方法的試劑盒，基本的試劑盒包括一個具有一或多個針對每個基因座的基因座特異性引物的容器。也可任選地包括使用說明。
其它任選的試劑盒成分可包括針對每個特殊基因座的等位基因梯，足夠量的用於擴增的酶，促進擴增的擴增緩衝液，用於製備凝膠電泳所用擴增材料的上樣溶液，作為模板對照的人基因組DNA，用於保證材料如預期那樣在凝膠中遷移的分子量標記，以及指導用戶和限制使用錯誤的方案和手冊。試劑盒中各種試劑的量也可根據各種因素如方法的最優靈敏度而變化。用於手工應用的測試試劑盒或用於自動檢測儀或分析儀的測試試劑盒也在本發明範圍內。實施例下述實施例意在舉例說明本發明的優點並幫助本領域普通技術人員完成和使用本發明。實施例無意限制本發明的範圍。
基因組DNA分離和定量基本上按Puers,C.等(1993)所述進行，「使用基因座特異性等位基因梯進行的人群分析中多態性短串聯重複基因座HUMTH01[AATG]n上的重複序列異源性的鑑定以及等位基因的重排」，Am.J.Hum.Genet.53:953-958。這些方法通常是本領域人員公知的並且是本發明的應用所優選的但不是必須的。
通過0.4mm厚含7M尿素4％變性聚丙烯醯胺凝膠(丙烯醯胺與雙丙烯醯胺之比為19∶1)電泳分離擴增的產物(Sambrook等，(1989))，當涉及銀染分析時凝膠與玻璃板化學交聯(Kobayashi,Y.(1988)，「澆鑄薄測序凝膠的方法」，BRL Focus 10:73-74)。在涉及螢光分析時不採用這種交聯。DNA樣品與2.5μl上樣溶液(10mM NaOH,95％甲醯胺，0.05％溴酚藍，0.05％二甲苯青)混合，在95℃變性2分鐘，並在上樣前冰上冷凍。
聚丙烯醯胺凝膠電泳分離後，用銀染、螢光檢測、放射性檢測或上述檢測方法組合檢測擴增反應產物和DNA分子量標記對照。在某些實施例中，使用現有技術中描述的染色和檢測標準方法經銀染檢測凝膠中的反應產物和分子量標記。(例見Bassam等，(1991))。通過Automatic Processor Compatible膜(APC膜，Promega公司，貨號DQ4411)曝光而得到染色凝膠的永久圖像。在其它實施例中，使用現有技術中描述的方法(Schumm等，(1994))經螢光掃描進行檢測。
下述每個實施例是本發明方法的使用例子，在某些情況下，是使用本發明一或多個引物的例子以同時確定在來自一或多個DNA樣品的至少3個短串聯重複基因座中存在的等位基因。表1和2總結了在下述每個實施例中描述的多重擴增反應中共擴增的基因座套，這兩個表還指出了每個這種多重反應中所使用的用於擴增每個這種基因座的引物對。表1列出了用螢光掃描檢測來自所描述的多重反應的擴增的等位基因的所有實施例，而表2列出了用銀染檢測擴增的等位基因的實施例。
表1所列的每個引物對的一個引物在用於多重擴增反應之前用螢光標記。在某些情況下，使用不同的標記物標記針對不同基因座的引物，從而使用不同引物產生的等位基因可以用下述實施例中所用的螢光掃描儀掃描區分開。在下述實施例中使用了兩種不同的螢光標記物，下表1中「FL」是指螢光標記的，「TMR」是指四甲基羅丹明標記的。表1還指出在每個實施例中用於多重擴增反應的每個引物對的哪個引物是如此標記的(例如，「FL-2」是指SEQ ID NO:2的引物在用於多重擴增反應之前用螢光素在其5』末端標記)。
下述實施例中也使用了相同的FL和TMR縮寫。然而其中標記物的縮寫置於所述擴增反應使用的標記引物的SEQ ID NO之前(例如，「FL-SEQ ID NO:2」而非「FL-2」)。
在下述四對實施例(實施例2和3,4和5,7和8,19和23)中，使用相同的引物套、與所分析的每個STR基因座的每個引物對中的一個引物共價附著的相同螢光標記物分析同一套基因座。但是在每個實施例中標記不同的引物套。本文包含這些實施例對是為了證明不管在用於本發明方法的多重擴增反應之前引物對的哪個引物被標記，從同一套引物中均能得到相同的低背景及相同的等位基因鑑定結果。
表1
注意到在少數情況下，相同的基因座套和相同的引物對套出現於表1和表2中。在這種情況下，分別使用螢光檢測和銀染分析相同的等位基因套。本文實施例24和33，實施例25和30提供了兩個這種重複例子。這些實施例清楚表明用兩種方法均可獲得相同結果。
表2
實施例1基因座D3S1539,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D3S1539,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/μl在25μl1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.25μM D3S1539引物1[SEQ IDNO:7]和2[FL-SEQ ID NO:8]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.219μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖1，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D3S1539,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例2基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mMMgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.25μM D17S1298引物1[SEQID NO:9]和2[FL-SEQ ID NO:10]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.219μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖2，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例3基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測如實施例2所述擴增基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818，只是用FL-SEQ ID NO:9替換SEQ ID NO:9，用SEQ IDNO:10替換FL-SEQ ID NO:10。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖3，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D17S1298,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例4基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在-個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.25μM D20S481引物1[SEQ IDNO:11]和2[FL-SEQ ID NO:12]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.219μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖4，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例5基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測如實施例4所述擴增基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818，只是用FL-SEQ ID NO:11替換SEQ ID NO:11，用SEQ IDNO:12替換FL-SEQ ID NO:12。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖5，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D20S481,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例6基因座D9S930,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D9S930,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.70μM D9S930引物1[SEQ IDNO:13]和2[FL-SEQ ID NO:14]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用Fluor-ImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖6，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D9S930,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例7基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mMMgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.75μM D10S1239引物1[SEQID NO:15]和2[FL-SEQ ID NO:16]，各0.325μM D7S820引物1[SEQID NO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖7，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例8基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測如實施例7所述擴增基因座D10S1239,D7S820,D13S317和D5S818，只是用FL-SEQ ID NO:15替換SEQ ID NO:15，用SEQ IDNO:16替換FL-SEQ ID NO:16。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖8，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D3S1539,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例9基因座D14S118,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D14S118,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/μl在25μ1 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.50μM D14S118引物1[SEQ IDNO:17]和2[FL-SEQ ID NO:18]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖9，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D14S118,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例10基因座D14S562,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D14S562,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μ1 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.50μM D14S562引物1[FL-SEQ ID NO:19]和2[SEQ ID NO:20]，各0.325μM D7S820引物1[SEQID NO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖10，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D14S562,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例11基因座D14S548,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D14S548,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.50μM D14S548引物1[SEQ IDNO:21]和2[FL-SEQ ID NO:22]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖11，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D14S548,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例12基因座D16S490,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S490,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.50μM D16S490引物1[FL-SEQID NO:23]和2[SEQID NO:24]，各0.325μM D7S820引物1[SEQID NO:1]和2[FL-SEQID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖12，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D16S490,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例13基因座D16S753,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S753,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.50μM D16S753引物1[SEQ IDNO:25]和2[FL-SEQ ID NO:26]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖13，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D16S753,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例14基因座D17S1299,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D17S1299,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mMMgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.50μM D17S1299引物1[SEQID NO:27]和2[FL-SEQ ID NO:28]，各0.325μM D7S820引物1[SEQID NO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖14，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D17S1299,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例15基因座D16S539,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.60μM D16S539引物1[SEQ IDNO:29]和2[FL-SEQ ID NO:30]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.50μM D5S818引物1[SEQ ID NO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖15，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例16基因座D22S683,D7S820,D13S317和D5S818的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在-個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D22S683,D7S820,D13S317和D5S818上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04UTaqDNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.50μM D22S683引物1[SEQ IDNO:31]和2[FL-SEQ ID NO:32]，各0.325μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.375μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳45分鐘而分離並用FluorImagerTM螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖16，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D22S683,D7S820,D13S317和D5S818同時共擴增的DNA樣品。實施例17基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO和HUMTPOX的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO和HUMTPOX上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.06U Taq DNA聚合酶/μl在25μ1 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),O.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了12個擴增引物，包括各0.65μM D16S539引物1[SEQID NO:29]和2[FL-SEQ ID NO:30]，各0.325μM D7S820引物1[SEQID NO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.22μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.55μM D5S818引物1[SEQ ID NO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]，各0.40μM HUMCSF1PO引物1[TMR-SEQ IDNO:33]和2[SEQ ID NO:34]，各0.40μM HUMTPOX引物1[SEQ IDNO:35]和2[TMR-SEQ ID NO:36]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FMBIOFluorImagerTM(Hitachi Software Engineering,SanBruno,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖17，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示螢光素標記的和四甲基羅丹明標記的材料。泳道1-4含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO」)和HUMTPOX(「TPOX」)同時共擴增的DNA樣品。實施例18基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX和HUMTH01的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX和HUMTH01上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.07U Taq DNA聚合酶/μ1在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了14個擴增引物，包括各0.75μM D16S539引物1[SEQID NO:29]和2[FL-SEQ ID NO:30]，各0.40μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.30μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.60μM D5S818引物1[SEQ ID NO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]，各0.30μM HUMCSF1PO引物1[TMR-SEQ IDNO:33]和2[SEQ ID NO:34]，各0.40μM HUMTPOX引物1[SEQ IDNO:35]和2[TMR-SEQ ID NO:35]，各0.40μM HUMTH01引物1[SEQID NO:37]和2[TMR-SEQ ID NO:38]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FMBIOFluorImagerTM(Hitachi Software Engineering,SanBruno,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖18，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示螢光素標記的和四甲基羅丹明標記的材料。泳道1-5含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO」),HUMTPOX(「TPOX」)和HUMTH01(「TH01」)同時共擴增的DNA樣品。實施例19基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01和HUMvWFA31的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01和HUMvWFA31上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.08U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了16個擴增引物，包括各0.75μM D16S539引物1[SEQID NO:29]和2[FL-SEQ ID NO:30]，各0.40μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.30μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.60μM D5S818引物1[SEQ ID NO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]，各0.30μM HUMCSF1PO引物1[TMR-SEQ IDNO:33]和2[SEQ ID NO:34]，各0.40μM HUMTPOX引物1[SEQ IDNO:35]和2[TMR-SEQ ID NO:36]，各0.40μM HUMTH01引物1[SEQID NO:37]和2[TMR-SEQ ID NO:38]，各0.40μM HUMvWFA31引物1[SEQ ID NO:39]和2[TMR-SEQ ID NO:40]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FMBIOFluorImagerTM(Hitachi Software Engineering,SanBruno,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖19，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示螢光素標記的和四甲基羅丹明標記的材料。泳道1-5含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO」),HUMTPOX(「TPOX」)HUMTH01(「TH01」)和HUMvWFA31(「vWF」)同時共擴增的DNA樣品。實施例20基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01和HUMFESFPS的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01和HUMFESFPS上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.06U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),O.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了12個擴增引物，包括各0.75μM D16S539引物1[SEQID NO:29]和2[FL-SEQ ID NO:30]，各0.40μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.30μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.60μM D5S818引物1[SEQ ID NO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]，各0.10μM HUMF13A01引物1[TMR-SEQ IDNO:41]和2[SEQ ID NO:42]，各1.0μM HUMFESFPS引物1[TMR-SEQID NO:43]和2[SEQ ID NO:44]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FMBIOFluorImagerTM(Hitachi Software Engineering,SanBruno,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖20，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示螢光素標記的和四甲基羅丹明標記的材料。泳道1-5含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01(「F13A01」)和HUMFESFPS(「FESFPS」)同時共擴增的DNA樣品。實施例21基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS和HUMBFXIII的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS和HUMBFXIII上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.07U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP，dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了14個擴增引物，包括各0.75μM D16S539引物1[SEQID NO:29]和2[FL-SEQ ID NO:30]，各0.40μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.30μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.60μMD5S818引物1[SEQ ID NO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]，各0.10μM HUMF13A01引物1[TMR-SEQ IDNO:41]和2[SEQ ID NO:42]，各1.0μM HUMFESFPS引物1[TMR-SEQID NO:43]和2[SEQ ID NO:44]，各0.50μM HUMBFXIII引物1[TMR-SEQ ID NO:45]和2[SEQ ID NO:46]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FMBIOFluorImagerTM(Hitachi Software Engineering,SanBruno,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖21，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示螢光素標記的和四甲基羅丹明標記的材料。泳道1-5含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01(「F13A01」),HUMFESFPS(「FESFPS」)和HUMBFXIII(「F13B」)同時共擴增的DNA樣品。實施例22基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII和HUMLIPOL的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII和HUMLIPOL上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.08U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了16個擴增引物，各0.75μM D16S539引物1[SEQ IDNO:29]和2[FL-SEQ ID NO:30]，各0.40μM D7S820引物1[SEQ IDNO:1]和2[FL-SEQ ID NO:2]，各0.30μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.60μM D5S818引物1[SEQ ID NO:5]和2[FL-SEQ ID NO:6]，各0.10μM HUMF13A01引物1[TMR-SEQ IDNO:41]和2[SEQ ID NO:42]，各1.0μM HUMFESFPS引物1[TMR-SEQID NO:43]和2[SEQ ID NO:44]，各0.50μM HUMBFXIII引物1[TMR-SEQ ID NO:45]和2[SEQ ID NO:46]，各0.20μM HUMLIPOL引物1[TMR-SEQ ID NO:47]和2[SEQ ID NO:48]擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FMBIOFluorImagerTM(Hitachi Software Engineering,SanBruno,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖22，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示螢光素標記的和四甲基羅丹明標記的材料。泳道1-5含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01(「F13A01」),HUMFESFPS(「FESFPS」)和HUMBFXIII(「F13B」)和HUMLIPOL(「LPL」)同時共擴增的DNA樣品。實施例23基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01和HUMvWFA31的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01和HUMvWFA31上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.08U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200μlM dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了16個擴增引物，包括各0.75μM D16S539引物1[SEQID NO:29]和2[TMR-SEQ ID NO:30]，各0.40μM D7S820引物1[SEQID NO:1]和2[TMR-SEQ ID NO:2]，各0.30μM D13S317引物1[SEQID NO:3]和2[TMR-SEQ ID NO:4]，各0.60μM D5S818引物1[SEQ IDNO:5]和2[TMR-SEQ ID NO:6]，各0.40μM HUMCSF1PO引物1[FL-SEQ ID NO:33]和2[SEQ ID NO:34]，各0.50μM HUMTPOX引物1[SEQ ID NO:35]和2[FL-SEQ ID NO:36]，各0.20μM HUMTH01引物1[SEQ ID NO:37]和2[FL-SEQ ID NO:38]，各0.55μMHUMvWFA31引物1[SEQ ID NO:39]和2[FL-SEQ ID NO:40]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FMBIOFluorImagerTM((Hitachi Software Engineering,SanBruno,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖23，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，同一凝膠分別在505nm和625nm掃描，分別揭示螢光素標記的和四甲基羅丹明標記的材料。泳道1-3含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO(「CSF1PO」),HUMTPOX(「TPOX」),HUMTH01(「TH01」)和HUMvWFA31(「vWA」)同時共擴增的DNA樣品。實施例24基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mMMgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.75μM D3S1539引物1[SEQ IDNO:7]和2[FL-SEQ ID NO:49]，各0.75μM D19S253引物1[FL-SEQID NO:50]和2[SEQ ID NO:51]，各0.50μM D13S317引物1[SEQ IDNO:3]和2[FL-SEQ ID NO:4]，各0.50μM和D20S481引物1[SEQ IDNO:52]和2[FL-SEQ ID NO:53]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FluorImagerTM(螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖24，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481同時共擴增的DNA樣品。實施例25基因座D10S1239,D9S930,D4S2368和D20S481的多重擴增的螢光檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D10S1239,D9S930,D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μ1 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mMMgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.30μM D10S1239引物1[FL-SEQ ID NO:15]和2[SEQ ID NO:54]，各0.40μM D9S930引物1[SEQID NO:55]和2[FL-SEQ ID NO:14]，各0.50μM D4S2368引物1[SEQID NO:56]和2[FL-SEQ ID NO:57]，各0.50μM D20S48引物1[SEQ IDNO:52]和2[FL-SEQ ID NO:53]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並用FluorImagerTM(螢光掃描儀(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)檢測螢光信號而顯示產物。
參見圖25，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D10S1239,D9S930,D4S2368和D20S481同時共擴增的DNA樣品。實施例26基因座D16S539,D7S820和D13S317的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820和D13S317上的DNA模板。PCR擴增用5-20ng模板和0.03U Taq DNA聚合酶/μ1在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了6個擴增引物，包括各0.5μM D16S539引物1[SEQ IDNO:29]和2[SEQ ID NO:58]，各0.5μM D7S820引物1[SEQ ID NO:1]和2[SEQ ID NO:2]，各0.5μM D13S317引物1[SEQ ID NO:3]和2[SEQID NO:4]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖26，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-4含有針對基因座D16S539,D7S820和D13S317同時共擴增的DNA樣品，泳道5顯示了進行相同程序但無DNA模板的樣品，即陰性對照。實施例27基因座D16S539,D7S820,D13S317和HUMvWFA31的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D16S539,D7S820,D13S317和HUMvWFA31上的DNA模板。PCR擴增用5ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mMMgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.3μM D16S539引物1[SEQ IDNO:29]和2[SEQ ID NO:30]，各0.3μM D7S820引物1[SEQ ID NO:1]和2[SEQ ID NO:2]，各0.5μM D13S317引物1[SEQ ID NO:3]和2[SEQID NO:4]，各0.5μM HUMvWFA31引物1[SEQ ID NO:59]和2[SEQ IDNO:60]。
擴增產物在32cm凝膠上經40W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳50分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖27，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-3含有針對基因座D16S539,D7S820,D13S317和HUMvWFA31(「vWA」)同時共擴增的DNA樣品。實施例28基因座D10S1239,D9S930和D13S317的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D10S1239,D9S930和D13S317上的DNA模板。PCR擴增用未確定ng數模板和0.03U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘。
組合使用了6個擴增引物，包括各1.0μM D10S1239引物1[SEQ IDNO:15]和2[SEQ ID NO:54]，各0.3μM D9S930引物1[SEQ ID NO:55]和2[SEQ ID NO:61]，各0.5μM D13S317引物1[SEQ ID NO:3]和2[SEQID NO:4]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳60分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖28，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-3含有針對基因座D10S1239,D9S930和D13S317同時共擴增的DNA樣品。實施例29基因座D10S1239,D9S930和D4S2368的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D10S1239,D9S930和D4S2368上的DNA模板。PCR擴增用未確定ng數模板和0.03U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的941分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了6個擴增引物，包括各1.0μM D10S1239引物1[SEQ IDNO:15]和2[SEQ ID NO:54]，各0.3μM D9S930引物1[SEQ ID NO:55]和2[SEQ ID NO:61]，各0.15μM D4S2368引物1[SEQ ID NO:56]和2[SEQ ID NO:57]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳60分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖29，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-6含有針對基因座D10S1239,D9S930和D4S2368同時共擴增的DNA樣品。實施例30基因座D10S1239,D9S930,D4S2368和D20S481的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D10S1239，D9S930,D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴增用未確定ng數模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各1.0μM D10S1239引物1[SEQ IDNO:15]和2[SEQ ID NO:54]，各4.0μM D9S930引物1[SEQID NO:55]和2[SEQ ID NO:14]，各0.2μM D4S2368引物1[SEQ ID NO:56]和2[SEQ ID NO:57]，各0.2μM D20S481引物1[SEQ ID NO:52]和2[SEQID NO:53]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳67分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖30，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-4含有針對基因座D10S1239,D9S930,D4S2368和D20S481同時共擴增的DNA樣品。實施例31基因座D3S1539,D19S253和D13S317的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D3S1539,D19S253和D13S317上的DNA模板。PCR擴增用5.0ng模板和0.03U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘。
組合使用了6個擴增引物，包括各1.0μM D3S1539引物1[SEQ IDNO:7]和2[SEQ ID NO:49]，各1.0μM D19S253引物1[SEQ ID NO:50]和2[SEQ ID NO:51]，各0.5M D13S317引物1[SEQ ID NO:3]和2[SEQID NO:4]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳65分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖31，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-4含有針對基因座D3S1539,D19S253和D13S317同時共擴增的DNA樣品，泳道5顯示了進行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對照。實施例32基因座D3S1539,D19S253,D4S2368和D20S481的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D3S1539,D19S253,D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴增用5.0ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mMMgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,FosterCity,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各1.0μMD3S1539引物1[SEQ IDNO:7]和2[SEQ ID NO:49]，各0.5μM D19S253引物1[SEQ ID NO:50]和2[SEQ ID NO:51]，各0.1μM D4S2368引物1[SEQ ID NO:56]和2[SEQ ID NO:57]，各0.1μM D20S481引物1[SEQ ID NO:52]和2[SEQID NO:53]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳65分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖32，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-4含有針對基因座D3S1539,D19S253,D4S2368和D20S481同時共擴增的DNA樣品，泳道5顯示了進行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對照。實施例33基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481上的DNA模板。PCR擴增用0.5-250ng模板和0.04U Taq DNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(Perkin Elmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了8個擴增引物，包括各0.5μM D3S1539引物1[SEQ IDNO:7]和2[SEQID NO:49]，各0.5μM D19S253引物1[SEQ ID NO:50]和2[SEQ ID NO:51]，各0.5μM D13S317引物1[SEQ ID NO:3]和2[SEQID NO:4]，各0.2μM D20S481引物1[SEQ ID NO:52]和2[SEQ IDNO:53]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳68分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖33，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D3S1539,D19S253,D13S317和D20S481同時共擴增的DNA樣品，泳道6顯示了進行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對照。實施例34基因座D10S1239,D9S930和D20S481的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D10S1239,D9S930和D20S481上的DNA模板。PCR擴增用0.5-250ng模板和0.03UTaqDNA聚合酶/μl在25μl 1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了6個擴增引物，包括各1.0μM D10S1239引物1[SEQ IDNO:15]和2[SEQ ID NO:54]，各4.0μM D9S930引物1[SEQ ID NO:55]和2[SEQ ID NO:14]，各0.2μM D20S481引物1[SEQ ID NO:52]和2[SEQ ID NO:53]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳68分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖34，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D10S1239,D9S930和D20S481同時共擴增的DNA樣品，泳道6顯示了進行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對照。實施例35基因座D10S1239,D4S2368和D20S481的多重擴增的銀染檢測在本實施例中，在一個單個反應容器中同時擴增在各個基因座D10S1239,D4S2368和D20S481上的DNA模板。PCR擴增用0.5-250ng模板和0.03U Taq DNA聚合酶/μl在25μl1×STR緩衝液(50mMKCl,10mM Tris-HCl(pH9.0,25℃),0.1％Triton X-100,1.5mM MgCl2和各200(M dATP,dCTP,dGTP和dTTP)中進行。用熱循環儀480(PerkinElmer,Foster City,CA)進行下述擴增方案96℃2分鐘，然後10個循環的94℃1分鐘，60℃1分鐘和70℃1.5分鐘，之後20個循環的90℃1分鐘，60℃1分鐘，70℃1.5分鐘，最後1個循環的60℃30分鐘。
組合使用了6個擴增引物，包括各1.0μM D10S1239引物1[SEQ IDNO:15]和2[SEQ ID NO:54]，各0.2μM D4S2368引物1[SEQ ID NO:56]和2[SEQ ID NO:57]，各0.2μM D20S481引物1[SEQ ID NO:52]和2[SEQ ID NO:53]。
擴增產物在40cm凝膠上經60W變性聚丙烯醯胺凝膠電泳68分鐘而分離並根據Bassam等(1991)的方案經銀染分析顯示產物。
參見圖35，該圖顯示了每個基因座的擴增片段，泳道1-5含有針對基因座D10S1239,D4S2368和D20S481同時共擴增的DNA樣品，泳道6顯示了進行相同程序但不含DNA模板的樣品，即陰性對照。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人詹姆斯·W·舒姆(ⅱ)發明名稱短串聯重複基因座的多重擴增(ⅲ)序列數61(ⅳ)通訊地址(A)收信人普羅梅加公司(B)街道2800 Woods Hollow Road(C)城市Madison(D)州Wisconsin(E)國家USA(F)ZIP:20850(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5英寸軟盤，1.44Mb(B)計算機IBMPC兼容機(C)作業系統DOS6.0版(D)軟體Wordperfect 5.1(DOS文本格式)(ⅵ)本申請資料(A)申請號08/632,575(B)申請日04/15/96(C)分類435(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/316,544(B)申請日09/30/94(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型人基因組DNA(ⅲ)假設無(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D7S820(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GAACACTTGT CATAGTTTAG AACG 24(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D7S820(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:CTGAGGTATC AAAAACTCAG AGG 23(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D13S317(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ACAGAAGTCT GGGATGTGGA20(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D13S317(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:GCCCAAAAAG ACAGACAGAA 20(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D5S818(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:GGGTGATTTT CCTCTTTGGT 20(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D5S818(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:TGATTCCAAT CATAGCCACA 20(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度26(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D3S1539(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:TCTCTTTCCA TTACTCTCTC CATAGC 26(2)SEQIDNO:8的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度22
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D3S1539(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:AGTGCTGTTT TAGCTTCCAG GA 22(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D17S1298(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:GTAGGTCTTT TGGTTGCCAG TATG 24(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D17S1298(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:TGTCAGTAAA CCTGTGACCT GAGT 24(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度26(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D20S481(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:AATGGTGAGA AATGGGTTAT GAGTGC26(2)SEQ ID NO:12的信息
(ⅰ)序列特徵(A)長度25(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D10S481(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:TTTCCGGCTT TGTGTCATAA AACAG 25(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D9S930(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:TGGACAACAG AGTGAGATGC 20(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D9S930(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14:GCTATGGGAA TTACAAGCAG GAA 23(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度26(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D10S1239(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:CTTTGAAATG GACCCCTAGC TAATGT 26(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D10S1239(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16:CACCCTGTCC CCAGCTATCT G 21(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D14S118(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17:CAGCTTGGGC AACATAGGG 19(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D14S118(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18:CAAACTCCTG AGGTCAAACA ATCC 24(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置
(B)圖譜位置D14S562(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19:CTTGGAGGGT GGGGTGGCTA A 21(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D14S562(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20:CGAAATTTTG TTGCCTTGCT CTGG 24(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D14S548(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21:CCTGGGCAAC AGAGTGAGAC T 21(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D14S548(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:22:ACCCAG CTTT AACAGTTTGT GCTT 24(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D16S490(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:23:GGGCGGACAC AGAATGTAAA ATC 23(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D16S490(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:24:AAACCCAAAT AGATGACAGG CACA 24(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D16S753(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:25:GCACTCCAGG CTGAATGACA GAAC 24(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D16S753(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:26:GCAGTGCCGC CTATTTTTGT GAAT 24(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D17S1299(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:27:ACCCTGATGA GATAGCACTT GAGC 24(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D17S1299(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:28:CACTGTGTGG AGGTGTAGCA GAGA 24(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D16S539(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:29:GGGGGTCTAA GAGCTTGTAA AAAG 24(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度26(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D16S539(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:30:TGTGCATCTG TAAGCATGTA TCTATC26(2)SEQ ID NO:31的信息
(ⅰ)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D22S683(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:31:CGAAGGTTGC ATTGAGCCAA GAT 23(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D22S683(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:32:TGGTGGAAAT GCCTCATGTA GAAA 24(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMCSF1PO(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:33:AACCTGAGTC TGCCAAGGAC TAGC 24(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMCSF1PO(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:TTCCACACAC CACTGGCCAT CTTC 24(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMTPOX(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:ACTGGCACAG AACAGGCACT TAGG 24(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMTPOX(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:GGAGGAACTG GGAACCACAC AGGT 24(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMTHO1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:ATTCAAAGGG TATCTGGGCT CTGG 24(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMTHO1(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:GTGGGCTGAA AAGCTCCCGA TTAT 24(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMvWFA31(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:GAAAGCCCTA GTGGATGATA AGAATAATC 29(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMvWFA31(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:GGACAGATGA TAAATACATA GGATGGATGG30(2)SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMF13A01(ⅹⅰ)序列描述SEQID NO:41:GAGGTTGCAC TCCAGCCTTT GCAA 24(2)SEQ ID NO:42的信息
(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMF13A01(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:TTCCTGAATC ATCCCAGAGC CACA 24(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMFESFPS(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:GCTGTTAATT CATGTAGGGA AGG 23(2)SEQ ID NO:44的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMFESFPS(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:44:GTAGTCCCAG CTACTTGGCT ACTC 24(2)SEQ ID NO:45的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMBFXIII
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:45:TGAGGTGGTG TACTACCATA 20(2)SEQ ID NO:46的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMBFXIII(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:46:GATCATGCCA TTGCACTCTA 20(2)SEQ ID NO:47的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMLIPOL(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:47:CTGACCAAGG ATAGTGGGAT ATAG 24(2)SEQ ID NO:48的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMLIPOL(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:48:GGTAACTGAG CGAGACTGTG TCT 23(2)SEQ ID NO:49的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度18(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D3S1539(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:49:CCACCCTTTC AGCACCAG18(2)SEQ ID NO:50的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度20(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D19S253(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:50:ATAGACAGAC AGACGGACTG 20(2)SEQ ID NO:51的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度19(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D19S253(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:51:GGGAGTGGAG ATTACCCCT19(2)SEQ ID NO:52的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度21(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D20S481(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:52:AAAGCTCTCT GAAGCAGGTG T 21(2)SEQ ID NO:53的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D20S481(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:53:CAGATTGCAC TAGAAAGAGA GGAA 24(2)SEQ ID NO:54的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度23(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D10S1239(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:54:CACCCTGTCC CCAGCTATCT GGA 23(2)SEQ ID NO:55的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度27(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D9S930(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:55:AGTTGAATCT TGAGTCTCTC AGAGTCA 27(2)SEQ ID NO:56的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置
(B)圖譜位置D4S2368(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:56:TGTACTCATT TTCCCGCAAT GATG 24(2)SEQ ID NO:57的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度24(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D4S2368(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:57:TCAGAAAGTA GGGTCTGGGC TCTT 24(2)SEQ ID NO:58的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度28(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D16S539(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:58:TGTGCATCTG TAAGCATGTA TCTATCAT 28(2)SEQ ID NO:59的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度32(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMvWFA31(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:59:GAAAGCCCTA GTGGATGATA AGAATAATCA GT 32(2)SEQ ID NO:60的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度33(B)類型核酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置HUMvWFA31(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:60:GGACAGATGA TAAATACATA GGATGGATGG ATA 33(2)SEQ ID NO:61的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度25(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅷ)基因組中的位置(B)圖譜位置D9S930(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:61:GCTATGGGAA TTACAAGCAG GAAAC 25
權利要求書按照條約第19條的修改1、一種同時確定來自一或多個DNA樣品的至少4個短串重複基因座中存在的等位基因的方法，包括a．獲得至少一個待分析的DNA樣品，b．選擇該待分析的DNA樣品的能一起擴增的一套至少4個短串重複基因座，其中該套至少4個基因座選自如下一組基因座D3S1539,D4S2368,D5S818,D7S820,D9S930,D10S1239,D13S317,D14S118,D14S548,D14S562,D16S490,D16S539,D16S753,D17S1298,D17S1299,D19S253,D20S481,D22S683,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMFESFPS,HUMF13A01,HUMBFXIII,HUMLIPOL,HUMvWFA31；c．在一多重擴增反應中共擴增該套基因座，其中反應產物是從該套共擴增基因座的每個基因座擴增的等位基因的混合物；以及d．評價混合物中的擴增的等位基因以確定在該DNA樣品內的該套基因座中所分析的每個基因座存在的等位基因。
2、權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套4個基因座，其中該套4個基因座選自下述基因座套D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818；D20S481,D7S820,D13S317,D5S818；D9S930,D7S820,D13S317,D5S818；D1OS1239,D7S820,D13S317,D5S818；D14S118,D7S820,D13S317,D5S818；D14S562,D7S820,D13S317,D5S818；
D14S548,D7S820,D13S317,D5S818；D16S490,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818；D22S683,D7S820,D13S317,D5S818；D16S753,D7S820,D13S317,D5S818；D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481；D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481；和D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31。
3、權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套6個基因座，其中該套6個基因座選自下述基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS。
4、權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套7個基因座，其中該套7個基因座選自下述基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII。
5、權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套8個基因座，其中該套8個基因座選自下述基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII,HUMLIPOL。
6、權利要求1的方法，其中多重擴增反應是使用位於所分析的至少4個基因座兩側的至少4對引物進行的。
7、權利要求6的方法，還包括篩選用於多重擴增反應的引物對的步驟，所述引物對能從每個基因座產生當用凝膠電泳分離時與共擴增的該套基因座的其它基因座的等位基因不重疊的等位基因。
8、權利要求6的方法，其中多重擴增反應所用的每個引物對的至少一個引物具有選自如下一組序列中的序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，當該套基因座中的一個基因座是D7S820時；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，當該套基因座中的一個基因座是D13S317時；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，當該套基因座中的一個基因座是D5S818時；SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:49，當該套基因座中的一個基因座是D3S1539時；SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10，當該套基因座中的一個基因座是D17S1298時；SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:52,SEQID NO:53，當該套基因座中的一個基因座是D20S481時；SEQID NO:13,SEQID NO:14,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:61，當該套基因座中的一個基因座是D9S930時；SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:54，當該套基因座中的一個基因座是D10S1239時；SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18，當該套基因座中的一個基因座是D14S118時；SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20，當該套基因座中的一個基因座是D14S562時；SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22，當該套基因座中的一個基因座是D14S548時；
SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24，當該套基因座中的一個基因座是D16S490時；SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26，當該套基因座中的一個基因座是D16S753時；SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28，當該套基因座中的一個基因座是D17S1299時；SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:58，當該套基因座中的一個基因座是D16S539時；SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32，當該套基因座中的一個基因座是D22S683時；SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34，當該套基因座中的一個基因座是HUMCSF1PO時；SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36，當該套基因座中的一個基因座是HUMTPOX時；SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38，當該套基因座中的一個基因座是HUMTHO1時；SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60，當該套基因座中的一個基因座是HUMvWFA31時；SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42，當該套基因座中的一個基因座是HUMF13A01時；SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44，當該套基因座中的一個基因座是HUMFESFPS時；SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46，當該套基因座中的一個基因座是HUMBFXIII時；SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48，當該套基因座中的一個基因座是HUMLIPOL時；SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51，當該套基因座中的一個基因座是D19S253時；和SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57，當該套基因座中的一個基因座是D4S2368時。
9、權利要求6的方法，其中多重擴增反應是聚合酶鏈反應。
10、權利要求1的方法，其中通過將擴增的等位基因與分子量標準比較而評價擴增的等位基因，其中分子量標準選自DNA標記物和基因座特異性等位基因梯。
11、權利要求1的方法，其中用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離等位基因並形成分離的等位基因的聚丙烯醯胺凝膠而評價擴增的等位基因。
12、權利要求11的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用銀染分析顯色等位基因而確定。
13、權利要求11的方法，其中在共擴增基因座時使用能與該套基因座中的每個基因座兩側的區域結合的引物，其中在共擴增每個基因座中使用的至少一個引物具有與其共價附著的螢光標記，從而由其產生的擴增的等位基因是螢光標記的，並且其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用螢光分析顯色等位基因而確定。
14、權利要求13的方法，其中螢光標記選自螢光素標記和四甲基羅丹明標記。
15、權利要求1的方法，其中待分析的至少一個DNA樣品分離自人組織，其中所述的人組織選自血液、精液、陰道細胞、頭髮、唾液、尿液、含有胎盤細胞或胚胎細胞的羊膜液、以及上述任何組織的混合物。
16、一種同時確定來自一或多個DNA樣品的3個短串重複基因座中存在的等位基因的方法，包括:
a．獲得至少一個待分析的DNA樣品，b．選擇該待分析的DNA樣品的能一起擴增的一套3個短串聯重複基因座，其中該套3個基因座選自如下一組基因座套D3S1539,D19S253,D13S317；D10S1239,D9S930,D20S481；D10S1239,D4S2368,D20S481；D1OS1239,D9S930,D4S2368；D16S539,D7S820,D13S317；和D10S1239,D9S930,D13S317。
c．在一多重擴增反應中共擴增該套3個基因座，其中反應產物是從該套共擴增基因座的每個基因座擴增的等位基因的混合物；以及d．評價混合物中的擴增的等位基因以確定在該DNA樣品內的該套基因座中所分析的每個基因座存在的等位基因。
17、權利要求16的方法，其中多重擴增反應使用3個引物對進行，其中每個引物對位於在反應中共擴增的該套基因座的3個短串聯重複基因座中的一個基因座的兩側。
18、權利要求17的方法，其中多重擴增反應所用的3個引物對中的每個引物均設計成能與反應中共擴增的該套基因座的一個基因座的等位基因雜交，其中當D7S820是該套共擴增的基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；當D13S317是該套共擴增的基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列；當D20S481是該套共擴增的基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO；52,SEQ ID NO:53的序列；當D9S930是該套共擴增的基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:61的序列；當D10S1239是該套共擴增的基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:44的序列；當D16S539是該套共擴增的基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的序列；以及當D4S2368是該套共擴增的基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的序列。
19、權利要求16的方法，其中多重擴增反應是聚合酶鏈反應。
20、權利要求16的方法，其中通過將擴增的等位基因與分子量標準比較而評價擴增的等位基因，其中分子量標準選自DNA標記物和基因座特異性等位基因梯。
21、權利要求16的方法，其中用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離等位基因並形成分離的等位基因的聚丙烯醯胺凝膠而評價擴增的等位基因。
22、權利要求21的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用銀染分析顯色等位基因而確定。
23、權利要求21的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用螢光分析顯色等位基因而確定。
24、權利要求16的方法，其中待分析的至少一個DNA樣品分離自人組織，其中所述的人組織選自血液、精液、陰道細胞、頭髮、唾液、尿液、含有胎盤細胞或胚胎細胞的羊膜液、以及上述任何組織的混合物。
25、一種用於同時分析在至少3個基因座中的短串聯重複序列的試劑盒，包括一個容器，該容器具有用於共擴增一套至少3個短串聯重複基因座的寡核苷酸引物，其中該套基因座選自如下一組基因座套
D3S1539,D19S253,D13S317；D10S1239,D9S930,D20S481；D10S1239,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368；D16S539,D7S820,D13S317；D10S1239,D9S930,D13S317；D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818；D20S481,D7S820,D13S317,D5S818；D9S930,D7S820,D13S317,D5S818；D10S1239,D7S820,D13S317,D5S818；D14S118,D7S820,D13S317,D5S818；D14S562,D7S820,D13S317,D5S818；D14S548,D7S820,D13S317,D5S818；D16S490,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818；D22S683,D7S820,D13S317,D5S818；D16S753,D7S820,D13S317,D5S818；D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481；D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481；D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII；
D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII,HUMLIPOL。
26、權利要求25的試劑盒，其中每個寡核苷酸引物設計成能與所選的該套至少3個基因座的一個基因座的等位基因雜交當D7S820是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；當D13S317是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列；當D5S818是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列；當D3S153是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:49，；當D17S1298是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQID NO:9和SEQ ID NO:10的序列；當D20S481是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:52,SEQ IDNO:53的序列；當D9S930是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:61的序列；當D10S1239是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:54的序列；
當D14S118是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18的序列；當D14S562是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20的序列；當D14S548是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22的序列；當D16S490是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24的序列；當D16S753是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26的序列；當D17S1299是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28的序列；當D16S539是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:58的序列；當D22S683是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32的序列；當HUMCSF1PO是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34的序列；當HUMTPOX是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36的序列；當HUMTH01是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38的序列；當HUMvWFA31是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:60的序列；當HUMF13A01是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42的序列；
當HUMFESFPS是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44的序列；當HUMBFXIII是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46的序列；當HUMLIPOL是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48的序列；當D19S253是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51的序列；和當D4S2368是該套基因座中的一個基因座時，至少一個引物具有選自SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57的序列。
27、權利要求25的試劑盒，進一步包括一個容器，該容器具有用於至少一個多重擴增反應的試劑。
28、權利要求25的試劑盒，進一步包括一個具有等位基因梯的容器。
29、權利要求28的試劑盒，其中等位基因梯的每一梯級以及針對基因座套的每個基因座的至少一個寡核苷酸引物具有一個共價連接的標記。
30、權利要求29的試劑盒，其中所述的標記為螢光標記。
31、權利要求30的試劑盒，其中至少一個寡核苷酸引物具有與容器中一些其它引物對不同的共價連接的螢光標記。
32、一對位於人DNA的基因座D3S1539兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:7的序列，另一個引物具有選自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:49的序列。
33、一對位於人DNA的基因座D17S1298兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:9的序列，另一個引物具有SEQ ID NO:10的序列。
34、一對位於人DNA的基因座D20S481兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有選自SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:52的序列，另一個引物具有選自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:53的序列。
35、一對位於人DNA的基因座D9S930兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:55的序列，另一個引物具有選自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:61的序列。
36、一對位於人DNA的基因座D4S2368兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:56的序列，另一個引物具有SEQ ID NO:57的序列。
37、一種同時確定來自一或多個DNA樣品的至少4個短串重複基因座中存在的等位基因的方法，包括a．獲得至少一個待分析的DNA樣品，b．選擇該待分析的DNA樣品的能一起擴增的一套至少4個短串聯重複基因座，其中該套基因座中的3個基因座是D7S820、D13S317和D5S818；c．在一多重擴增反應中共擴增該套基因座，其中反應產物是從該套共擴增基因座的每個基因座擴增的等位基因的混合物；以及d．評價混合物中的擴增的等位基因以確定在該DNA樣品內的該套基因座中所分析的每個基因座存在的等位基因。
38、權利要求37的方法，其中多重擴增反應是使用位於所分析的至少4個基因座兩側的至少4對引物進行的。
39、權利要求38的方法，還包括篩選用於多重擴增反應的引物對的步驟，所述引物對能從每個基因座產生當用凝膠電泳分離時與共擴增的該套基因座的其它基因座的等位基因不重疊的等位基因。
40、權利要求37的方法，其中多重擴增反應是聚合酶鏈反應。
41、權利要求37的方法，其中通過將擴增的等位基因與分子量標準比較而評價擴增的等位基因，其中分子量標準選自DNA標記物和基因座特異性等位基因梯。
42、權利要求37的方法，其中用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離等位基因並形成分離的等位基因的聚丙烯醯胺凝膠而評價擴增的等位基因。
43、權利要求42的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用銀染分析顯色等位基因而確定。
44、權利要求42的方法，其中在共擴增基因座時使用能與該套基因座中的每個基因座兩側的區域結合的引物，其中在共擴增每個基因座中使用的至少一個引物具有與其共價附著的螢光標記，從而由其產生的擴增的等位基因是螢光標記的，並且其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用螢光分析顯色等位基因而確定。
45、權利要求44的方法，其中螢光標記選自螢光素標記和四甲基羅丹明標記。
根據PCT條約第19條的修改的聲明申請人在此聲明對本國際申請的任何權利要求所做的修改均未添加新的內容。所做的修改僅是澄清所遞交的每個權利要求的保護主題，並為國際檢索單位審查本申請提供方便。
根據PCT條約第20條(2)，申請人請求將所附的根據PCT條約的修改文件傳送給指定局。
權利要求
1.一種同時確定來自一或多個DNA樣品的至少4個短串重複基因座中存在的等位基因的方法，包括a．獲得至少一個待分析的DNA樣品，其中該DNA樣品具有能一起擴增的一套至少4個基因座，並且該套基因座選自如下一組基因座D3S1539,D4S2368,D5S818,D7S820,D9S930,D10S1239,D13S317,D14S118,D14S548,D14S562,D16S490,D16S539,D16S753,D17S1298,D17S1299,D19S253,D20S481,D22S683,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTHO1,HUMFESFPS,HUMF13A01,HUMBFXⅢ,HUMLIPOL,HUMvWFA31；b．在一多重擴增反應中共擴增該套基因座，其中反應產物是從該套共擴增基因座的每個基因座擴增的等位基因的混合物；以及c．評價混合物中的擴增的等位基因以確定在該DNA樣品內的該套基因座中所分析的每個基因座存在的等位基因。
2.權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套4個基因座，其中該套4個基因座選自下述基因座套D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818；D20S481,D7S820,D13S317,D5S818；D9S930,D7S820,D13S317,D5S818；D10S1239,D7S820,D13S317,D5S818；D14S118,D7S820,D13S317,D5S818；D14S562,D7S820,D13S317,D5S818；D14S548,D7S820,D13S317,D5S818；D16S490,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818；D22S683,D7S820,D13S317,D5S818；D16S753,D7S820,D13S317,D5S818；D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481；D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481；和D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31。
3.權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套6個基因座，其中該套6個基因座選自下述基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS。
4.權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套7個基因座，其中該套7個基因座選自下述基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII。
5.權利要求1的方法，其中共擴增的該套至少4個基因座是一套8個基因座，其中該套8個基因座選自下述基因座套D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII,HUMLIPOL。
6.權利要求1的方法，其中多重擴增反應是使用位於所分析的至少4個基因座兩側的至少4對引物進行的。
7.權利要求6的方法，還包括篩選用於多重擴增反應的引物對的步驟，所述引物對能從每個基因座產生當用凝膠電泳分離時與共擴增的該套基因座的其它基因座的等位基因不重疊的等位基因。
8.權利要求6的方法，其中多重擴增反應所用的每個引物對的至少一個引物具有選自如下一組序列中的序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，當該套基因座中的一個基因座是D7S820時；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，當該套基因座中的一個基因座是D13S317時；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，當該套基因座中的一個基因座是D5S818時；SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:49，當該套基因座中的一個基因座是D3S1539時；SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10，當該套基因座中的一個基因座是D17S1298時；SEQ ID NO:11,SEQID NO:12,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53，當該套基因座中的一個基因座是D20S481時；SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:61，當該套基因座中的一個基因座是D9S930時；SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:54，當該套基因座中的一個基因座是D10S1239時；SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18，當該套基因座中的一個基因座是D14S118時；SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20，當該套基因座中的一個基因座是D14S562時；SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22，當該套基因座中的一個基因座是D14S548時；SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24，當該套基因座中的一個基因座是D16S490時；SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26，當該套基因座中的一個基因座是D16S753時；SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28，當該套基因座中的一個基因座是D17S1299時；SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:58，當該套基因座中的一個基因座是D16S539時；SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32，當該套基因座中的一個基因座是D22S683時；SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34，當該套基因座中的一個基因座是HUMCSF1PO時；SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36，當該套基因座中的一個基因座是HUMTPOX時；SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38，當該套基因座中的一個基因座是HUMTHO1時；SEQ ID NO:39,SEQID NO:40,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:60，當該套基因座中的一個基因座是HUMvWFA31時；SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42，當該套基因座中的一個基因座是HUMF13A01時；SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44，當該套基因座中的一個基因座是HUMFESFPS時；SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46，當該套基因座中的一個基因座是HUMBFXIII時；SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48，當該套基因座中的一個基因座是HUMLIPOL時；SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51，當該套基因座中的一個基因座是D19S253時；和SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57，當該套基因座中的一個基因座是D4S2368時。
9.權利要求6的方法，其中多重擴增反應是聚合酶鏈反應。
10.權利要求1的方法，其中通過將擴增的等位基因與分子量標準比較而評價擴增的等位基因，其中分子量標準選自DNA標記物和基因座特異性等位基因梯。
11.權利要求1的方法，其中用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離等位基因並形成分離的等位基因的聚丙烯醯胺凝膠而評價擴增的等位基因。
12.權利要求11的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用銀染分析顯色等位基因而確定。
13.權利要求11的方法，其中在共擴增基因座時使用能與該套基因座中的每個基因座兩側的區域結合的引物，其中在共擴增每個基因座中使用的至少一個引物具有與其共價附著的螢光標記，從而由其產生的擴增的等位基因是螢光標記的，並且其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用螢光分析顯色等位基因而確定。
14.權利要求13的方法，其中螢光標記選自螢光素標記和四甲基羅丹明標記。
15.權利要求1的方法，其中待分析的至少一個DNA樣品分離自人組織，其中所述的人組織選自血液、精液、陰道細胞、頭髮、唾液、尿液、含有胎盤細胞或胚胎細胞的羊膜液、以及上述任何組織的混合物。
16.一種同時確定來自一或多個DNA樣品的3個短串重複基因座中存在的等位基因的方法，包括a．獲得至少一個待分析的DNA樣品，其中該DNA樣品具有能一起擴增的一套3個短串聯重複基因座，並且該套基因座選自如下一組基因座套D3S1539,D19S253,D13S317；D10S1239,D9S930,D20S481；D10S1239,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368；D16S539,D7S820,D13S317；和D10S1239,D9S930,D13S317。b．在一多重擴增反應中共擴增該套3個基因座，其中反應產物是從該套共擴增基因座的每個基因座擴增的等位基因的混合物；以及c．評價混合物中的擴增的等位基因以確定在該DNA樣品內的該套基因座中所分析的每個基因座存在的等位基因。
17.權利要求16的方法，其中多重擴增反應使用3個引物對進行，其中每個引物對位於在反應中共擴增的該套基因座的3個短串聯重複基因座中的一個基因座的兩側。
18.權利要求17的方法，其中多重擴增反應所用的每個引物對的至少一個引物具有選自如下一組序列中的序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，當D7S820是該套共擴增的基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，當D13S317是該套共擴增的基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53，當D20S481是該套共擴增的基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:61，當D9S930是該套共擴增的基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:44，當D10S1239是該套共擴增的基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30，當D16S539是該套共擴增的基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57，當是該套共擴增的基因座中的一個基因座時。
19.權利要求16的方法，其中多重擴增反應是聚合酶鏈反應。
20.權利要求16的方法，其中通過將擴增的等位基因與分子量標準比較而評價擴增的等位基因，其中分子量標準選自DNA標記物和基因座特異性等位基因梯。
21.權利要求16的方法，其中用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離等位基因並形成分離的等位基因的聚丙烯醯胺凝膠而評價擴增的等位基因。
22.權利要求21的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用銀染分析顯色等位基因而確定。
23.權利要求21的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用螢光分析顯色等位基因而確定。
24.權利要求16的方法，其中待分析的至少一個DNA樣品分離自人組織，其中所述的人組織選自血液、精液、陰道細胞、頭髮、唾液、尿液、含有胎盤細胞或胚胎細胞的羊膜液、以及上述任何組織的混合物。
25.一種用於同時分析在至少3個基因座中的短串聯重複序列的試劑盒，包括一個容器，該容器具有用於共擴增一套至少3個短串聯重複基因座的寡核苷酸引物，其中該套基因座選自如下一組基因座套D3S1539,D19S253,D13S317；D10S1239,D9S930,D20S481；D10S1239,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368；D16S539,D7S820,D13S317；D10S1239,D9S730,D13S317；D3S1539,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1298,D7S820,D13S317,D5S818；D20S481,D7S820,D13S317,D5S818；D9S930,D7S820,D13S317,D5S818；D10S1239,D7S820,D13S317,D5S818；D14S118,D7S820,D13S317,D5S818；D14S562,D7S820,D13S317,D5S818；D14S548,D7S820,D13S317,D5S818；D16S490,D7S820,D13S317,D5S818；D17S1299,D7S820,D13S317,D5S818；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818；D22S683,D7S820,D13S317,D5S818；D16S753,D7S820,D13S317,D5S818；D3S1539,D19S253,D13S317,D20S481；D3S1539,D19S253,D4S2368,D20S481；D10S1239,D9S930,D4S2368,D20S481；D16S539,D7S820,D13S317,HUMvWFA31；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII；D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMCSF1PO,HUMTPOX,HUMTH01,HUMvWFA31；和D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMBFXIII,HUMLIPOL。
26.權利要求25的試劑盒，用於該套基因座的每個基因座的至少一個寡核苷酸引物具有選自如下一組的序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，當D7S820是該套基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，當D13S317是該套基因座中的一個基因座時；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，當該套基因座中的一個基因座是D5S818時；SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:49，當該套基因座中的一個基因座是D3S153時；SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10，當該套基因座中的一個基因座是D17S1298時；SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53，當該套基因座中的一個基因座是D20S481時；SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:61，當該套基因座中的一個基因座是D9S930時；SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:54，當該套基因座中的一個基因座是D10S1239時；SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:18，當該套基因座中的一個基因座是D14S118時；SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:20，當該套基因座中的一個基因座是D14S562時；SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:22，當該套基因座中的一個基因座是D14S548時；SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24，當該套基因座中的一個基因座是D16S490時；SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26，當該套基因座中的一個基因座是D16S753時；SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28，當該套基因座中的一個基因座是D17S1299時:SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:58，當該套基因座中的一個基因座是D16S539時；SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32，當該套基因座中的一個基因座是D22S683時；SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34，當該套基因座中的一個基因座是HUMCSF1PO時；SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36，當該套基因座中的一個基因座是HUMTPOX時；SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38，當該套基因座中的一個基因座是HUMTH01時；SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:60，當該套基因座中的一個基因座是HUMvWFA31時；SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42，當該套基因座中的一個基因座是HUMF13A01時；SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44，當該套基因座中的一個基因座是HUMFESFPS時；SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46，當該套基因座中的一個基因座是HUMBFXIII時；SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48，當該套基因座中的一個基因座是HUMLIPOL時；SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51，當該套基因座中的一個基因座是D19S253時；和SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57，當該套基因座中的一個基因座是D4S2368時。
27.權利要求25的試劑盒，進一步包括一個容器，該容器具有用於至少一個多重擴增反應的試劑。
28.權利要求25的試劑盒，進一步包括一個具有等位基因梯的容器。
29.權利要求28的試劑盒，其中等位基因梯的每一梯級以及針對基因座套的每個基因座的至少一個寡核苷酸引物具有一個共價連接的標記。
30.權利要求29的試劑盒，其中所述的標記為螢光標記。
31.權利要求30的試劑盒，其中至少一個寡核苷酸引物具有與容器中一些其它引物對不同的共價連接的螢光標記。
32.一對位於人DNA的基因座D3S1539兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:7的序列，另一個引物具有選自SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:49的序列。
33.一對位於人DNA的基因座D17S1298兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:9的序列，另一個引物具有SEQ ID NO:10的序列。
34.一對位於人DNA的基因座D20S481兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有選自SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:52的序列，另一個引物具有選自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:53的序列。
35.一對位於人DNA的基因座D9S930兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:55的序列，另一個引物具有選自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:61的序列。
36.一對位於人DNA的基因座D4S2368兩側的寡核苷酸引物對，其中該引物對中的一個引物具有SEQ ID NO:56的序列，另一個引物具有SEQ ID NO:57的序列。
37.一種同時確定來自一或多個DNA樣品的至少4個短串重複基因座中存在的等位基因的方法，包括:a．獲得至少一個待分析的DNA樣品，其中該DNA樣品具有能一起擴增的一套至少4個基因座，並且該套基因座中的3個基因座是D7S820、D13S317和D5S818；b．在一多重擴增反應中共擴增該套基因座，其中反應產物是從該套共擴增基因座的每個基因座擴增的等位基因的混合物；以及c．評價混合物中的擴增的等位基因以確定在該DNA樣品內的該套基因座中所分析的每個基因座存在的等位基因。
38.權利要求37的方法，其中多重擴增反應是使用位於所分析的至少4個基因座兩側的至少4對引物進行的。
39.權利要求38的方法，還包括篩選用於多重擴增反應的引物對的步驟，所述引物對能從每個基因座產生當用凝膠電泳分離時與共擴增的該套基因座的其它基因座的等位基因不重疊的等位基因。
40.權利要求37的方法，其中多重擴增反應是聚合酶鏈反應。
41.權利要求37的方法，其中通過將擴增的等位基因與分子量標準比較而評價擴增的等位基因，其中分子量標準選自DNA標記物和基因座特異性等位基因梯。
42.權利要求37的方法，其中用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離等位基因並形成分離的等位基因的聚丙烯醯胺凝膠而評價擴增的等位基因。
43.權利要求42的方法，其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用銀染分析顯色等位基因而確定。
44.權利要求42的方法，其中在共擴增基因座時使用能與該套基因座中的每個基因座兩側的區域結合的引物，其中在共擴增每個基因座中使用的至少一個引物具有與其共價附著的螢光標記，從而由其產生的擴增的等位基因是螢光標記的，並且其中聚丙烯醯胺凝膠中的分離的等位基因通過用螢光分析顯色等位基因而確定。
45.權利要求44的方法，其中螢光標記選自螢光素標記和四甲基羅丹明標記。
全文摘要
本發明涉及用PCR或其它擴增系統同時擴增多個獨立的基因座,以在一個多重反應中確定在該多重反應中所含的每個基因座的等位基因。所分析的基因座包括下述基因座:HUMvWFA31,HUMLIPOL,HUMBFXIII,HUMF13A01,HUMFESFPS,HUMTH01,HUMTPOX,HUMCSF1PO,D22S683,D20S481,D19S253,D17S1299,D17S1298,D16S753,D16S539,D16S490,D14S562,D14S548,D14S118,D13S317,D10S1299,D9S930,D7S820,D5S818,D4S2368,D3S1539。
文檔編號C12N15/09GK1219972SQ9719496
公開日1999年6月16日 申請日期1997年4月15日 優先權日1996年4月15日
發明者詹姆斯·W·舒姆, 凱薩琳·A·米卡, 唐·R·拉巴契 申請人:普羅梅加公司