一種來源於矮沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法

2023-07-25 01:30:11 1

專利名稱：一種來源於矮沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及來源於矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因及其對應編碼的胺基酸，此外本發明也涉及到這些基因的克隆方法。
背景技術：
矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名新疆沙冬青、小沙冬青、矮黃花木，屬於豆科(Leguminosae)、黃華族(Thermopsideae)、沙冬青屬(Ammopiptanthus Chengf.)，為第三紀孑遺植物，被列為國家二級瀕危保護植物。主要分布在海拔1800 2800m的乾旱荒山和石質戈壁類型的內蒙古西部和寧夏、甘肅、矮的部分沙漠、荒漠地帶，是該區唯一的常綠闊葉灌木，分布區內氣候乾旱，降水量遠小於蒸發量，年平均氣溫6.8°C，氣溫變化極值可達70°C以上。沙冬青具有很強的抗逆性，在相對瘠薄的土壤條件下仍能在高達70°C左右的地表沙溫和低至零下20°C 30°C的環境中正常生長發育。有很強的抗寒、抗旱和耐鹽鹼等抗逆特性。國內外關於沙冬青屬植物的報導包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱機理及相關的超微結構；染色體數目及核型、減數分裂期染色體行為、開花物候、和引種栽培試驗等。這些研究都證實了沙冬青抗旱耐凍的特性，因此它是珍貴的抗旱耐凍遺傳資源。I型液泡膜焦磷酸酶是由單個亞基組成的位於液泡膜上利用焦磷酸鹽(PPi)勢能作為能量在細胞內部各個腔室形成質子梯度的蛋白。I型液泡膜焦磷酸酶基因的表達與非生物脅迫有關，能提高植物耐鹽和乾旱脅迫的耐受力；1型液泡膜焦磷酸酶能夠調節植物激素的轉運，進而調節由這些植物激素所介導的生長發育過程，並且受到植物激素(如，脫落酸)的調控。矮沙冬青作為優秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因對基礎和應用研究具有重要意義
發明內容
本發明的主要目的就是針對荒漠抗逆植物矮沙冬青的抗逆基因開發研究的局限性，提供來源於植物矮沙冬青具有抗旱和耐鹽功能的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，以期應用於其它轉基因作物中使之具有相應的優良的抗逆性能。本發明的另一個目的是提供一種上述基因序列的克隆方法。為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下:
一種來源於矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該序列具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列以及該基因對應的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所述。上述核苷酸序列，可通過包括下述步驟的方法，從植物矮沙冬青葉片中提取總RNA、設計引物、進行PCR擴增、測序等克隆得到:
(I)總RNA的提取和純化:可採用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA ;常用的RNA提取方法很多，如試劑盒法、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法、及各種改進方法等，均可用於矮沙冬青葉片總RNA的提取；本發明中可優選試劑盒法(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAot2.0提取試劑盒，CAT#90404-50)，進行矮沙冬青葉片總RNA提取。純化主要是為了去除總RNA中的DNA汙染，獲得純化的矮沙冬青葉片總RNA，以滿足後續對目的基因的表達進行定量檢測等需要。常用的RNA純化方法包括:DNA酶消化法(簡稱D法)、酸酚變性法(簡稱S法)、EDTA法(簡稱E法)等；本發明中可優選DNA酶(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2.0提取試劑盒，CAT#90404-50)消化法。(2)中間片段的克隆:
A、中間片段cDNA第一 鏈的合成
以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板,使用3』 RACE Adaptor (可優選TaKaRa 公司 3』-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒)進行反轉錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板。B、PCR 擴增
以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述兼併上遊引物(jf3)和兼併下遊引物(jx3 )，進行PCR擴增。所述I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增引物可優選為: jf3: 5』 -GGTCTTCTATGGCTTTGTTYGG-3，，
jx3: 5』 -TRGCAGARAACCAGTAAGGRAG-3』 ；
擴增得到矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。本步驟中，擴增體系可優選為:
TaqPlusPCR Master Mix20 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(jx3/jf3)I UL ,
ddH2016 μ L o擴增程序可優選為:
95°C,3min ；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min (35 個循環);
72°C，8 min ;4°C保溫。(3) 3』端的克隆:
C、3，-outer PCR 擴增
根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3』-outer，以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3』-outer和3』端下遊引物 3』-RACE outer (可優選 TaKaRa 公司 3』-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒)，進行3』端outer PCR擴增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因3』端的特異性上遊outer引物可優選為:
GSP3-3』 -outer: 5』 - TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT -3』 ；3』端下遊引物3』 -RACE outer可優選為:
3』 -RACE outer: 5』 - TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3』 ；
擴增得到的產物為cDNA 3』端。
本步驟中，擴增體系可優選為:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-outer/3，-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。擴增程序可優選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個循環)； 72°C，8 min ;4°C保 溫。D、3，-1nner PCR 擴增
根據前述步驟(2)所得中間片段端序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3』-1nner，以前述步驟C所得3』端的outer PCR產物模板，利用特異性上遊引物GSP3_3』-1nner和3』端下遊引物 3』-RACE inner (可優選 TaKaRa 公司 3』-FulI RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒)，進行3』端inner PCR擴增:I型液泡膜焦磷酸酶基因3』端的特異性上遊inner引物可優選為:
GSP3-3』 -1nner: 5』 - CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT -3』 ；
3』端下遊引物3』 -RACE inner可優選為:
3』 -RACE inner: 5』 - CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3』 ；
擴增得到的產物為cDNA 3』端inner PCR產物，通過克隆測序，得到3』端完整序列； 本步驟中，擴增體系可優選為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
3，-outer PCR 產物2 μ L，
2X 引物(GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nner)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L ,
ddH2028.75 μ L。擴增程序可優選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個循環)
72°C，8 min ;4°C保溫。(4) 5』端的克隆:
E、合成5』端的cDNA第一鏈:以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，經過對RNA進行預處理(可優選Ambion 公司 FirstChoice』 RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 試劑盒)，加入 5』 RACE Adapter進行反轉錄，(通過所述預處理實現對非完整mRNA的脫磷酸化和對完整mRNA的脫帽處理，排除非完整mRNA幹擾，使得完整的mRNA能夠高效地與5』 RACE Adapter連接。)
所述5』 RACE Adapter可優選為:
5， RACE Adapter: 5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA _3』 ；合成得到反轉錄產物5』端的cDNA第一鏈。F、5，-outer PCR 擴增
根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5』-outer，以前述步驟E所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5』-outer和5』端上遊引物5』 -RACE outer (可優選FirstChoice』 RLM-RACE Kit試劑盒)，進行5』端outer PCR擴增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因5』端的特異性下遊outer引物可優選為:
GSP3-5』 -outer: 5』 - TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG -3』 ；
5』端上遊引物5』 -RACE outer可優選為:
5』 -RACE outer: 5』 - GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3』 ；
擴增得到的產物為cDNA 5』端。本步驟中，擴增體系可優選為:
cDNA 模板IyL,
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-outer/5，-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L , ddH2034.75 μ L。擴增程序可優選為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 個循環)；
72°C，8 min ;12°C保溫。G、5，-1nner PCR 擴增
根據前述步驟(2)所得中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5』 -1nner,以前述步驟F所得5』端的outer PCR產物模板，利用特異性下遊引物GSP3-5』-1nner和5』端上遊引物 5』-RACE inner (可優選 FirstChoice』 RLM-RACE Kit 試劑盒),進行 5』端 innerPCR擴增:· I型液泡膜焦磷酸酶基因5』端的特異性下遊inner引物可優選為:
GSP3-5， -1nner: 5， - GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA -3，；
5』端上遊引物5』 -RACE inner可優選為:
5』 -RACE inner: 5』 - CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3』 ；
擴增得到的產物為cDNA 5』端inner PCR產物，通過克隆測序，得到5』端完整序列； 本步驟中，擴增體系可優選為:5，-outer PCR 產物I μ L，
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L))1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。擴增程序可優選為:
95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min/kbp (35 個循環)；
72。。，8 min，12°C保溫。(5)全長序列拼接和基因分析:
將上述步驟(2)所得中間片段、步驟(3)所得3』端inner PCR擴增序列和述步驟(4)所得5』端inner PCR擴增序列用DNAman軟體進行完整序列的拼接，然後通過NCBI裡ORFfinder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。(6) I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆:
將上述步驟(5)所分析的完整基因序列作為模板，設計上遊引物0RF3-S和下遊引物0RF3-A，並進行PCR擴增:
I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增引物可優選為:
0RF3-S: 5』 - ATGGGTGCAGCCATTCTCCC -3』，
0RF3-A: 5』 - TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3』 ；
擴增得到的產物為完整的矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。本步驟中，擴增體系可優選為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I yL ,
cDNA 模板I μ L ,
5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,
ddH2032.5 μ L。I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增程序可優選為:
98°C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個循環)；
與現有技術相比，本發明的有益效果是:
本發明是一種來源於植物矮沙冬青具有抗旱和耐鹽功能的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，並首次使用RACE方法在該物種中克隆此基因，得到該基因的完整全長序列。本發明克隆的I型液泡膜焦磷酸酶基因使人們對這個基因的研究對象從細菌及其他植物進一步擴展到矮沙冬青。並且， 根據矮沙冬青I型液泡膜焦磷酸酶的基因在酵母功能驗證試驗中所具備的優良的抗旱、耐鹽等性能可以預料:如果將其通過轉基因技術導入玉米等其他植物的基因中，將可培育出具有相應的優良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。


圖1為AnVPl基因電泳檢測結果圖，
圖2為AnVPl基因中間片段電泳檢測結果圖，
圖3為AnVPl基因3』端inner PCR電泳檢測結果圖，
圖4為AnVPl基因5』端inner PCR電泳檢測結果圖，
圖5為表達載體pRS6-AnVPl雙酶切鑑定的電泳檢測結果圖。圖6為酵母鹽脅迫對照試驗中的菌斑生長情況照片，圖中A、B、C、D、E分別表示培養基中添加的 NaCl 濃度為 O mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L、1.0 mol/L,同一NaCl濃度下的3列，從左至右分別為相應菌株的原液、5倍稀釋液和25倍稀釋液。圖7為酵母高溫脅迫對照試驗的菌斑生長情況照片，圖中A:30° C培養的對照菌液、B:53° C 高溫處理 2 min、C:53° C 高溫處理 4 min、D:53° C 高溫處理 6 min、E:53° C高溫處理8 min、F:53° C高溫處理10 min,同一處理時間下的3列，從左至右分別為相應菌株的原液、5倍稀釋液和25倍稀釋液。圖8為酵母乾旱脅迫對照試驗的菌斑生長情況照片，圖中同一山梨醇添加量下的3列，從左至右分別為相應菌株的原液、5倍稀釋液和25倍稀釋液。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於下述實施例。在不脫離本發明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發明的範圍內。在下述各實施例中，將矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶簡稱為。通過各實施例，最終得到來源於矮沙冬青的I型液 泡膜焦磷酸酶核苷酸序列(如SEQ ID N0.1所述)及其對應的胺基酸序列(如SEQ ID N0.2所述)。實施例1
本實施例為矮沙冬青葉片總RNA的提取和純化，總RNA提取使用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAOUIVci提取試劑盒，CAT#90404-50，包括下述步驟:
(I)估算組織細胞的用量。每次微量提取一般需要100-200 mg植物葉片或50-100 mg植物種子或200-500 mg植物果實。(2)先將新鮮植物組織剪切成小塊(保存在RNAL0CKER中的植物組織需用紙吸去RNAL0CKER液體後再剪切成小塊)，放入10-15 mL塑料離心管中，加入I mL 65°C預熱的溶液A (用前需要搖晃混勻)，然後用勻漿器勻漿5-20秒。勻漿時會產生泡沫，但不影響提取效果。也可以使用液氮硯磨法破碎植物組織，硯磨完後加入I mL溶液A，但效果比較差，因為研缽本質是二氧化矽，在溶液A存在時會吸附RNA。(3)將勻漿物或硯磨物轉移至乾淨的1.5 mL塑料離心管中(可以不必轉移非液體的細胞碎片)。有的植物組織(比如果實)含有大量水份，勻漿液會多於I mL，轉移時也只取I mL。(4)在離心管中加入0.3 mL的溶液B和0.2 mL自備氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。(5)室溫12000 rpm離心3_5分鐘，兩相間有約5mm厚的細胞破碎物。(6)將上清液(約0.6 mL)轉移到另一乾淨的1.5 mL塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質和其他雜質,避免觸及或吸取。最好留下100 UL上清液不取。(7)加入等體積的溶液C，充分顛倒混勻。(8)將一半溶液轉移到離心吸附柱(60911B)中，12000 rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。注意不要跟用於RNA提取的吸附柱(60911D)混用。(9)將剩下的一半溶液轉移到同一離心吸附柱中，12000 rpm室溫離心半分鐘，棄
穿透液。(10)將0.7 mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12000 rpm室溫離心10-30秒，
棄穿透液。(11) 12000 rpm室溫離心10秒以便去除殘留液體。(12)將 10 μ L (10 U)的 RNase-free DNase 加入到 50 μ L 37°C預熱的 DNA 膜反應液中，吹打混勻配製成DNase工作液。(13)將DNase工作液在37°C預熱I分鐘，然後全部加入到離心吸附柱中，室溫放置5分鐘。注意:5分鐘一般足夠降解大多數情況下的DNA汙染。如果DNA沒有徹底降解(可能由於樣品中殘留的雜質抑制了 DNase的活性)，此步的保溫時間可以適當延長到10分鐘或15分鐘。(14)直接在離心吸 附柱中加入0.7 mL通用洗柱液，蓋上蓋後顛倒數次混勻。(15) 12000 rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(16)再加0.3 mL通用洗柱液到離心吸附柱，12000 rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(17) 12000 rpm室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留乙醇會影響RNA的使用。(18)將離心吸附柱轉移到RNase-free收集管中，加入30-50 μ L RNA洗脫液，室溫放置1-2分鐘。(19) 12000 rpm室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品。本產品提供的離心吸附柱吸附力較強，一次洗脫不能全部將膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50 μ LRNA洗脫液一次。實施例2
本實施例為矮沙冬青總RNA的反轉錄，其反轉錄得到的cDNA第一鏈用於基因中間片段和 3，端擴增的模板，按照 Takara 公司的 3，-Full RACE Core Set Ver.2.0，Code:D314 試劑盒說明書進行cDNA第一鏈合成。實施例3
本實施例為基因中間片段的克隆，方法如下:
以蒺藜苜蓿(FJ176929.1)為詢問序列，參考百脈根(EF440187.1)、綠豆(AB009077.1)、大豆(AK285283.1)和豇豆(U31467.1)序列設計兼併引物 jf3/jx3:jf3: 5， - GCCCAAARGAGCTTTCACTY -3 ；jx3: 5』 - GAAGMARGTGACCRGGAAGG -3』。
以實施例2的cDNA第一鏈為模板，以設計的兼併引物jf3和jx3進行如基因cDNA中間片段的擴增。擴增體系為:TaqPlusPCRMaster Mix20 μ L， cDNA 模板 2 μ L ,
2Χ 引物(jx3/jf3)I UL ,
ddH2016 μ L ο擴增程序為:95° C，5min；
95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min (35 個循環);
72°C，8 min ;4°C保溫。取所得擴增產物20 μ L經1%非變性瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min, GoLdenView染色後紫外線檢測擴增片段，結果如圖2所示。擴增得到的產物為如KW基因cDNA中間片段，通過包括下述步驟的方法克隆測序，得到的中間片段序列如SEQ ID N0.3所述:
①目的片段的回收與純化:
將擴增出來的特異條帶用乾淨刀片在紫外光下快而準確的從瓊脂糖中挖出，置於1.5mL離心管中，用凝膠回收試劑盒(OMEGA公司的E.Z.N.A.TM GeL Extraction Kit)回收膠中的DNA片段；
②連接反應:
將回收的DNA片段克隆於TaKaRa公司的pMD19_T載體中。連接反應採用連接試劑盒(Takara公司)，擴增體系總體積10 μ L，16°C連接過夜；
③感受態細胞的製備:
1、從LB平板上挑取新活化的疋coLiDH5σ單菌落，接種於3_5 mL LB液體培養基中，37°C, 225 r/min振蕩培養12 h左右，直至對數生長後期。將該菌懸液以1:100-1:50的比例接種於100 mL LB液體培養基中，37°C振蕩培養2-3 h至0D600 = 0.35-0.5左右；
I1、將培養液轉入離心管，冰上放置10min，然後於4°C下3000 r/min離心10 min ；
II1、棄去上清，用預冷的0.05 moL/L的CaCL2溶液10 mL輕輕懸浮細胞，冰上放置15-30 min 後，4°C下 3000 r/min 離心 10 min ；
IV、棄去上清，加入4mL預冷含15%甘油的0.05 moL/L的CaCL2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液；
V、感受態細胞分裝成100μ L的小份，貯存於-70°C可保存半年；
④質粒DNA的轉化:
1、從_80°C冰箱中取出一管大腸桿菌感受態細胞a，置於冰上融化；
I1、在無菌條件下加入10μ L連接反應液，輕輕震搖混勻後，在冰上放置30 min ；
II1、42°C水浴熱擊90S，不要搖動，之後迅速放入冰浴冷卻2-3 min ；
IV、加入890μ L無Amp的LB液體培養基，混勻後，37°C、150 r/min搖床振搖培養，溫育I h;
V、取100μ L已轉化的菌液塗於一個LB/Amp的培養平板上，正面朝上放置30 min，待菌液完全被培養基吸收後，用封口膜封住，然後倒轉培養皿，37°C避光培養12-16 h ;隨後篩選陽性菌落；⑤重組菌落的鑑定與保存:從外觀上看，一般白色且圓的菌落為陽性，通過菌液PCR進一步鑑定:1、在過夜培養的平板上用滅菌的小槍頭挑取幾個白色菌落，分別點種於含0.1 g/LAmp的LB液體培養基的1.5 mL離心管中，37°C，150 r/min振搖培養4_6h ；
I1、取IUL菌懸液作為模板，用引物jfl/jxl進行PCR擴增，PCR反應條件中裂解時間延長至5min，用1%的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。如果產物為目的條帶時，此菌落為陽性克隆，否則為陰性。同時設不加菌懸液的陰性對照；
II1、取已經鑑定的陽性克隆的菌落懸浮液750μ L，加入250 μ L的滅菌甘油，混勻後，用液氮速凍，置於_80°C冰箱中保存備用；
IV、最後送英俊生物技術公司測序，所得序列在NCBI的BLastn進行比對分析，驗證克隆片段是否正確。實施例4
本實施例為如基因3』端的克隆，方法如下:
(1)3，-outer PCR 擴增:
根據實施例3得到的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3』 -outer，以實施例2所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3』 -outer和TaKaRa 公司 3』-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中 3』 端下遊引物3』 -RACE outer,進行 3』 端 outer PCR 擴增:
GSP3-3』 -outer: 5』 - TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT -3』 ；
3』 -RACE outer: 5』 - TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT -3』 ；
擴增體系為:
IXcDNA Dilution Buffer II8 yL ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-outer/3，-RACE-outer)I yL ,
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL ,
MgCl2 (25 mM)3 μ L，
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L,
ddH2028.75 μ L。擴增程序為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個循環)
72°C，8 min ;4°C保溫。(2) 3，-1nner PCR 擴增:
根據實施例3得到 的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3』-1nner，以上述(I)所得outer PCR產物為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3』 -1nner和TaKaRa公司3，-Full RACE Core Set Ver.2.0 (Code:D314)試劑盒中 3，端下遊引物 3，-RACE inner,進行3』端inner PCR擴增:
GSP3-3』 -1nner: 5』 - CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT -3』 ；
3』 -RACE inner: 5』 - CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG -3 ；擴增體系為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L ,
cDNA 模板2 μ L ,
2X 引物(GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nner)I yL ,
IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 μ L,
MgCl2 (25 mM)3 μ L,
TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L,
ddH2028.75 μ L。擴增程序為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C, I min 30 s (35 個循環)；
72°C，8 min ;4°C保溫。
取所得擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。擴增得到的產物為如KW基因3』端cDNA完整序列inner PCR產物，通過克隆測序(同實施例3)，得到的3』端cDNA完整序列如SEQ ID N0.4所述。實施例5
本實施例為5』端擴增的cDNA第一鏈合成:
以實施例1純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，經過Ambion公司FirstChoiceRLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 5』 RACE Adapter 後，以 RandomDecamers進行反轉錄:
5， RACE Adapter: 5， -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA _3』 ；合成得到反轉錄產物5』端的cDNA第一鏈。實施例6
本實施例為基因5』端的克隆，包括下述步驟:
(1)5，-outer PCR 擴增:
根據實施例3得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5』-outer，以實施例5所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5』 -outer和試劑盒 FirstChoice』 RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上遊引物 5，-RACE outer，進行 5，端outer PCR 擴增:
GSP3-5』 -outer: 5』 - TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG -3』 ；
5』 -RACE outer: 5』 - GCTGATGGCGATGAATGAACACTG -3』 ；
擴增體系為: cDNA 模板IyL,
10X PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-outer/5 ，-RACE outer)2 yL ,
ThermostabLe DNA polymerase (0.25 μ L of 5U/μ L) 1.25 μ L ,ddH2034.75 μ L。擴增程序為:95。。，3 min ；
95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個循環)；72°C，8 min ;12°C保溫。(2) 5，-1nner PCR 擴增:
根據實施例3得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5』 -1nner,以上述(I)所得outer PCR產物為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5』 -1nner和試劑盒FirstChoice，RLM-RACE Kit, SKU #:AM1700 中上遊引物 5』-RACE inner，進行 5』端 innerPCR擴增:
GSP3-5， -1nner: 5， - GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA -3，；
5』 -RACE inner: 5』 - CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG -3 ；
擴增體系為: 5，-outer PCR 產物I μ L，
IOX PCR Buffer5 μ L ,
dNTP Mix4 μ L ,
2X 引物(GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner)2 yL ,
ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L ,
ddH2034.75 μ L。
·
擴增程序為:
95。。，3 min ；
95 °C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個循環)；72°C，8 min ;12°C保溫。
取所得擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示。擴增得到的產物為如KW基因5』端cDNA完整序列inner PCR產物，通過克隆測序(同實施例3)，得到的5』端cDNA完整序列如SEQ ID N0.5所述。實施例7
本實施例為基因全長序列序列拼接和基因分析，包括下述步驟:將上述實施例3所得中間片段、實施例4所得3』端inner PCR擴增序列和實施例6所得5』端inner PCR擴增序列用DNAman軟體進行完整序列的拼接，然後通過NCBI裡ORFfinder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。實施例8
本實施例為AnVPl基因克隆，方法如下:以實施例7的基因分析設計上遊引物0RF3-S和下遊引物0RF3-A，以實施例5所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增:
0RF3-S: 5』 - ATGGGTGCAGCCATTCTCCC -3』，
0RF3-A: 5』 - TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3』 ；
擴增體系為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I yL ,
cDNA 模板I μ L ,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,
ddH2032.5 μ L。擴增程序為:
98 °C, 30 s ；62°C,30 s ；72°C,2 min 30 s (35 個循環)；
取所得擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。擴增得到的產物為完整的AnVPl基因序列，如SEQ ID N0.1所述；其對應的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所述。實施例9
本實施例為基因兩端添加酶切位點，方法如下:
根據實施例8得到的基因片段，設計併合成帶Xho I酶切位點的上遊引物vpU和帶BamHI酶切位點的下遊引物vpD，進行如KW基因的PCR擴增:vpU: 5』 - AACCTCGAG(Xho I )ATGGGTGCAGCCATTCTCC -3』 ；vpD: 5』 - CTGGATCC(BamH I )TTTTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACC -3』 ；
擴增體系為:
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,
2Χ 引物(vpU/vpD)I μ L，
cDNA 模板I μ L ,
5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2.5 U/μ L)0.5 yL ,
ddH2032.5 μ L。擴增程序為:
94。。，2 min ；
98°C, 10 s ；68°C,2 min 30 s (30 個循環)；
取所得擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增得到的產物為兩端帶有酶切位點的AnVPl基因，通過克隆測序(同實施例3)，驗證擴增片段是正確的。實施例10
本實施例為構建轉化酵母突變菌株enal (由復旦大學蒯本科教授課題組惠贈)的表達載體pRS6-AnVPl，方法如下:
(O 實施例9擴增的片段以及表達載體pRS6 (由本實驗室保存)骨架的制
備:
用限制性內切酶Xho I和BamH I按如下體系雙酶切實施例9擴增的片段以及表達載體pRS6。雙酶切體系:
BamH I1.0 μ L
Xho I1.0 UL
IOXK Buffer2.0 μ L
DNA4.0 μ LddH2012 μ L
30 ° C酶切8小時後，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測後回收與純化(同實施例3)。(2) 表達載體pRS6_AnVPl的構建:
用T4 DNA連接酶將經過Xho I和BamH I雙酶切回收和純化後的AnVPl片段和pRS6線
性表達載體骨架按如下體系進行連接。連接體系:
目的 DNA0.03 pmol
載體 DNA0.01 pmol
IOX連接酶緩衝液 2.0 yL` T4 DNA連接酶LOyL
16 ° C連接8小時，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測後回收與純化(同實施例3)。實施例11
本實施例為表達載體pRS6-AnVPl的克隆、鑑定與雙酶切檢測，方法如下:
(1)表達載體pRS6-AnVPl的克隆與鑑定:(同實施例3)` (2)表達載體pRS6-AnVPl的雙酶切檢測:
將(I)鑑定的陽性菌液按0.1:50的比列接種到新鮮的含有Amp的LB液體培養基，37° C振蕩培養過夜，提取質粒(按OMEGA公司的質粒提取試劑盒說明進行)並用XhoI和BamHI做雙酶切鑑定(雙酶切體系同實施例10)，結果如圖5所示。(3)將酶切正確的質粒所對應菌液送英俊生物技術公司測序。實施例12
本實施例為酵母突變菌株enal的感受態製備，步驟如下:
(I)酵母菌株enal培養於YPD固體培養基上，30° C倒置培養。(2)挑取一個2-3 mm的單克隆菌體於3 mL YI3D液體培養基裡，30° C，200 r/min搖床培養8-12 h。(3)取5 μ L培養物至50 mL新鮮的YH)液體培養基中，搖床培養至菌液在600nm波長下的吸光值(OD6qq)為0.15-0.3。(4) 700 r/min, 5min,室溫離心菌體，棄上清，沉澱重懸於100 mL YPD液體培養基中。(5 ) 30。C 培養至 OD6qq=0.4-0.5。(6)將培養物平均分配到兩個50 mL的離心管中，700 r/min，室溫離心5 min。棄上清，沉澱懸浮於30 mL去離子水中。(7) 700 r/min,室溫離心 5 min。棄上清,沉澱重懸於 1.5 mL 1.1 X TE/LiAc 中。(8)將菌體重懸物轉移至1.5 mL的離心管中，高速離心15 S。(9)棄上清，沉澱重懸於600 μ L的1.1 X TE/LiAC中，準備轉化。實施例13
本實施例為表達載體pRS6-AnVPl轉化酵母突變菌株enal感受態，步驟如下:
Cl)單鏈載體DNA (10 mg/mL)的製備:稱I g鮭魚精DNA溶於100 mL TE緩衝液中。用10 mL移液管反覆上下抽動使DNA分散均勻，然後置於磁力攪拌器中劇烈攪拌2-3 h直到完全溶解，或將溶液密封，置冷庫內攪拌過夜。分裝DNA樣品，置-20° C條件下保存。使用前，放沸水浴中至少5 min，之後置於冰浴中快速冷卻。(2)取2 μL目標質粒pRS6-AnVPl，同5 μ L單鏈載體DNA於L 5 mL的離心管中，再加入50 μ L酵母感受態細胞，輕輕混勻。(2)再往裡面加入0.5 mL PEG/LiAC，輕輕混勻。(3)30。C 培養 30 min，每隔 10 min 混勻一次。(4)再加入20 μ L DMS0，輕輕混勻。(5)42° C，水浴 20 min，每隔 5 min 混勻一次。(6)高速離心15 s,棄上清。(7)沉澱重懸於I mL YH)液體培養基中，30° C，搖床培養90 min。(8)高速離心15 s,棄上清,重懸細胞於I mL 0.9% Cw/v) NaCl中。(9)取100 UL 1/10或1/100稀釋度的混合液塗在組氨酸缺失的YNB培養基上，置於30° C，培養2-4 d，並挑選轉化子。實施例14
本實施例為酵母鹽脅迫對照試驗，步驟如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突變菌株enal及轉基因菌株enal_AnVPl的單克隆，酵母菌株WT、突變菌株enal接種至YPD液體培養基，轉基因菌株enal-AnVPI接種至HIS缺失的YNB液體培養基中；於30° C，200rpm進行過夜培養；
(2)次日按1:100比例擴大培養至OD6tltl=L2-1.5時，用滅菌水稀釋到各菌液的OD6tltl約為1.0 ;然後用滅菌水做5倍梯度稀釋，各得到三個不同稀釋度的菌液；
(3)從各稀釋度的菌液中取3μ L，點至分別添加O mol/L、0.2 mol/L、0.5 mol/L、0.7mol/LU.0 mol/L NaCl的YB)固體鹽脅迫培養基上，轉基因菌株enal-AnVPl設置3個平行樣，分別記為 enal-AnVPl-l、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVP1-3 ；
(4)30°C倒置培養2-3d，觀察菌斑生長情況，並照相保存，結果如圖6所示:隨著培養基中鹽濃度的增加，各菌種的均逐漸變差，但在同一鹽濃度下enal-AnVPl菌株的生長情況都優於enal菌株，說明本發明所述的AnVPl基因接種到酵母菌體內後能正常表達並是菌株顯示出耐鹽功能。實施例15
本實施例為酵母高溫脅迫對照試驗，步驟如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突變菌株enal及轉基因菌株enal-AnVPI的單克隆，酵母菌株WT和突變菌株enal接種至YPD液體培養基，轉基因菌株enal-AnVPI接種至HIS缺失的YNB液體培養基中；於30° C，200rpm進行過夜培養；
(2)次日按1:100比例擴大培養至0D_=1.2-1.5時，用滅菌水稀釋到各菌液的OD6tltl約為1.0;然後按100 μ L/管分裝至1.5ml的EP管，於53° C水浴鍋進行高溫處理2min、4min、6min、8min、IOmin ;以30° C培養的菌液做對照；
(3)將處理後的菌液於4°C冰箱冷卻3 min，做5倍梯度進行稀釋，各得到三個不同稀釋度的菌液，從各稀釋度的菌液中取3 μ L，點至YPD固體培養基，轉基因菌株enal-AnVPl設置 3 個平行樣，分別記為 enal-AnVPl-Ι、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVPl-3 ；
(4)30°C倒置培養2-3d，觀察菌斑生長情況，並照相保存，結果如圖7所示。隨著水浴時間的增加，各菌種的生長情況均逐漸變差，但在同樣的水浴時間下enal-AnVPl菌株的生長情況都優於enal菌株和WT菌株，說明本發明所述的AnVPl基因接種到酵母菌體內後能正常表達並使菌株顯示出耐高溫功能。實施例16
本實施例為酵母乾旱脅迫對照試驗，步驟如下:
(1)挑取野生型酵母菌株WT、突變菌株enal及轉基因菌株enal-AnVPl的單克隆，酵母菌株WT和突變菌株enal接種至YPD液體培養基，轉基因菌株enal-AnVPl接種至HIS缺失的YNB液體培養基中；於30° C，200rpm進行過夜培養；
(2)次日按1:100比例擴大培養至0D_=1.2-1.5時，用滅菌水稀釋到菌液的OD6tltl約為1.0 ;然後用滅菌水做5倍梯度稀釋，各得到三個不同稀釋度的菌液；
(3)從各稀釋度的菌液中取3μ L，點至分別添加O mol/L、2.0 mol/L、3.0 mol/L D-山梨醇(Sorbitolum)的YPD固體滲透脅迫培養基上，轉基因菌株enal-AnVPl設置3個平行樣，分別記為 enal-AnVPl-l、enal-AnVP1-2 和 enal-AnVP1-3 ；
(4)30°C倒置培養2-3d，觀察菌斑生長情況，並照相保存，結果如圖8所示。隨著培養基中山梨醇濃度的增加，各菌種的生長情況均逐漸變差，但在同一山梨醇濃度下enal-AnVPI菌株的生長情況都優於enal菌株和WT菌株，說明本發明所述的AnVPl基因接種到酵母菌體內後能正常表達並使菌株顯示出耐旱功能。序列表
權利要求
1.一種來源於矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，該基因具有如SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於:該基因的所述的核苷酸序列對應的胺基酸序列如SEQ ID N0.2所述。
3.依照權利要求1所述的一種來源於矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步驟: (1)總RNA的提取和純化: 採用通用的RNA提取方法和純化方法，從植物矮沙冬青葉片中提取得到純化的矮沙冬青葉片總RNA。
(2)中間片段的克隆: A、中間片段cDNA第一鏈的合成 以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，以含有接頭的3』 RACE Adaptor引物進行反轉錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板。
B、PCR擴增 以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述上遊引物jf3和下遊引物jx3，進行PCR擴增。
擴增得到矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。
(3)3，端的克隆: C、3，-outerPCR 擴增 根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3』-outer，以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3』-outer和3』端下遊引物3』 -RACE outer,進行3』端outer PCR擴增: 擴增得到的產物為cDNA 3』端。
D、3，-1nnerPCR 擴增 根據前述步驟(2)所得中間片段端序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3』-1nner，以前述步驟C所得3』端的outer PCR產物為模板，利用特異性上遊引物GSP3_3』-1nner和3』端下遊引物3』 -RACE inner，進行3』端inner PCR擴增: 擴增得到的產物為cDNA 3』端inner PCR產物，通過克隆測序，得到3』端完整序列。
(4)5』端的克隆: E、合成5』端的cDNA第一鏈: 以上述步驟(I)純化的矮沙冬青葉片總RNA作為模板，對RNA進行預處理，加入含有接頭的5』 RACE Adapter引物進行反轉錄: 合成得到反轉錄產物5』端的cDNA第一鏈。
F、5，-outerPCR 擴增 根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5』-outer，以前述步驟E所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5』-outer和5，端上遊引物5，-RACE outer，進行5，端outer PCR擴增:擴增得到的產物為cDNA 5』端。
G、5，-1nner PCR 擴增 根據前述步驟(2)所得中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5』 -1nner,以前述步驟F所得5』端的outer PCR產物為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5』 -1nner和5』端上遊引物5』 -RACE inner，進行5』端inner PCR擴增: 擴增得到的產物為cDNA 5』端inner PCR產物，通過克隆測序，得到5』端完整序列。
(5)cDNA全長序列拼接和克隆 將上述步驟(2)所得中間片段、步驟(3)所得3』端inner PCR擴增序列和步驟(4)所得5』端inner PCR擴增序列進行完整序列的拼接，得到完整的基因序列。
(6)I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆: 將上述步驟(4)合成5』端的cDNA第一鏈作為模板，根據上述步驟(5)的基因分析設計上遊引物0RF3-S和下遊引物0RF3-A，並進行PCR擴增: 擴增得到的產物為完整的矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。
4.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於:所述的步驟(I)中，採用的RNA提取方法為試劑盒法；純化方法為DNA酶消化法。
5.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於:所述的步驟(2)中進行PCR擴增時， 擴增體系為: TaqPlusPCR Master Mix 20 μ L , cDNA 模板2 μ L , 2X 引物:jf3/jx3I UL , ddH2016 μ L o I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增程序分別可優選為:95°C,3min ；95°C, 30 s，58 °C, 30 s,72°C, I min ;35 個循環； 72°C，8 min ;4°C保溫。
6.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於:所述的步驟(3)中進行3』-outerPCR擴增時， 擴增體系可優選為: IXcDNA Dilution Buffer II8 yL , cDNA 模板2 μ L , 2X 引物:GSP3-3，-outer/3，-RACE-outerI yL , 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L ， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 μ L , ddH2028.75 μ L。
擴增程序可優選為:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s ;35 個循環;72°C，8 min ;4°C保溫。
7.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於:所述的步驟(3)中進行3』-1nnerPCR擴增時，擴增體系可優選為:dNTP Mixture (2.5 mM each)8 μ L , 3，-outer PCR 產物2 μ L， 2X 引物:GSP3-3，-1nner/3，-RACE-1nnerI yL , IOXLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)4 yL , MgCl2 (25 mM)3 μ L， TaKaRa LA Taq (5 U/μ I)0.25 yL , ddH2028.75 μ L。
擴增程序可優選為:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；55°C,30 s ；72°C, I min 30 s ;35 個循環;72°C，8 min ;4°C保溫。
8.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於:所述的步驟(4)中進行5』-outerPCR擴增時，擴增體系可優選為:cDNA 模板IyL,IOX PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , 2X 引物:GSP3-5，-outer/5，-RACE outer2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L ,ddH2034.75 μ L。
擴增程序可優選為:95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 個循環;72°C，8 min ;12°C保溫。
9.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於:所述的步驟(4)中進行5』-1nnerPCR擴增時，擴增體系可優選為: .5，-outer PCR 產物I μ L， .10Χ PCR Buffer5 μ L , dNTP Mix4 μ L , .2X 引物:GSP3-5，-1nner/5，-RACE inner2 yL , ThermostabLe DNA poLymerase (0.25 μ L of 5U/μ L)1.25 μ L , ddH2034.7 5 μ L。
擴增程序可優選為:.95。。，3 min ；95°C, 30 s ；60°C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 個循環;72。。，8 min，12°C保溫。
10.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於:所述的步驟(6)中進行PCR擴增時，擴增體系可優選為:dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μ L ,2X 引物:ORF3-S/ORF3-AI yL ,cDNA 模板I μ L ,5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+ plus)10 μ L ,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2.5 U/μ L)0.5 μ L ,ddH2032.5 μ L。I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增程序可優選為:98°C, 30 s ；62° C,30 s ；72°C,2 min 30 s ;35 個循環。
全文摘要
本發明公開了一種來源於矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該基因具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。上述基因編碼的I型液泡膜焦磷酸酶具有如SEQIDNO.2所述的胺基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本發明還公開了一種上述來源於矮沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法。
文檔編號C12N15/55GK103146722SQ20131010023
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月26日 優先權日2012年5月15日
發明者李晚忱, 雍太明, 付鳳玲, 劉豔萍, 於好強, 鄧龍群, 佘躍輝, 周樹峰 申請人:四川農業大學