用作間充質骨骼祖細胞標記物的成纖維細胞生長因子受體3的製作方法
2023-07-20 04:30:46
專利名稱：用作間充質骨骼祖細胞標記物的成纖維細胞生長因子受體3的製作方法
技術領域：
本發明涉及鑑定間充質骨骼祖細胞的方法，它是通過鑑別在細胞表面上有成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor3，FGFR3)為特徵的細胞而加以鑑定的。
本發明還涉及通過採用FGFR3-結合劑而獲得間充質骨骼祖細胞的方法。本發明還涉及基本上為純間充質骨骼祖細胞的培養物，以及含有該間充質骨骼祖細胞的藥物組合物和植人物。
另一方面，本發明涉及鑑定軟骨-骨瘤(cartilage-bony tumor)的方法，以及治療軟骨-骨瘤的藥物組合物。
背景技術：
骨骼生長既依賴於組織細胞組份-軟骨細胞和長骨的軟骨生長中心的細胞膜受體二者發揮正常的功能，還依賴於循環的和局部的激素及生長因子的常態和濃度水平。因此，生長失調被劃分為截然不同的兩類(a)循環因子的失調，和(b)靶軟骨組織的失調。
正常的分化過程是從間充質幹細胞開始的，這些幹細胞分化成骨骼祖細胞，後者或者分化成前軟骨幹細胞(它最終形成軟骨)，或者分化成前成骨幹細胞(它最終形成骨頭)。
要追蹤間充質幹細胞支持的生長以及它們在正常人和患生長疾病的家族中的遷移情況是有難度的，其中包括缺少用於這些特異間充質幹細胞的合適標記物。例如，已有零星的和不完整的、關於生長板幹細胞的最初位置和遷移路徑的信息，它支持縱向的和橫向的生長。在一百多年來長期爭論的問題即「Ranvier對La Cro2ix之爭」仍然懸而未決。1889年，Ranvier聲稱「形成骨膜骨的細胞來自生長板的細胞」，而1951年LaCroix宣稱「並置式(appositional)生長由軟骨膜外周的細胞造成」。Ranvier的理論在70年代早期得到了 Rigal，Hert，J.(Acta Anat(Bazel)82420-436(1972))和其他學者的支持，而在90年代得到了Langenskiold等人(Acta.Orthop.Scand.，64683-687(1993))的支持，他們表明來自胚層的細胞遷移到骨溝的邊界處，作為縱向和橫向骨生長的源頭。
然而，對各種類型的軟骨細胞和影響間充質分化的因子的充分了解卻受到了阻礙，因為不能確定這些細胞的初級儲存體的最初位置，因而受到了體外細胞培養的限制。一個困難是缺少特異性的表型標記物來跟蹤相繼的分化事件。II型膠原的分泌被認為是軟骨細胞分化主要的早期標記，而鹼性磷酸酶的合成是成骨細胞分化的早期標記。成熟的成骨細胞也產生骨橋蛋白、骨粘連蛋白和骨鈣蛋白，這3種細胞外的基質蛋白與I型膠原一起沉積在礦化的骨基質上。不幸的是，僅鑑別出少量的分化標記物，而且其中某些標記物如鹼性磷酸酶、骨橋蛋白和骨粘連蛋白等對於成骨分化並不特異，而且另一些標記物如骨鈣蛋白很少在體外表達。此外，間充質細胞系和分化的軟骨細胞和成骨細胞的初級培養物，會表現出不同的表型而且常常是處於不同分化階段的各種細胞類型的混合物(Eriebacher，A.等人，細胞(Cell)80371-378，(1995)；Yamaguchi，T.P.和Rossant，J.，Currentopinion in Genetics and Development 5485-491(1995))。
因此，特別需要開發一種能夠精確地確定對縱向和橫向生長以及骨修復有支持和貢獻的幹細胞位置和來源的標記物，以便可以更好地了解正常狀態和病理狀態下間充質發育的機制，以及獲得有治療用途的基本純的間充質骨骼祖細胞培養物。
發明概述本發明基於一個出人意料的發現成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)可作為間充質骨骼祖細胞的標記物。本發明還基於這樣一個出人意料的發現，即間充質骨骼祖細胞的解剖位置是在La Croix溝的軟骨膜中。
在下文中用術語「間充質骨骼祖細胞」表示下列類型的細胞(a)能夠分化成骨骼祖細胞的間充質幹細胞，(b)骨骼祖細胞，(c)前軟骨幹細胞，和(d)前成骨幹細胞，或2種或多種上述細胞類型的混合物。間充質骨骼祖細胞都具有對骨和/或軟骨的生長作出貢獻的特性，與其他類型的軟骨或骨衍生細胞相比顯示出增強的增殖性，而且在適當的趨化劑如成纖維細胞生長因子9存在下還會有遷移的傾向。
這些間充質骨骼祖細胞，在胚胎和新生兒早期，支持關節軟骨和長骨生長部生長板軟骨的生長。然而，在一生中很早的時候(出生後幾個月)，這些幹細胞與關節區域的聯繫便沒有了，導致關節軟骨的自我損傷癒合性差。這些間充質骨骼祖細胞繼續維持長骨縱向和緯向(橫向)生長的細胞來源，直至長骨生長部關閉(在18-22歲時)，而且繼續提供骨膜的幹細胞儲藏庫(與整個一生的骨折骨痂有關)。在成年人中，尤其是在高齡中，跟蹤未分化的、可能形成增殖的軟骨細胞的細胞源的技術早先已經失敗，因為這種細胞源的稀少而且不能勝任作為這種未分化細胞的標記物。
通過使用作為本發明基礎的發現，即FGFR3是間充質骨骼祖細胞的標記物，有可能開發出鑑定間充質骨骼祖細胞的方法，就是通過鑑定表面上存在FGFR3這一特徵的細胞。這一方法對於追蹤間充質骨骼祖細胞至關重要，比如為了更好地了解與FGFR3受體有關的生長停止的病理狀況，例如導致遺傳性侏儒-軟骨發育不全症、在多發性遺傳外生骨疣中持續表達，和在原發性骨關節炎骨贅中的再表達。
因此，本發明提供了一種鑑定間充質骨骼祖細胞的方法，它包括(a)在會發生配體-受體結合的條件下，將成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)結合劑施用於被分析的細胞或組織上；(b)確定那些細胞與該FGFR3結合劑發生了結合，該細胞就是間充質骨骼祖細胞。
FGFR3結合劑可以是抗體或成纖維細胞生長因子9(FGF9)，它應被標記然後施用於被分析的組織，例如施用於關節組織。被標記的那些區域可作為間充質骨骼祖細胞來源。
較佳地，間充質骨骼祖細胞的來源是La Croix區域中的軟骨膜，而且該區域與滑膜和骨膜接觸。
本發明方法可出於各種目的，用於在不同組織中(如關節中)，鑑別和確定間充質骨骼祖細胞的位置，例如為了獲得間充質骨骼祖細胞的培養物，在體外使它們繼續增殖然後再返回體內以刺激軟骨和骨頭的生長。或者，鑑定出這些細胞便可以將它們從組織部位中去除，以便消除這些幹細胞在各種疾病和失調(這些病的特徵是未分化的間充質骨骼祖細胞過度活躍)中的過度活躍。此外，通過確定攜帶FGFR3的細胞的區域，可以在原位對這些細胞進行操作，如通過向這些細胞的精確位置處施用各種調節劑。這樣的試劑可以是穩定FGFR3從而維持這些細胞更長時間地處於未分化的增殖狀態的試劑，一個例子是FGF9。或者，這樣的試劑可以是使攜帶FGFR3的細胞提早分化，一個例子是FGF9拮抗劑。
通過利用FGFR3是間充質骨骼祖細胞的標記物這一事實，可以第一次從非胚胎材料獲得基本純的這些細胞的培養物。根據本發明方法，通過將FGFR3用作標記物，已發現間充質骨骼祖細胞被定位於生長板外周的軟骨膜環(La Croix區域)中。在一生後期關節軟骨的自我損傷癒合性差可以下列原因為基礎進行解釋在生長停止時，這些關節區便與其潛在的、位於軟骨膜La Croix區域的幹細胞來源失去了聯繫。
因此，本發明不僅能夠確定間充質骨骼祖細胞的位置，而且還能第一次獲得這些細胞基本純的大量培養物。術語「基本純的培養物」指培養物基本上由上述定義的術語「間充質骨骼祖細胞」所包括的4種細胞類型中的一種或多種細胞構成。
因此，本發明涉及一種從不同來源獲得大量間充質骨骼祖細胞的方法，這在下面進行闡述。通過使用對FGFR3特異的抗體，或使用該受體的特異配體如FGF9配體，可鑑定間充質骨骼祖細胞，並將其與來源中其他細胞相分離。
一種獲得基本純的間充質骨骼祖細胞培養物的方法，它包括(c)將FGFR3結合劑使用於含間充質骨骼祖細胞的細胞源中；和(d)從該細胞源中僅分離出與FGFR3結合的細胞，這些細胞構成基本純的間充質骨骼祖細胞的培養物。
分離可以用手術進行，如用手術刀將那些結合於標記的FGFR3結合劑的區域取下；也可用各種細胞分離系統進行，這些細胞分離系統能夠將具有特定標記(FGFR3結合劑)的各細胞從來源中的非標記的細胞群分離開。
用於獲得間充質骨骼祖細胞的合適來源是來自關節鏡或骨髓活體檢查的自身來源。活體檢查來源可以是非增殖性的軟骨細胞或去分化的成纖維細胞樣細胞。細胞來源還可從軟骨膜、滑膜或骨膜區域或這些區域接觸的位置處獲得。只有通過使用特異性的標記物，才有可能將間充質骨骼祖細胞從這些來源中分離出來，因為在組織中這些細胞很少。另外，細胞來源也可以是來自胚胎。
從這些來源中獲得的間充質骨骼祖細胞可被誘導，從而在適當的生長因子和肝素存在下在活體外進行增殖，然後再輸送回體內。或者是以適合維持軟骨細胞活力的介質中的藥物組合物形式；或者是以植入物的形式被引入到所需的部位，其中間充質骨骼祖細胞處於允許生長的膠質環境中。較佳地，藥物組合物和植人物都含有合適的成纖維細胞生長因子，尤其是成纖維細胞生長因子9，以便刺激這些間充質骨骼祖細胞上的FGFR3的活性。
本發明的藥物組合物或植人物可用於有缺陷的關節軟骨的修復和再生，用於治療軟骨發育不全症病人，用於治療患其他生長障礙疾病的病人和用於治療預計軟骨和骨生長速率差的物理性損傷(physical injuries)。本發明的藥物組合物或植人物可用作調控生長板內生長速度的調控手段，以便提高生長速度和/或防止過早的分化；或者用於直接注射到細脊椎的髓核中，以便改善脊椎受傷的癒合情況。如果需要，可在活體外通過分子工程方法對自身的間充質骨骼祖細胞進行改變，以便在引入所需部位之前具有所需的表達特性。遺傳操作的例子有，對野生型FGFR3的過度表達進行操作以便替換突變的缺陷受體；或者對顯性負突變型FGFR3的表達進行操作，以便抑制野生型受體的活性(例如在各種類型的腫瘤病例中)，以及類似的操作。
事實上，本發明方法包括將間充質骨骼祖細胞包埋在粘滯的、允許生長的環境中，通常以透明質酸為基礎，從而形成複合的半固態的植入物。將植人物轉移至靶定的生長部位例如關節受損傷的部位。或者通過打開關節手術，或者通過關節鏡設備，將植人物注入受傷的管腔直至關節表面。然後通過噴射設備形成薄的滲透膜，從而封閉缺陷並保證固定和維持植人物處於可靠位置。
另一方面，本發明基於這樣的發現，即FGFR3也存在於軟骨-骨瘤上，例如良性瘤(如外生骨疣和骨贅)，因此FGFR3既可以作為存在這種腫瘤的指示物，還可以作為精確定位這些腫瘤的標記物。因此，本發明還包括在組織或樣品中檢測軟骨-骨瘤的方法，它包括(i)將測試組織或樣品與FGFR3結合劑接觸；(ii)檢測是否存在與FGFR3結合劑結合的細胞，陽性檢測結果表明在測試的組織或樣品中存在軟骨-骨瘤。
檢測可用合適的針對FGFR3的標記抗體，或用對FGFR3特異的標記配體如FGF9。將該標記的FGFR3結合劑在體內施用於組織，不僅能夠確定在該組織中是否存在腫瘤，而且還可精確地確定腫瘤的位置，這對於手術切除是有幫助的。
FGFR3存在於軟骨-骨瘤細胞這一事實，還可用於將細胞毒性劑特異性地導向腫瘤部位，即通過將合適的細胞毒性分子連於對FGFR3特異的受體如FGF9或對FGF9特異的抗體上。因此，本發明還涉及治療軟骨-骨瘤的藥物組合物，它包括連於細胞毒性分子的FGFR3結合劑；還涉及治療這種腫瘤的方法，即通過將治療有效量的連於細胞毒性分子的FGFR3施用於治療對象。
細胞毒試劑在本領域是眾所周知的，而且該術語在本發明的上下文中指任何能夠摧毀軟骨衍生或骨衍生腫瘤細胞的試劑。這種試劑的例子有例如氨甲蝶呤、阿黴素(doxombicin)、環磷醯胺等。
還可以通過誘導攜帶FGFR3的細胞發生分化而治療腫瘤。這可通過向被FGFR3結合劑標記的區域，引入FGFR3分化誘導劑而進行治療。分化誘導劑的例子是FGF9拮抗劑或針對FGF9的抗體。
還可以將可削弱野生型FGFR3活性的顯性負探測劑(detective)FGFR3(如通過遺傳工程)引入腫瘤而進行治療。
在下面，結合一些不起限定作用的附圖和實施例來闡述本發明。
附圖的詳細描述
圖1-用針對FGFR3的抗體對豚鼠骨骺切片的組織染色結果。顯微照片1-5為通過年輕豚鼠骨骺的切片。
1.用Masson′s三色組織染色劑染色的前後向切片(放大6倍)，該染色劑是對結締組織成分如膠原和原聚糖(protoglycan)的特異染色劑。
2.用針對FGFR3的抗體進行免疫組織化學染色的前後向切片(放大400倍)。3，45，軸向切片。
3.對抗體劑FGFR3進行的免疫組織化學染色(放大100倍)；4.Masson′s三色染劑(放大25倍)；和5.對抗體劑FGFR3進行的免疫組織化學染色(放大400倍)。
圖2由顯微照片6-11構成，它們是17天大的雞胚胎長骨骨骺的前後向切片。
顯微照片6、1011是採用針對FGFR3的抗體的免疫組織化學染色法染色，而顯微照片8是用對原聚糖特異的Alcian藍pH 2.5染色的(注意在某些區域沒有被染色)。
這些顯微照片的放大倍數如下6(25倍)；7(40倍)；9(100倍)；10(40倍)；和11(100倍)。
7和9用Masson′s三色染劑染色。
圖3顯示了年輕大鼠的股骨生長情況，其中在長骨生長部周圍的軟骨膜(prechondrian)環被去除(STRIP)；在軟骨膜被暴露但是沒有去除的大鼠中股骨的生長情況；以及在沒有經過任何手術的大鼠(CNTL)中股骨的生長情況。
圖4顯示了從關節軟骨、骨骺、長骨生長部和軟骨膜獲得的細胞，在體外生長至形成細胞集落時的天數。
發明詳述材料和方法(a)初級軟骨細胞培養物從11天大的小雞胚胎中獲得長骨(股骨和脛骨)的骨骺。在解剖之後，組織塊在Tyrod′s溶液中用胰蛋白酶進行處理，然後進行機械打碎，直至獲得游離細胞的懸浮液。然後細胞被高濃度(5×106)地進行平板培養。
(b)初級軟骨細胞培養物的PCR篩選當達到匯合時，收集細胞並用RNA純化試劑盒(三試劑)(Molecular ResearchCenter，Cincinnati，Ohio)進行裂解。細胞的RNA用苯酚進行抽提，用異丙醇進行沉澱，然後再懸浮於水中，通過測量光密度進行定量分析。在獲得純淨的RNA(O.D.260/280nm＞1.5)後，用反轉錄酶反應製備cDNA，然後篩選是否有成纖維細胞生長因子(FGF)。使用聚合酶鏈反應(PCR)技術，採用針對FGFR3和FGF9的寡核苷酸引物對。變性是在94℃，退火是在52-65℃，延伸是在72℃進行，重複35個循環。
(c)FGF9的放射標記如前製備重組的小鼠FGF9(Hecht，D.等人,Growth factors 12，223-233(1995))，通過氯胺T法用Na125I(0.5mCi)進行標記，然後在肝素-瓊脂糖凝膠柱與游離的碘分開。比活性的範圍為0,5-2×105cpm/ng。
(d)免疫組織化學法脫鈣的骨頭在用福馬林和苦味酸固定之後，將其包埋在液態石蠟中。對石蠟塊進行切割和製備，以用於採用標準方案的免疫組織化學分析。對載玻片進行染色，其中抗-FGFR3抗體的效價逐漸上升。
(e)原位雜交用35S標記的尿苷，從重組的含有FGF9和FGFR3的質粒(Bluescript-Stratagen)中製得T7(反義探針)和T3(有義探針)。大小為懷孕後10.5天至18.5天的小鼠胚胎，在聚甲醛中固定，在濃度逐漸上升的乙醇中脫水，然後包埋在液態石蠟中。切割和製備切片，然後用標準方法與適當的RNA探針進行雜交。
實施例1用針對FGFR3的抗體進行的組織化學染色如圖1所示，被針對FGFR3的抗體染色的區域並不對應於被Masson′s三色染劑(它是公認的軟骨染色劑)所染色的區域。這些發現表明，具有FGFR3的細胞並不位於軟骨本身，而是在名為La Croix溝的這一區域的軟骨膜中。
實施例2年輕大鼠的La Croix環的剝離在3個組中每個組有10隻大鼠。組1作為對照組(CNTL)。大鼠被麻醉但是不進行任何手術。組2(SHAM)作為假手術組，它們被麻醉並切開軟組織暴露出軟骨膜。組3(STRIP)在環放大(loop magnification)條件下(這樣可僅切割軟組織而不對長骨生長部本身造成損傷)，剝離了長骨生長部周圍的軟骨膜環。在4周後，測量大鼠的平均股骨長度，結果示於圖3。手術的反側肢體的長度與對照肢體的長度相當(數據未標出)。假手術的肢體表現出肢體長度增加的趨勢，這種趨勢還未達到統計學的顯著狀態。被剝離後的肢體顯示出肢體生長的停止。這些結果表明，將被FGFR3-抗體染色的區域去除後會導致肢體長度的停滯，這表明這些區域與正常的生長有關。
實施例3從La Croix環獲得的細胞在體外生長從上述大鼠中取出的La Croix區域的軟骨膜組織，被置於培養皿中合適的生長培養基中，並測定形成集落所需的時間。與之對比，將從遠端股骨的不同部位(關節軟骨、骨骺(骨)、長骨生長部)獲得的組織在相同的條件下進行培養，也測定形成集落所需的時間。
如圖4所示，從軟骨膜取出的組織能快速地形成細胞集落(在培養約3天後)，而從其他區域取出的組織僅在植入起10多天後才形成培養物。這些結果再次表明，從被FGFR3-抗體染色的區域獲得的細胞，比從沒有FGFR3特徵的骨頭其他區域獲得的細胞生長得更快。
實施例4在外生骨疣中存在FGFR3將針對FGFR3的抗體施用於從外生骨疣良性瘤獲得的組織上。抗體染色了纖維變性組織的細胞，而基本上沒有染色軟骨細胞(數據未給出)。這些發現表明，FGFR3存在於軟骨-骨衍生的良性瘤(外生骨疣)上，從而可以使用FGFR3結合劑(如抗體)來鑑定這些腫瘤以及將細胞毒試劑導向這些腫瘤。該發現還導致可用造成FGFR3消失並因而導致分化的試劑(如FGF9拮抗劑)來治療這些腫瘤。
權利要求
1.一種鑑定間充質骨骼祖細胞的方法，其特徵在於，它包括(a)在會發生配體-受體結合的條件下，將成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)結合劑施用於被分析的細胞或組織上；(b)確定那些細胞與該FGFR3結合劑發生了結合，這些細胞就是間充質骨骼祖細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該FGFR3-結合劑是對FGFR3特異的抗體。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，該FGFR3-結合劑是成纖維細胞生長因子9(FGF9)。
4.一種獲得基本純的間充質骨骼祖細胞培養物的方法，其特徵在於，它包括(a)將FGFR3結合劑使用於含間充質骨骼祖細胞的細胞源中；和(b)從該細胞源中分離出與FGFR3結合的細胞，這些細胞構成基本純的間充質骨骼祖細胞的培養物。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，該細胞源是自身非增殖的軟骨細胞，去分化的成纖維細胞樣細胞，從軟骨膜、滑膜或骨膜獲得的細胞，或者該細胞源來自胚胎。
6.一種基本純的間充質骨骼祖細胞培養物。
7.用權利要求5所述方法獲得的間充質骨骼祖細胞。
8.一種用於修復骨和軟骨的藥物組合物，其特徵在於，它含有適用於維持軟骨細胞活力的介質和權利要求6或7所述的間充質骨骼祖細胞。
9.如權利要求8所述的藥物組合物，其特徵在於，它還含有FGF家族的成員。
10.如權利要求9所述的藥物組合物，其特徵在於，它含有FGF9。
11.一種適用於骨或軟骨植入的植人物，其特徵在於，它包括允許生長的膠質環境和權利要求6或7所述的間充質骨骼祖細胞。
12.如權利要求9所述的植人物，其特徵在於，還含有FGF家族的成員。
13.如權利要求12所述的植入物，其特徵在於，含有FGF9。
14.一種治療軟骨發育不全症病人、患其他生長障礙疾病的病人和預計軟骨和骨生長前景差的長骨生長部損傷(physeal injuries)的方法，其特徵在於，在需要生長或修復的部位分別施用或植人權利要求6-8所述的藥物組合物或權利要求9或10所述的植人物。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，被施用的細胞是自身的。
16.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，這些細胞是異體的。
17.一種在組織或樣品中檢測軟骨-骨瘤的方法，其特徵在於，它包括(i)將受檢組織或樣品與FGFR3結合劑接觸；(ii)檢測是否存在與FGFR3結合劑結合的細胞，陽性檢測結果表明在受檢組織或樣品中存在軟骨-骨瘤。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，該軟骨-骨瘤是選自下組的良性腫瘤外生骨疣和骨贅。
19.一種治療軟骨-骨瘤的藥物組合物，其特徵在於，它包含藥學上可接受的載體和作為活性成分的連於細胞毒性分子的FGFR3結合劑。
20.如權利要求19所述的藥物組合物，其特徵在於，該FGFR3結合劑是FGF9。
21.如權利要求19所述的藥物組合物，其特徵在於，該FGFR3結合劑是針對FGFR3的抗體。
22.一種特異性地摧毀軟骨-骨瘤的方法，其特徵在於，它包括給需要這種治療的對象施用治療有效量的偶聯於細胞毒性分子的FGFR結合劑。
23.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，該FGFR3結合劑是FGF9。
24.如權利要求22所述的方法，其特徵在於，該FGFR3結合劑是針對FGFR3的抗體。
全文摘要
本發明涉及作為間充質骨骼祖細胞的新標記物的成纖維細胞生長因子受體3(FGFR3)。通過使用該新標記物,可以在組織中鑑定間充質骨骼祖細胞並加以定位,還可獲得這些細胞基本純的培養物。可以在藥物組合物或植入物中將間充質骨骼祖細胞的純培養物(可任選地在活體外進行各種操作)用作活性成分,以用於骨和/或軟骨的修復。FGFR3還可用作鑑定和定位軟骨衍生和骨衍生腫瘤的標記物。能夠與FGFR3結合的試劑還可用於將細胞毒試劑導向軟骨衍生和骨衍生的腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK1195982SQ96194719
公開日1998年10月14日 申請日期1996年6月12日 優先權日1995年6月12日
發明者A·雅因, Z·內佛 申請人:依達研究發展有限公司, 拉莫特大學應用研究及工業發展有限公司