在微生物中生產重組蛋白質的方法

2023-07-20 11:14:26

專利名稱：在微生物中生產重組蛋白質的方法
技術領域：
本發明涉及在微生物中生產重組蛋白質的方法。更具體地，本發明涉及在微生物中生產重組功能性纖溶酶原的方法和鑑定纖溶酶原激活劑的方法。
背景技術：
人體纖維蛋白溶解體系包含了一個核心成分—血纖維蛋白溶解酶(Pm，以下簡稱纖溶酶)。纖溶酶一方面可以降解纖維蛋白，另一方面可以激活基質金屬蛋白酶(MMPs)和生長因子，而激活基質金屬蛋白酶(MMPs)和生長因子在細胞外基質的降解和傷口癒合中共同發揮作用。
纖溶酶來源於它的前體分子—血纖維蛋白溶解酶原(以下簡稱纖溶酶原)。迄今為止，己知纖溶酶原的兩種生理性激活劑(也被稱為纖溶酶原激活劑，PA)。它們是組織型纖溶酶原激活劑(組織型PA，t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(尿激酶型PA，u-PA)。此外，這套系統通過一套蛋白酶抑制劑如α2-抗纖溶酶進行調節。纖溶酶原和纖溶酶具有非常重要的生物學功能，這兩種生物學功能分別與兩種不同的激活劑直接相關。
所謂的t-PA介導的途徑，負責調節體內纖維蛋白的動態平衡，而u-PA介導的途徑在細胞移動和組織重塑方面作用突出。這一功能在當u-PA缺陷型小鼠罹患慢性、不癒合性創傷時，表現得尤為突出。纖溶酶原、t-PA和u-PA基因分別失活的小鼠會出現同樣的病情。此外，特別是由於血栓形成和器官衰竭，實驗動物的壽命明顯縮短。關於纖溶酶原/纖溶酶系統的概述，已在Desire Collen出版的書中有所描述(《血栓形成和止血(Thrombosis and Haemostasis)》，82，1999(1))。
纖溶酶療法適用於心臟病發作或中風患者的治療，在這種情況下，快速溶解纖維蛋白凝塊是存活所必需的，因此，所述纖溶酶療法是除了使用纖溶酶原激活劑治療患者之外的另一種方式，而纖溶酶原激活劑僅間接地促成了纖維蛋白凝塊的水解。
上述提及的小鼠疾病模型，顯示了纖溶酶還是一種潛在的治療藥物，用來治療不癒合性創傷或僅僅癒合慢的創傷。
通常t-PA激活纖溶酶原只出現在纖維蛋白存在的情況下，即血液級聯凝結完成之後。在缺乏底物的情況下，纖溶酶總是立即被α2-抗纖溶酶抑制。公認當纖溶酶結合到纖維蛋白上，並由此能激活纖維蛋白凝塊溶解時，這種抑制作用明顯減弱。
由於在心臟病發作或中風病例中，溶解血栓通常是病人存活所必需的，因此治療中使用了不同的纖溶酶原激活方案。例如，注射鏈激酶使血管快速再通。因此，鏈激酶激活纖溶酶原，不是建立在蛋白水解活化的基礎上，而是形成了複合物，然後，此複合物激活其它的纖溶酶原分子而使其轉變為纖溶酶，所述鏈激酶是一種細菌蛋白。
對尿激酶治療應用的進一步研究認為，如同鏈激酶一樣，尿激酶在分子水平上不能區分結合到纖維蛋白上的纖溶酶原和游離的纖溶酶原。因此，開發了重組人t-PA，在臨床研究中，已經證實重組人t-PA作用優於鏈激酶。但是，這種診斷學上的發現未能被其它研究證實。
利用分子遺傳學的方法建立的生產體系在生產現代治療中使用的重組蛋白中具有重要作用，而重組產生的諸如rt-PA(及其不同的衍生物)等的纖溶酶原激活劑、重組單鏈尿激酶-PA和重組葡萄球菌激酶又恰好突出顯示了所述生產體系的重要性。
纖溶酶原是纖維蛋白溶解酶的前體分子。已經在科學文獻中發表了人纖溶酶原的cDNA(Malinowski等，Biochemistry，23，1984(12)；Forsgren等，FEBS Lett.213，1987(2))和包含非編碼內含子的基因(Petersen等，J.Biol.Chem.，265，1990(3))。
人纖溶酶原(hPg)是作為絲氨酸蛋白酶的纖溶酶的酶原，其是由791個胺基酸的多肽鏈組成的糖蛋白，分子量為92,000，理論等電點為7.1，糖基化比例為2％(Collen，1999，(1))。在肝臟內生成纖溶酶原，血漿濃度大約為200mg/l[1.5-2μM(微摩爾每升)]。
此分子分為7個結構域，包括N末端的前激活肽(Glu-1～Lys-77)，部分同源的五個環餅結構域(Kringle domain)和具有催化活性的蛋白酶結構域(Val-562～Asn-791；Collen，1999(1))。催化性三聯體結構與所有的絲氨酸蛋白酶的結構一致，都由以下胺基酸構成His-603、Asp-646和Ser-741。環餅結構域1是纖溶酶原結合纖維蛋白的識別序列(Petersen等，1990(3))，也是纖溶酶原與不同的細胞表面受體結合的識別序列。
在翻譯後修飾中，兩個必需的糖基化位點Asn-289和Thr-346都位於環餅結構域3中，其對於纖溶酶原的功能尤為重要(具有分別被不同蛋白酶和鏈激酶激活的能力，還具有受體結合特性)。根據所述的修飾，區分兩種主要形式的纖溶酶原—纖溶酶原I具有上述糖基化特性—纖溶酶原II缺少Asn-289糖基化修飾。
另一個糖基化位點是胺基酸Ser-248。胺基酸Ser-578可以以磷酸化形式存在。
在生物體內，纖溶酶原經胺基酸Arg-561和Val-562之間的蛋白水解切斷而活化。隨後，另一蛋白水解酶水解激活作用發生在Lys-77和Lys-78之間，形成Lys-78-hPg。或者在Glu-Pg中，所述化學鍵還可最先直接被水解掉。活化的纖溶酶Lys-78-hPm皆由二硫鍵連接。因此，hPm(1/78-561)的重鏈負責與底物相互作用，所述底物如纖維蛋白原和纖維蛋白。來源於C末端的輕鏈(562-791)是具有催化活性的亞單位。
從文獻中已知，在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中重組生產纖溶酶原的纖維蛋白結合結構域的方法，其產量為17mg/l(Duman等，Biotechnol Appl Biochem.28；39-45，1998(4))。作者可證實這個結構域(環餅1-4)的糖基化位點。另一引文描述了人纖溶酶原的環餅4和5這兩個結構域的生產(Guan等，Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，17，2001(5))。該工作的目的是，鑑定能夠抑制內皮細胞生長的結構域。
然而，由上述兩個工作小組在巴斯德畢赤酵母中重組生產的纖溶酶原結構域，均不含有對生理功能具有決定性意義的催化結構域。
Gonzalez-Gronow等人(Biochimica et Biophysica Acta，1039，1990(6))相互比較了重組人纖溶酶原在大腸桿菌(Escherichia coli)和COS細胞(一種猿腎細胞系)中的表達。在大腸桿菌中的微生物生產是失敗的，作者把其歸咎於糖基化不充分。可以成功產生肽鏈，然而其是一種不能被激活的形式，即用激活劑(尿激酶和t-PA)處理後，不能產生活化的纖溶酶。
蛋白質缺乏糖基化，將會導致與活化能力相關的重要生理功能缺陷(沒有檢測到酶活性)，以及與內皮細胞識別相關的重要生理功能缺陷(Gonzalez-Gronow等，Biochimica et Biophysica Acta，1039，1990(6))。此外，用碳水化合物進行翻譯後修飾，對蛋白質在哺乳動物血液中的半壽期有顯著影響。
然而，該作者在COS細胞中生產出了功能性纖溶酶原。其他作者描述了在昆蟲細胞中的功能性表達(Whitefleet-Smith等，Arch.Biochem.Biophys.，271，1989(7))。然而，在使用哺乳動物細胞和昆蟲細胞時，具有下列缺點浪費時間、培養條件耗費大量成本以及得到的蛋白產量低。此外，在哺乳動物細胞中，由於要在細胞內表達蛋白，而細胞質中含有蛋白酶，所以不適於生產更多量的酶原[Nilsen和Castellino，蛋白質的表達與純化(Protein Expression and Purification)，16，1999(8)；Busby等，J.Biol.Chem.，266，1991(9)]。通常在杆狀病毒(baculovirus)/鱗翅目(lepidopteran)(昆蟲細胞)系統中，此系統的表達產量為3-10mg/ml。
在公開號為WO0250290的專利申請中，公開了在酵母中重組生產功能性小纖溶酶原(mini-plasminogen)和微纖溶酶原(micro-plasminogen)的方法。為此，作者在作為宿主生物體的巴斯德畢赤酵母中，表達了含有環餅結構域的催化結構域基因(小纖溶酶原)或不含環餅結構域的人纖溶酶原(微纖溶酶原)。隨後分別純化這樣重組產生的小纖溶酶原和微纖溶酶原，並分別加工成小纖溶酶和微纖溶酶，並通過動物實驗證明了它們的活性。據稱對於小纖溶酶原，重組蛋白的產量為100mg/l；對於微纖溶酶原，重組蛋白的產量為3mg/l。然而使重組蛋白產物的表達量更高是更為困難的，這在公開號為WO0250290的專利申請中得到了證實，在所述專利申請中，小纖溶酶原和微纖溶酶原的產量明顯下降了2個數量級。未提及任何表達長片段纖溶酶原變異體的實施方案的例子，所述長片段纖溶酶原變異體如賴氨酸纖溶酶原(Lys-plasminogen)或穀氨酸纖溶酶原(Glu-plasminogen)。
在微生物中重組生產功能性纖溶酶原的方法尚未公開到本領域技術人員能夠實施的程度。

發明內容
因此，本發明的目的在於以低廉的方法生產功能性人纖溶酶原，並進一步使其加工成為具有催化活性的纖溶酶。
如權利要求1所述，在微生物中重組生產纖溶酶原的方法完成了所述目的。在獨立權利要求中提及了更多的解決方法。從屬權利要求反映了優選的實施方案。
令人驚奇的發現是，在微生物中生產重組功能性穀氨酸纖溶酶原或賴氨酸纖溶酶原是可能的。在此基礎上進一步研究表明，重組微纖溶酶原、小纖溶酶原、賴氨酸纖溶酶原和穀氨酸纖溶酶原可以達到意想不到的高表達量。
本發明的主題是採用分子遺傳學方法，在表達載體中克隆纖溶酶原基因，所述纖溶酶原基因優選為微纖溶酶原和小纖溶酶原基因，更優選為穀氨酸纖溶酶原或賴氨酸纖溶酶原基因，或前述基因的每種功能變異體；和重組產生功能性纖溶酶原，優選為功能性人纖溶酶原。此外，本發明描述了一種蛋白酶的鑑定方法，所述蛋白酶催化纖溶酶原轉變為纖溶酶。利用本發明分別生產出的纖溶酶原和纖溶酶，不會被動物蛋白或病毒所汙染，所述汙染通常出現在從人、牛和其它哺乳動物進行分離的過程中，並會導致患者的不良反應。
本發明的特徵在於一種生產重組蛋白的方法，該方法至少包括以下步驟a)將至少編碼纖溶酶原肽段的功能部分的核酸序列與至少編碼一段信號肽的核酸序列融合，為切割信號肽，所述編碼功能性纖溶酶原肽段的核酸序列和至少編碼信號肽的核酸序列由蛋白酶的酶切位點密碼子偶聯。重組生產系統越來越多地生產治療性蛋白產物。由於成本因素，要力爭在微生物中，特別是細菌體內生產這種重組產物。所述系統具有以下優勢除了產物價格相對低廉外，蛋白產量可以達到g/l級，並且重組蛋白不會被汙染，該汙染是指對患者有害的病毒或像朊病毒這樣的蛋白。由於細菌生產系統通常不能生成正確摺疊的蛋白，因此，除了對錯誤摺疊的蛋白進行體外再摺疊以外，常常在真核細胞系統中進行生產，所述真核細胞系統例如酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。用於生產的真核細胞株和細胞系提供了有利條件，即它們可用來生產糖基化蛋白。但尤其是昆蟲細胞或哺乳動物細胞來源的重組蛋白產物成本極高，並且通常產量非常低。此外，它們還有缺點，即可被對人體有害的病毒和蛋白質汙染。所述被汙染的情況不會出現在使用真核微生物情況下。真核微生物培養所需的儀器設備與細菌培養所需的設備相似，不會出現被哺乳動物病毒和蛋白汙染的情況，並且蛋白產量可達g/l級。尤為合適的一種真核宿主生物體是酵母的一個分支，優選為子囊菌門(Ascomycota)。更優選Saccharomycotina，尤其是酵母(Saccharomycetes)綱，其中酵母(Saccharomycetales)目尤為重要。根據更優越的實施方案，宿主應為酵母(Saccharomycetaceae)科，尤其是畢赤酵母屬(Pichia)。本發明優選的示例性真核微生物為麵包師常用的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其它的例如念珠菌屬(Candida)，屬於甲醇營養酵母的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇營養性的畢赤酵母(Pichiamethanolica)和多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)，或麴黴屬(Aspergillus)的絲狀真菌如黑麴黴(Aspergillus niger)、米麴黴(Aspergillus oryzae)和構巢麴黴(Aspergillus nidulans)。特別優選的是巴斯德畢赤酵母。
所述重組產物的生產方法另一特徵在於，將至少編碼纖溶酶原的功能部分的核酸分子整合入這些微生物中使用的表達載體，這些優選編碼人纖溶酶原的核酸分子，與編碼至少一個信號肽[優選為一段前肽原(prepropeptide)，優選用於轉運至內質網]的核酸分子融合；蛋白酶切點的密碼子插入所述兩個核酸分子之間，可以在宿主體內，切割信號序列或前肽原。優選使用的核酸分子是編碼人纖溶酶原的核酸分子。除了編碼人纖溶酶原的核酸分子以外，也可以使用那些編碼來源於其它哺乳動物纖溶酶原的核酸分子。這樣，就可以生產各種哺乳動物的纖溶酶原。根據本發明的方法通過過量表達可以形成重組的人纖溶酶原，如果需要，它可以被分泌進培養基，並根據目前熟練技術人員己知的方法，將其通過離心、過濾或沉澱與培養基中的宿主細胞分開，並進行蛋白純化，而不需要複雜的細胞裂解過程。可通過蛋白酶將纖溶酶原激活成為纖溶酶，這種蛋白酶具有將纖溶酶原加工為具有催化活性的纖溶酶的能力。
在本發明中使用的下列術語的定義為「重組生產方法」意思是，在適當的宿主中，核酸序列(優選為DNA序列)表達生成肽或蛋白質，所述核酸序列來源於一個克隆，以及單個核酸片段的融合產物。
本文所述的「克隆」應包括現有技術中的所有已知克隆方法。然而，不會詳細描述所述方法，因為它們屬於本領域技術人員顯而易見的常用技術。
本文所述的「在合適的表達系統中表達」應包括現有技術中的所有已知表達方法，尤其是在權利要求書中提及的表達方法。
在「功能性纖溶酶原肽段部分」這一術語中，應該理解為能完成纖溶酶原相關的生物學功能的部分纖溶酶原或纖溶酶原肽段(plasminogen-peptide)。這些相關的生物學功能至少具有能被纖溶酶原激活劑激活成為纖溶酶的能力，所述激活劑例如是組織纖溶酶原激活劑、尿激酶、吸血蝙蝠(vampire-bat)纖溶酶原激活劑、鏈激酶、葡萄球菌激酶(以下簡稱葡激酶)和來源於鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)的Pla蛋白等；和蛋白水解的能力，其特徵在於水解纖維蛋白。在本說明書和實施例中所用的術語「纖溶酶原激活劑」，應指能進行蛋白水解和不能進行蛋白水解的纖溶酶原激活劑。
此外，穀氨酸纖溶酶原應理解為，通過纖溶酶催化切割前激活肽(preactivation peptide)，所述穀氨酸纖溶酶原具有被加工成為賴氨酸纖溶酶原的能力。
纖溶酶原結合到纖維蛋白、層粘連蛋白、纖維結合素、透明連接蛋白、硫酸乙醯肝素糖蛋白、4型膠原和其它底物後，其激活能力可提高到1000倍，同樣，所述激活能力屬於生物學功能。
應理解加工纖溶酶原後獲得的纖溶酶應該確保具有纖溶酶相關的生物學功能，其中包括以下物質的降解層粘連蛋白、纖維結合素、透明連接蛋白和硫酸乙醯肝素糖蛋白；以下物質的激活前膠原酶、前基質金屬蛋白酶、潛在的巨噬細胞彈性蛋白酶、激素原和生長因子，該生長因子例如TGFβ-1(潛在的轉化生長因子)，VEGF(血管內皮生長因子)或bFGF(基本成纖維細胞生長因子)。
纖溶酶的另一項生物學功能是被纖溶酶抑制劑所抑制的能力，所述纖溶酶抑制劑如α2-抗纖溶酶和α2-巨球蛋白。
根據纖溶酶的相關生物學功能，其功能不僅還包括結合纖維蛋白、層粘連蛋白、纖維結合素、透明連接蛋白、硫酸乙醯肝素糖蛋白和4型膠原，也包括結合受體如α-烯醇酶、膜聯蛋白(annexin)II或兼性因子(amphoterin)。
最初，形成的所有的纖溶酶原都是無活性的穀氨酸纖溶酶原形式。這種穀氨酸纖溶酶原，可被纖溶酶切割所述的前激活肽而生成賴氨酸纖溶酶原。兩者都可被組織纖溶酶原激活劑(在這種情況下，僅指上述蛋白水解激活劑)通過蛋白酶水解切割生成纖溶酶，該纖溶酶由二硫鍵連接的亞單位組成。較小的亞單位包括蛋白水解結構域和磷酸化位點，較大的亞單位攜帶有三個糖基化位點，並負責結合到纖維蛋白。糖基化位點的重要性進一步表現在血漿中的穩定性上。纖溶酶原通過與鏈激酶或葡激酶形成1∶1的複合物，纖溶酶原又可以轉化成一種具有蛋白水解活性的酶，該酶能夠將纖溶酶原加工為纖溶酶。
據此，功能性纖溶酶原是指一種這樣的纖溶酶原，其能夠被纖溶酶原激活劑作用而成為具有蛋白水解活性的纖溶酶。進一步地，功能性纖溶酶原，優選包括纖維蛋白結合結構域，並可至少包括三個糖基化位點中的一個。
功能性纖溶酶原的最小形式是微纖溶酶原和小纖溶酶原，稍大的形式是賴氨酸纖溶酶原。穀氨酸纖溶酶原，其仍然包括前激活肽，也是功能性纖溶酶原。然而可以想像的是，所述區域可被忽略，尤其存在於長鏈中而沒有顯著妨礙所述功能(尤其是蛋白水解功能、纖維蛋白結合功能)的區域。
製造不同形式的包括功能性催化結構域的纖溶酶原(以下稱為纖溶酶原衍生物)對於熟練技術人員來說顯而易見。就已描述的功能而言，應理解在被纖溶酶原激活劑激活後，所述纖溶酶原變異體具有的蛋白水解特性，所述纖溶酶原激活劑如鏈激酶或尿激酶。
—催化結構域可包括，缺失和置換的胺基酸，或與其它胺基酸或肽或蛋白融合。
—大結構域可包括從Glu20到Arg580的所有中間區域(基於前纖溶酶原序列)，它可被纖溶酶原激活劑激活生成活化的纖溶酶。
以下是三種形式的賴氨酸纖溶酶原的具體實施例變異體1N末端胺基酸Met88變異體2N末端胺基酸Lys97變異體3N末端胺基酸Val98優選，纖溶酶原衍生物比相應的微-、小-、Lys-或Glu-纖溶酶原短或長大約1至50個胺基酸；或優選以置換了1至10個胺基酸為特徵，此外，所述衍生物顯示被纖溶酶原激活劑激活的特性。在這些特定的微-、小-、Lys-或Glu-纖溶酶原及相應的纖溶酶原衍生物間，序列的同源性(序列匹配)超過80％，優選超過85％，更優選超過90％，更進一步優選超過95％，特別優選超過98％，更進一步特別優選超過99％。
優選纖溶酶原衍生物具有如下特徵—催化結構域可包含，至少一個缺失，和/或至少一個胺基酸的置換，和/或與至少另一胺基酸或至少另一肽段或至少另一蛋白融合；—大結構域可包含從Glu20到Arg580的所有中間區域(基於前纖溶酶原序列)，它可被纖溶酶原激活劑激活生成活化的纖溶酶；—纖溶酶原衍生物，其特徵是胺基酸序列的同源性(序列匹配)超過80％，優選超過85％，更優選超過90％，更進一步優選超過95％，更進一步特別優選超過99％。
「微生物」包括所有具備了微小個體特徵的生命形式。因此，其既包括真核微生物，也包含了原核微生物。特指細菌、酵母、真菌和病毒。
「核酸」包括DNA和RNA，兩者均為所有可能的構型，例如，雙鏈形式的核酸、單鏈形式的核酸、它們的組合物、以及線裝或環狀的核酸。
應理解「信號序列」是一段肽鏈的序列，它能夠保證另外一段肽鏈序列進入或穿越生物膜，例如進入內質網。因此，所述信號序列的例子可以是前肽原(prepropeptide)、前肽(prepeptide)或原肽(propeptide)。
「切點」是指在肽鏈序列中的位點，所述位點為在宿主生物體內進行如下加工提供了位點從另一肽段序列切割掉信號序列、前肽原或原肽，或通常將一段肽段序列切割成兩部分。
「編碼至少一個信號肽或前肽原的核酸」是指一個核酸序列，它編碼了一個肽段或蛋白結構，所述肽段或蛋白結構幫助其它多肽穿越生物膜，例如進入內質網。
「引物」是指一種起始寡核苷酸。意思是短鏈、單鏈、寡聚核糖核酸或脫氧核糖核酸，其可與單鏈核酸分子的某個區域互補，並與之雜交形成雙鏈。雙鏈中游離的3』-羥基末端可作為DNA聚合酶的底物，並作為將整個單鏈合成雙鏈的聚合反應的起點。引物專門應用於PCR，即聚合酶鏈式反應，所述反應為本領域技術人員所知曉。
「質粒」是指核酸分子，它不被整合進入染色體，而是出現在很多原核微生物和一些真核微生物中，長度大約為2kb至超過200kb。
「連接」指通過連接酶連接兩個核酸分子的末端或自身連接，自身連接即指經分子內的閉環反應而完成的連接，其中倘若一個線性DNA分子的兩個單鏈末端能夠彼此形成鹼基對，兩者將會二聚化。
「限制性核酸內切酶」是指一類細菌產生的酶，它能夠切開DNA雙鏈分子的特定鹼基序列中的磷酸二酯鍵。
「電穿孔」是一種介導核酸進入細胞的方法。因此當受體細胞暴露於核酸溶液時，利用高場強的短暫電脈衝，使在懸液中生長至對數期的受體細胞的細胞膜局部通透高分子量的分子。
應理解「過量表達」是指，與野生型細胞的產量相比，細胞生產功能性纖溶酶原的產量增加。通常，過量表達是指，當在細胞內生產時，外源基因的表達量約佔宿主細胞的全部細胞內蛋白總量的1～40％。
應理解「表達載體」是指這樣的載體，當該載體進入合適的宿主細胞後，其能轉錄克隆入該載體的外源基因，並隨後以形成的mRNA(信使RNA)進行翻譯。表達載體通常包含控制信號，該控制信號在原核或真核細胞的基因表達中是必需的。
在本發明中，優選可被甲醇誘導的啟動子如AOX1-啟動子，或特別優選組成性啟動子如YPT1-啟動子或GAP-啟動子，所述啟動子被用來控制酵母中的基因的表達，所述酵母如巴斯德畢赤酵母。特別優選為組成性的GAP-啟動子。
「AOX1」是源自巴斯德畢赤酵母的乙醇氧化酶1的基因；「GAP」是源自巴斯德畢赤酵母的甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶的基因；及「YPT1」是源自巴斯德畢赤酵母的GTP結合蛋白的基因。
由PHO-1、SUC-2、PHA-E或α-MF基因編碼的蛋白的信號肽，通常應用在酵母的分泌產物中。
「PH01」是源自巴斯德畢赤酵母的酸性磷酸酶基因；「SUC-2」是源自釀酒酵母的分泌性轉化酶基因；「PHA-E」是源自Phaseolus vulgaris Agglutinis的酸性磷酸酶基因；「α-MF」是源自釀酒酵母的α-雜交因子基因。
特別優選的是蛋白酶切點的密碼子，及蛋白酶Kex2或Ste13切割原肽的切點的密碼子。特別優選在上述步驟a)用密碼子進行所述連接，所述密碼子編碼Kex2切點和另外兩個Ste13切點。在本發明的一個優選實施方案，編碼信號肽或前肽原的核酸分子來源於酵母，尤其來源於釀酒酵母。在一個更優選實施方案中，涉及編碼信號肽或前肽原的核酸分子，該核酸分子編碼釀酒酵母的α-因子的信號肽或前肽原。在上述步驟a)中描述的所形成的融合產物優選通過PCR擴增，並進一步優選進行適當的純化。
在公開號為WO02/50290的專利申請中，公開了通過適用於酵母的表達載體pPICZαA重組產生小纖溶酶原和微纖溶酶原，所述載體含有可誘導的AOX1-啟動子和酵母α-因子的前肽原。這些較小的纖溶酶原變異體沒有(如微纖溶酶原)，或僅有一個(如小纖溶酶原)環餅結構域。表達載體pPICZαA包含蛋白酶Kex2和Ste13切點。但在小纖溶酶原和微纖溶酶原相應的表達載體中，Ste13切點被刪除。
已知酵母中用於可誘導的表達體系的一組啟動子。到目前為止尤其包括，AOX1-啟動子、AOX2、CUP1(Koller A，Valesco J，SubramaniS.，Yeast 200016(7)，651-6)、PH01(EP0495208)、HIS4(US 4885242)，FLD1(Shen等，Gene 1998216(1)，93-10)和XYL1-啟動子(Den Haan和Van Zyl，Appl.Microbiol.Biotechnol.200157(4)，521-7)。
通過甲醇誘導的AOX1-啟動子的方法，可以選擇性地定向生產異源的蛋白，並且可以得到均一的數量。在誘導外源蛋白進行表達之前，使宿主生物體可達到高的生長密度而沒有在表達外源蛋白中發生的篩選缺陷。
公開號為WO02/50290的專利申請中，在AOX1-啟動子控制下表達了較小的變異體，與所述較小的變異體相反，本發明中重組生產的穀氨酸纖溶酶原和賴氨酸纖溶酶原包含了所有的五個環餅結構域，由於以下原因，使其重組生產變得複雜化—宿主在表達外源蛋白時，由於其生長缺陷，可能會導致表達元件丟失；—表達蛋白的蛋白水解降解；和—低產量。
由於所述的缺陷，在公開號為WO02/50290的專利申請中未公開穀氨酸纖溶酶原和賴氨酸纖溶酶原的生產。
在本發明中，尤其通過以下方式這些困難已被解決重組蛋白包含了信號肽、Kex2和至少一個Ste13，優選兩個Ste13蛋白酶切點。進一步來說，一個優選的實施方案中，供應作為另一種碳源的甘油，其速率為0.1至10ml/h，更優選為0.5至5ml/h，進一步優選為0.8至1.5ml/h。培養基是pH7.0的中性緩衝體系。注意保證充分的氧供應。
在一個優選實施方案中，應注意重組核酸未連接到AOX1基因的5』端，而是連接到了源自巴斯德畢赤酵母的磷酸甘油醛脫氫酶基因的5』端。在這裡，使用了組成性的、不能被誘導的啟動子。可使用的在酵母中有活性的組成性啟動子是GAP-啟動子、YPT1-啟動子(Sears等，Yeast199814(8)，783-90)、TKL-啟動子(Den Haan和Van Zyl，Appl.Microbiol.Biotechnol.200157(4)，521-7)、ACT-啟動子(Kang等，Appl.Microbiol.Biotechnol.200155(6)，734-4」和PMA1-啟動子(Yeast200016(13)，1191-203)。優選的啟動子是GAP-啟動子和YPT1-啟動子。特別優選的啟動子是GAP-啟動子。
與可誘導的啟動子相反，組成性的啟動子有其缺陷，即要表達的外源蛋白在整個生長周期持續組成性生成。這是對宿主細胞的不利條件，尤其表現為宿主細胞生長延緩。由於優勢選擇壓力，丟失了重組表達元件的宿主細胞具有生長優勢，並能過度生長重組宿主細胞。這樣，可出現異源混和種群中，而異源混和種群是應當避免的。然而令人驚訝的發現是，根據本發明優選的實施方案，組成性GAP-啟動子能產生更高的產量。
當應用AOX1-啟動子時，賴氨酸纖溶酶原的產量在誘導120小時後可以獲得至少17U/l(單位/升)(＝1.5mg/l)，進一步優選為120U/l(＝11mg/l)，更優選為180U/l(＝16mg/l)，更進一步優選是200U/l(＝18mg/l)，再優選是220U/l(＝20mg/l)，再進一步優選是240U/l(＝22mg/l)，特別優選是260U/l(＝24mg/l)，更特別優選是280U/l(＝25.5mg/l)；在使用組成性啟動子，特別是GAP-啟動子時，產量顯著升高。
在一個優選的實施方案中，組成性的啟動子如GAP-啟動子與核酸可操作性偶聯，所述核酸編碼至少纖溶酶原序列的功能部分，並與編碼至少一段信號肽的核酸序列融合，所述編碼功能性纖溶酶原的核酸序列和編碼至少信號肽的核酸序列用蛋白酶的酶切位點密碼子偶聯，該蛋白酶用於切割信號肽。
在特別優選的實施方案中，組成性的啟動子如GAP-啟動子，可操作性偶聯控制微-、小-、Lys-或Glu-纖溶酶原核酸序列，此序列與源自酵母的信號肽的核酸序列融合。
這可看作是一個令人驚奇的發現，根據本發明的優選實施方案，組成性GAP-啟動子可達高於10倍的產量(見實施例7c，賴氨酸纖溶酶原的生產，1375U/l，可換算為125mg/l)。在另一個優選實施方案中，供應作為另一種碳源的甘油，速率為0.1至10ml/h(毫升/小時)，更優選為0.5至5ml/h，進一步優選為0.8至1.5ml/h，培養基是pH＝7.0的中性緩衝體系。因此，生長速度μ[l/h]介於0.002和0.10之間，優選在0.004和0.020之間，進一步優選在0.008和0.010之間。
在應用GAP-啟動子中，在發酵持續250小時後，獲得的賴氨酸纖溶酶原的產量至少為660U/l(＝60mg/l)，優選為1000U/l(＝91mg/l)，再優選為1500U/l(＝136mg/l)，進一步優選為2000U/l(＝182mg/ml)，特別優選為2500U/l(＝227mg/l)，進一步特別優選為2750U/l(＝250mg/l)。
因此，重組小纖溶酶原和微纖溶酶原產物可獲得更高的表達量。小纖溶酶原的產量介於每升100mg到2g之間，優選為300mg/l-1.5g/l，進一步優選為400mg/l-1g/l，更進一步優選為500mg/l-800mg/l，特別優選為600mg/l-700mg/l。微纖溶酶原的產量至少高於小型纖溶酶原產量的10％。相較於賴氨酸纖溶酶原重組產物，獲得的穀氨酸纖溶酶原重組產物的產量稍低。
本發明所述的方法，適用於生產小-、微-、Lys-和Glu-纖溶酶原。因此，優選實施方案也集中在重組產生小-、微-、Lys-和Glu-纖溶酶原上，在表達載體上所述小-、微-、Lys-和Glu-纖溶酶原均與信號序列或前原序列(prepro sequence)偶聯，這些載體包含了組成性啟動子如GAP-啟動子。在進一步優選的實施方案中，信號序列由信號肽或釀酒酵母的a因子的前肽原組成。在特別優選實施方案中，組成性啟動子如GAP-啟動子，可操作性地與Seq.ID.No.7或9，或Seq.ID.No.13或15中的一個，或Seq.ID.No.50至59中的一個的核酸序列相偶聯，並在適當的表達載體中表達。
在另一優選的實施方案中，組成性啟動子如GAP-啟動子，可操作性地與編碼至少包含纖溶酶原功能部分的核酸序列相偶聯。在一個特別優選的實施方案中，組成性啟動子如GAP-啟動子，可操作性地與Seq.ID.No.13、15、7和9，或Seq.ID.No.50至59中的一個相偶聯，或與Seq.ID.No.11的核酸序列相偶聯，並在適當的表達載體中表達。
穀氨酸纖溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序計算數據)分子量88431.67Dalton(道兒頓)791個胺基酸pH＝7.0時，7.121等電點為1.351糖基化作用位點0-268、N-308、0-365(根據由810個胺基酸組成的前纖溶酶原的順序編號)賴氨酸纖溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序計算數據)分子量為79655.71Dalton741個胺基酸pH＝7.0時，7.492等電點為5.287糖基化作用位點0-268、N-308、0-365(根據由810個胺基酸組成的前纖溶酶原的順序編號)小纖溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序計算數據)分子量為38169.63Dalton348個胺基酸pH＝7.0時，7.203等電點為0.893糖基化作用位點無微纖溶酶原(用EditSeqTM(DNASTAR)程序計算數據)分子量為27230.41Dalton249個胺基酸pH＝7.0時，7.934等電點為3.733糖基化作用位點無本發明所述的方法詳細描述如下本發明步驟a)產生的融合產物，能夠被整合到適合於微生物的表達載體中。所述表達載體優選從下列載體中挑選pPICZαA、B和C，pPICZA、B和C，pGAPZαA、B和C，pGAPZA、B和C，pPIC6αA、B和C，pPIC6A、B和C，以及pAO815、pPIC3.5K和pPIC9K。更優選使用連接的方法，導入表達載體。在用T4DNA連接酶連接之前，PCR產物和表達載體優選使用限制性核酸內切酶KspI和XhoI酶切。連接後的核酸可通過電穿孔轉化到優選大腸桿菌的微生物中，可從由此獲得的微生物中提取出DNA，並優選使用內切酶XhoI或SfuI和KspI，進行酶切分離。由此獲得的核酸可以是一種質粒，優選選自下列質粒pMHS476.1、pSM54.2、pSM49.8、pSM82.1、und pSM58.1、pAC37.1、pJW9.1、pPLG1.1、pPLG2.1、pPLG3.2、pPLG4.2、pPLG5.3、pPLG6.1、pPLG7.1、pPLG8.3、pPLG9.1、pPLG10.1、pPLG11.2、pPLG11.2、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2或pPLG20.1。用於上述擴增的兩個寡核酸引物，可優選選自如下序列NO34(Seq.ID No.1)、NO36(Seq.ID No.2)、NO36a(Seq.ID No.19)、NO36b(Seq.ID No.20)、NO36c(Seq.ID No.21)、NO36d(Seq.ID No.22)、NO36e(Seq.ID No.23)、NO36f(Seq.ID No.24)、NO36g(Seq.ID No.25)、NO36h(Seq.ID No.26)、NO36i(Seq.ID No.27)、NO36j(Seq.IDNo.28)、NO57(Seq.ID No.3)、NO37(Seq.ID No.4)、NO35(Seq.ID No.5)或NO56(Seq.ID No.6)。
根據本發明，下列實施方案是特別優選的—編碼蛋白酶Kex2酶切位點和纖溶酶原融合基因的密碼子，其特徵性的核酸序列顯示於Seq.ID No.7或13的序列中。
—編碼蛋白酶Kex2酶切位點和纖溶酶原融合蛋白的密碼子，其特徵性的胺基酸序列特徵顯示Seq.ID No.8或14的序列中。
—編碼蛋白酶Kex2、Ste13酶切位點和纖溶酶原融合基因的密碼子，其特徵性的核酸序列顯示於Seq.ID No.9或15的序列中。
—編碼蛋白酶Kex2、Ste13酶切位點和纖溶酶原融合基因的密碼子，其特徵性的胺基酸序列顯示於Seq.ID No.10或16的序列中。
優選將從上述多個質粒中優選出的上述質粒，轉化到宿主微生物中。可以採用如電穿孔的轉化方法。使用的微生物優選為真核微生物，其是真菌的分支。優選的微生物是子囊菌門，其中優選Sacchariomycotina，其中更優選酵母綱，進一步優選為Saccharomycetales，更優選為Saccharomycetaceae科，其中特別優選的是畢赤酵母屬、酵母屬、漢遜屬(Hansenula)和麴黴屬(Aspergillus)。
根據本發明特別優選的實施方案，在轉化了步驟a)所產生的融合產物的宿主微生物中，編碼至少纖溶酶原功能部分的核酸序列呈過度表達狀態，並且至少分泌出所述纖溶酶原功能部分，優選分泌到培養基中。根據另一優選的實施方案，纖溶酶原功能部分的核酸序列，是序列Seq.IDNo.60、61、62、63、64、65或66中的一個。根據另一種優選的實施方案，纖溶酶原功能部分的核酸序列與完整的纖溶酶原序列相一致。利用本發明所述的重組產物生產方法，優選生產人功能性纖溶酶原。
根據本發明所述的重組產物生產方法獲得的纖溶酶原，或者所述纖溶酶原經蛋白酶作用後獲得的纖溶酶，均能夠用於生產治療創傷的藥物，尤其適用於治療癒合慢或難愈性創傷，也能夠用於治療血栓形成事件或者預防血栓形成事件。
此外發現，根據本發明生產的纖溶酶原以及從中獲得的纖溶酶具有抗凝特性。這些有利特性使得纖溶酶原和/或纖溶酶，還可以作為抗血栓劑和抗凝活性劑使用，可用於預防和/或治療下列疾病心臟病發作、血栓形成、心瓣膜術後再狹窄、缺氧、缺血、凝固性壞死、血管炎；可用於以下疾病的後續治療心臟病發作、搭橋手術、血管形成術、球囊擴張術。纖溶酶原還可用於急性心臟病發作中的溶栓治療、動靜脈短路的再通和急性心臟病發作中閉塞冠狀動脈的再灌注。根據本發明生產的纖溶酶原，還可用於預防和治療下列疾病急性肺栓塞、新發性的或陳舊性的靜脈血栓凝結、急性和亞急性動脈血栓、靜脈血栓、急性肢端動脈阻塞、慢性閉塞性動脈病、動靜脈短路處血栓形成、臀部和肢端深靜脈血栓、閉塞(desobliterated)血管區域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纖溶酶原缺乏導致的結膜炎、燒傷和凍傷、鹼或酸灼傷以及休克時瀰漫性血管內凝血。
當患有上述疾病時，優選與抗凝劑一起使用纖溶酶原和/或纖溶酶。適用的抗凝劑為肝素、肝素衍生物或乙醯水楊酸。
因此，本發明所述的藥物組合物也很重要，該藥物組合物包含根據本發明所述重組產物生產方法獲得的纖溶酶原或者由此獲得的纖溶酶，以及所需的藥物學上可接受的基質、添加劑和/或溶劑。此外，優選藥物組合物可包含抗凝活性劑，尤其是肝素、肝素衍生物或者乙醯水楊酸。
根據本發明生產的纖溶酶原和/或由此獲得的纖溶酶，用於創傷的體外治療，優選以藥物組合物形式用於創傷的局部治療。在此應用中，纖溶酶原和/或纖溶酶的使用濃度為，每克藥物組合物中含0.01-500U的纖溶酶原和/或纖溶酶，優選為0.1-500U，進一步優選為0.1-250U，更進一步優選為0.5-250U，特別優選的是1-150U。如果用膏藥或其他敷料代替如軟膏、糊劑或膠劑等半固體製劑的物質，需分別考慮每2cm2膏藥表面積的上述給定的用藥濃度和敷料表面積。
根據已知方法及適當劑量的所需應用類型，使用常用的固態、液態基質或稀釋劑和普遍使用的藥物輔劑來生產本發明所述的藥物組合物。優選的藥物製劑或組合物為適合局部外用的藥物劑型。所述藥物劑型例如，軟膏、糊劑、膠劑、包衣、散劑、乳劑、懸浮劑或其他特殊製劑態，該特殊製劑如納米分散系統，包括脂質體、納米乳劑或脂質納米顆粒的形式，也包括無表面活性劑的製劑、多聚體穩定的或微粒穩定的乳劑。
本領域普通技術人員已知各種製劑的生產方法和不同的應用方法，並在如「Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton PA」中有詳細描述。
在以下情況下，將藥物組合物製成為用於胃腸外給藥的形式是合適的藥物組合物用於預防和/或治療下列疾病，心臟病發作、血栓形成、心瓣手術後再狹窄、缺氧、缺血、凝固性壞死、血管炎和急性心臟病發作；和用於以下疾病的後續治療心臟病發作、搭橋手術、血管形成術和球囊擴張術。
此外、所述藥物組合物也適各種系統的應用、包括急性肺栓塞、急性心臟病發作中溶栓治療、新發性的或陳舊性的靜脈血栓、急性和亞急性動脈血栓、動靜脈短路再通、靜脈栓塞、急性心臟病發作中閉塞冠狀動脈的再灌注、急性肢端動脈阻塞、慢性閉塞性動脈病、動靜脈短路血栓、臀部和肢端深靜脈血栓、閉塞血管區域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纖溶酶原缺乏導致的結膜炎、燒傷、鹼或酸灼傷和凍傷以及休克時瀰漫性血管內凝血。
所述藥物組合物也可用於纖溶酶原缺乏的情況，例如遺傳性或先天性(congenital)纖溶酶原缺乏(純合子I型纖溶酶原缺乏)，所述纖溶酶原缺乏能導致木樣結膜炎(conjunctivitis lignosa)或血栓形成傾向狀態。也可通過例如靜脈注射重組纖溶酶原，治療上述疾病，所述纖溶酶原包括Glu-，Lys-，小-和微-纖溶酶原及其衍生物(Heinz等，Klin.Monatsblatt Augenheilkunde 2002，219(3)156-8)。
另一種可能的應用是，可通過施用纖溶酶原，消除呼吸道假膜，使呼吸道正常化，以及使創傷更快癒合。所述應用已經用於新生兒(The NewEngland Journal of Medicine 1998，339，23，1679-1686)。
重組產生的纖溶酶原與由此獲得的纖溶酶一起使用，或在藥物組合物中只加入纖溶酶，均適用於預防和/或治療下列疾病急性肺栓塞、新發性的或陳舊性的靜脈血栓、急性和亞急性動靜脈血栓、動靜脈短路再通、靜脈栓塞、急性心臟病發作中閉塞冠狀動脈的再灌注、急性肢端動脈阻塞、慢性閉塞性動脈病、動靜脈短路血栓形成、臀部和肢端深靜脈血栓形成、閉塞血管區域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纖溶酶原缺乏導致的結膜炎、燒傷、鹼或酸灼傷和凍傷以及休克時瀰漫性血管內凝血。
優選含有本發明重組生產的纖溶酶原的藥物組合物，其可適於下列疾病的局部治療燒傷、凍傷、鹼或酸灼傷、損傷和/或創傷，尤其是難愈性創傷。優選所述重組纖溶酶原與至少一種激活劑一起使用，所述纖溶酶原激活劑可以是例如尿激酶或鏈激酶。另一種優選的方法是，使用本發明生產的纖溶酶原前，通過激活劑將纖溶酶原完全或部分激活為纖溶酶，並將其用於上述適應症，此方法的藥物製劑包括，單用纖溶酶或纖溶酶加纖溶酶原的形式。
特別值得考慮的胃腸外給藥途徑為靜脈內施用、動脈內施用、腹膜內施用、皮下施用和肌肉施用。如果採用胃腸外給藥途徑，注射或輸液用的溶液中的蛋白質濃度範圍在0.1-100百萬單位/10ml溶液，優選為10-100百萬單位/10ml，進一步優選為1-10百萬單位/10ml，特別優選為3-5百萬單位/10ml。如果採用口服方式，則蛋白質濃度為0.1-100,000單位/克製劑，優選為100-80,000單位/克，特別優選為1,000-50,000單位/克。
具有進一步優點的藥物製劑，例如，含有蛋白酶的膏藥、敷料劑或其他外敷用物質。這些製劑特別適合於創傷癒合的局部用藥，或用於下列疾病的治療燒傷、凍傷、鹼或酸灼傷和/或損傷。優選本發明重組生產的纖溶酶原用在藥物組合物中，所述藥物組合物尤其包括創傷癒合劑、軟膏以及其他用於外敷的材料，它們與至少一種激活劑(所述纖溶酶原激活劑如尿激酶、鏈激酶)，或由前述激活劑預先激活形成的纖溶酶一起使用，在所述藥物組合物和製劑中和/或上，纖溶酶潛在地與纖溶酶原一起使用，或潛在地與至少一種激活劑一起使用。在膏藥和外敷用物質內和/或上特別優選使用纖溶酶原，優選纖溶酶原和一種激活劑；或纖溶酶或纖溶酶加纖溶酶原和一種激活劑，所述製劑適用於創傷治療，尤其用於難愈性創傷的治療，也可用於治療燒傷、凍傷、鹼或酸灼傷，或其他損傷。
敷料、創傷癒合敷料或膏藥，含有本發明生產的纖溶酶原和/或由此獲得的纖溶酶，其中，每平方釐米藥物製劑含有0.01-500U纖溶酶原和/或纖溶酶，優選每平方釐米敷料或膏藥分別含有0.1-500U纖溶酶原和/或纖溶酶。優選每平方釐米膏藥或敷料中的藥物製劑中，含有的纖溶酶原和/或由此產生的纖溶酶的濃度為0.1-250U，進一步更優選為0.5-250U，特別優選為1-150U。
為激活1mg纖溶酶原，尿激酶的用量為1ng(納克)-100μg(微克)，優選用量為10ng-10μg。為激活1mg纖溶酶原，鏈激酶的用量為1μg-1mg，優選用量為3μg-300μg。為激活1mg纖溶酶原，從灰色鏈黴菌(S.griseus)來源的蛋白酶的用量為10ng-100μg，優選用量為100ng-10μg。為激活1mg纖溶酶原，蛋白酶VIII的用量為10ng-100μg，優選用量為100ng-10μg。
編碼纖溶酶原功能部分的核酸序列優選是DNA序列。
另外，與本發明相關的質粒如下質粒pPLG1.1質粒pPLG2.1質粒pPLG3.2質粒pPLG4.2質粒pPLG5.3質粒pPLG6.1質粒pPLG7.1質粒pPLG8.3質粒pPLG9.1質粒pPLG10.1質粒pPLG11.2質粒pPLG11.2質粒pPLG13.1質粒pPLG14.2質粒pPLG15.1質粒pPLG16.3質粒pPLG17.2質粒pPLG18.1質粒pPLG19.2質粒pPLG20.1質粒pMHS476.1(保藏號DSM 14678)質粒pSM54.2(保藏號DSM 14682)質粒pSM49.8(保藏號DSM 14681)
質粒pSM82.1(保藏號DSM 14679)質粒pSM58.1(保藏號DSM 14680)質粒pAC37.1(保藏號DSM 15369)質粒pJW9.1(保藏號DSM 15368)。
(保藏號指德國微生物和細胞培養物保藏中心的保藏編號(GermanCollection of Microorganisms and Cell Cultures Ltd.，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig)。
另外，本發明涉及適合表達的DNA序列，該序列包含至少編碼纖溶酶原功能部分的核酸序列，該核酸序列可根據本發明所述的重組生產方法獲得。此外，本發明還涉及宿主微生物，其包含融合產物和由此衍生出的一段核酸序列，所述融合產物見上述步驟a)。本發明還涉及載體、DNA分子或RNA分子，所述載體、DNA分子或RNA分子包含融合產物和由此衍生出的一個核酸序列，所述融合產物見上述步驟a)。
最後，本發明還涉及鑑定纖溶酶原激活劑的篩選方法，所述激活劑尤其指纖溶酶原激活性蛋白酶，其中，使用根據上述重組產物的生產方法來生產的功能性纖溶酶原。根據此目的，優選蛋白酶預溫育後得到的纖溶酶，與根據本發明所述方法生產的功能性纖溶酶原一起測量活性。可使用一段合成肽來測量所得纖溶酶的活性。特別優選使用N-tosyl(甲苯磺醯)-Gly-Pro-Lys-pNA來測量所得纖溶酶的活性。


使用附圖來更為詳細地解釋本發明，附圖如下圖1質粒pMHS476.1(5682bp)的物理圖譜。α因子前肽原基因通過Kex2酶切位點的密碼子，與人賴氨酸纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在AOX1啟動子的控制下。
圖2質粒pSM54.2(5694bp)的物理圖譜。α因子前肽原基因通過一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，與人賴氨酸纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在AOX1啟動子的控制下。
圖3質粒pSM49.8(5715bp)的物理圖譜。人前纖溶酶原基因在AOX1啟動子的控制下。
圖4質粒pSM82.1(5913bp)的物理圖譜。α因子前肽原基因通過Kex2酶切位點的密碼子，與人賴氨酸纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在AOX1啟動子的控制下。
圖5質粒pSM58.1(5925bp)的物理圖譜。α因子前肽原基因通過一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，與人穀氨酸纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在AOX1啟動子的控制下。
圖6質粒pAC37.1(11400bp)的物理圖譜。α因子前肽原基因通過一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，與人賴氨酸纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在AOX1啟動子的控制下。
圖7質粒pJW9.1(5925bp)的物理圖譜。α因子前肽原基因通過一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，與人賴氨酸纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在GAP啟動子的控制下。
圖8質粒pPLG1.1的物理圖譜。α因子前肽原基因通過一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，與人小纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在AOX1啟動子的控制下。
圖9質粒pPLG11.2的物理圖譜。α因子前肽原基因通過一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，與人小纖溶酶原基因連接，所述α因子前肽原基因在GAP啟動子的控制下。
圖10通過Klrhof分析檢測纖維蛋白溶解活性。
圖11實施例6g中純化的餾分在7.5％的SDS-PAGE電泳的結果。
具體實施例方式
根據本發明，能夠具有糖基化作用和分泌蛋白(如果需要)特性的所有微生物都可以作為宿主生物體。舉例如下釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、多形漢遜酵母麴黴屬的絲狀真菌。
在藥物製劑中特別考慮使用根據本發明分別生產的功能性纖溶酶原和纖溶酶。在這樣的製劑中，功能性纖溶酶原可以與藥物可接受的基質、輔劑和其他本領域技術人員已知的輔劑或添加劑混合使用。
原肽上存在著能被Kex2蛋白酶切割的Kex2酶切位點，所述Kex2蛋白酶位於高爾基體中。該蛋白酶也被稱作蛋白酶YscF或Kexin，是一種能夠加工原蛋白的絲氨酸蛋白酶，其從基本胺基酸對(basic amino acidpairs)(如Lys-Arg)切割C末端。
原肽上存在著能被Ste13蛋白酶切割的Ste13酶切位點，所述Ste13蛋白酶位於高爾基體中。蛋白酶Ste13(也被稱作蛋白酶YscVI或二肽氨肽酶A)分布於晚期的高爾基體，能夠逐步水解N端的Xaa-Ala二肽，如釀酒酵母未成熟的α因子的N端的Xaa-Ala二肽。
除了蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位點外，也可以插入其他酶切位點，所述其他酶切位點可被位於內質網或高爾基體中的蛋白酶識別為底物。
也可以只與纖溶酶原基因的信號序列(前肽)融合，該信號序列負責將產物轉運進內質網，即，在所述過程中諸如釀酒酵母的雜交因子原肽並非必須。
本領域技術人員熟知在實施例中涉及的微生物學、分子生物學和蛋白質化學的方法。以下是參考書目Maniatis等，Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆實驗室手冊)，Cold Spring Harbor press(冷泉港出版社)，1989(10)；Gassen Schrimpf，Genetic EngineeringMethods(基因工程方法)，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1999(11)；EasySelectTMPichia Expression Kit Instruction Manual(EasySelectTMPichia表達試劑盒操作手冊)，Invitrogen，Groningen，荷蘭，目錄號K1740-01。巴斯德畢赤酵母菌株和表達系統均可購自Invitrogen，並在上述操作手冊中有所描述。
pPICZA、B和C是3.3kb的巴斯德畢赤酵母表達載體，該載體較短。載體上存在梅衣靈(zeocin)抗性基因，用來直接篩選巴斯德畢赤酵母轉化體。此外，該載體上存在C端標記序列，用來快速純化和檢測融合蛋白。pPICZalpha A、B和C是3.6kb的巴斯德畢赤酵母表達載體，也具有梅衣靈抗性基因和上述的C端標記序列。此外，它們還包含釀酒酵母α因子分泌信號，用於把蛋白有效地分泌到培養基中。
此外，纖溶酶原能夠被激活。纖溶酶原和一種蛋白酶孵育後能被激活，所述蛋白酶採用本發明的篩選方法鑑定。
優選纖溶酶原與下列酶一起溫育來源於灰色鏈黴菌的蛋白酶、蛋白酶VIII、蛋白酶XVIII、無花果蛋白酶、金屬內肽酶、梭菌蛋白酶、穀氨酸-C端內蛋白酶、蛋白酶XIII、蛋白酶A、胰蛋白酶、天冬氨酸-N端內蛋白酶或彈性蛋白酶。
進一步可以設想，通過t-PA、u-PA或vb-PA[吸血蝙蝠-PA]與纖溶酶原孵育來激活纖溶酶原。
在另一種優選的實施方案中，纖溶酶原通過與葡激酶和鏈激酶一起孵育而被激活。鏈激酶或葡激酶與纖溶酶原形成一種1∶1複合物。通過形成這種複合物，複合物中的纖溶酶原的構象發生改變，從而其具有蛋白水解活性，並能激活纖溶酶原使之轉變為纖溶酶。
根據本重組方法獲得的功能性纖溶酶原，或活化的功能性纖溶酶原，均具有水解纖維蛋白的能力。所述纖溶酶原也具有激活原基質金屬蛋白酶和生長因子的能力。
將通過下列實施例更詳細地說明本發明。
實施例1a擴增賴氨酸纖溶酶原基因，所述基因在5』端插入Kex2酶切位點的密碼子使用QIAGEN質粒中提試劑盒(QIAGEN，Hilden)，從HB101大腸桿菌株(含有pPLGKG)中提取質粒pPLGKG(Forsgren等，FEBS Lett.1987年3月23日；213(2)254-60(2))，該質粒含有前-穀氨酸-纖溶酶原(pre-Glu-plasminogen)基因。用10U的EcoRI限制性內切酶(Roche，Mannheim)酶切150ng pPLGKG-DNA使之線性化，隨後使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN，Hilden)純化DNA。用引物NO34(Seq.ID No.1)和NO36(Seq.ID No.2)擴增纖溶酶原基因。除與纖溶酶原基因互補的鹼基外，寡核苷酸引物NO36還具有Kex2酶切位點的密碼子。每個反應體系包含0.5U Pwo-DNA-聚合酶(Hybaid，Heidelberg)、400nM的寡核苷酸引物、200μM dNTP、3ng的線性pPLGKG-DNA和各自的反應緩衝液，終體積為50μl。引物結合溫度為58℃。
通過瓊脂凝膠電泳來檢測PCR產物條帶預期大小是否正確，並用QIAquick PCR純化試劑盒純化。
實施例1b把纖溶酶原基因克隆到pPICZaA載體中取400ng的PCR產物用各10U的KspI和XhoI(Roche，曼海姆)限制性內切酶酶切。質粒pPICZαAA(Invitrogen，Groningen，荷蘭)含有來源於釀酒酵母α-因子的前肽原序列，取300ng所述質粒的DNA也用10U的KspI和XhoI限制性內切酶酶切。在0.9％瓊脂糖凝膠上分離酶切後的DNA，用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，Hilden)從凝膠中回收穫得的片段。將載體DNA和插入DNA混合併在1U T4-DNA-連接酶(Roche，曼海姆)作用下，4℃連接過夜。
隨後用QIAquick PCR純化試劑盒，純化該批連接產物DNA，將所述純化產物通過電穿孔用於轉化大腸桿菌JM109。
將電穿孔轉化後的JM109大腸桿菌細胞，接種入1ml SOC培養基中，37℃培養1小時，然後鋪於加有20μg/μl梅衣靈(Invitrogen，Groningen，荷蘭)的LB瓊脂固體瓊脂基上，37℃溫育過夜。
從一個由此獲得的大腸桿菌中，使用QIAGEN質粒小提試劑盒(QIAGEN plasmid mini kit，QIAGEN，Hilden)提取DNA，用XhoI和KspI限制性內切酶酶切後，通過瓊脂糖凝膠電泳分離出300ng核酸。分離出的質粒包含預期大小的片段，該質粒被稱作pMHS476.1(圖1)。通過序列分析，確定融合基因的序列正確無誤，該融合基因由源自釀酒酵母α-因子前肽原基因、賴氨酸纖溶酶原基因以及蛋白酶Kex2酶切位點的密碼子組成(Seq.ID No.7)。
實施例1c用質粒pMHS476.1轉化巴斯德畢赤酵母使用QIAGEN質粒中提試劑盒(QIAGEN plasmid midi kit，QIAGEN，Hilden)從JM109大腸桿菌株(含pMHS476.1)中，提取纖溶酶原的表達載體pMHS476.1質粒DNA。用100U PmeI(New England Biolabs，Frankfurt)酶切10μg pMHS476.1-DNA使其線性化，按照EasySelectTMPichia表達試劑盒操作手冊所示方法，將其電穿孔轉化到巴斯德畢赤酵母KM71H株中，該KM71H株的基因型為his4HIS 4 arg 4 aoxl巴斯德畢赤酵母Y-11430株的ARG 4(Northern Regional Research Laboratories，Peoria，美國)。所述克隆在YPDS固體培養基裡生長三到四天後，鋪板於含有100μg/ml梅衣靈的YPDS固體培養基並培養，並用於接種液態培養基。將所述克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pMHS476.1-1/a，此處「a」代表從1開始的克隆的連續編號。
實施例1d巴斯德畢赤酵母KM71H/pMHS476.1-1/1至-1/3的生長和纖溶酶原基因表達的誘導為製備預培養物(precultures)，100ml BMGY培養基(EasySelectTMPichia表達試劑盒操作說明)置於1L的Schikane燒瓶中，在28℃和250rpm(轉/每分鐘)條件下培養，至OD600達到20-30。然後，將預培養物以4645g(離心力)，在4℃下離心10分鐘。為了使菌體的溼潤團塊濃度達到80g/L，將收集的細菌重懸於BMMY-培養基(含0.5％甲醇)中。取60ml所述主要培養物於300ml的Schikane燒瓶中培養118小時，條件為28℃和250rpm。24和72小時後加入2％甲醇。Schikane燒瓶須以250rpm的高速搖轉，以給菌液提供充足的氧，這是使用AOX啟動子時必須的條件。
實施例1e使用鏈激酶激活後，在主要培養物上清液中檢測纖溶酶原的活性把主要培養物的樣品在16000g的條件下離心10分鐘。取300μl上清液，加入1μl鏈激酶(S8026)(Sigma，Deisenhofen)，在37℃條件下培養20min。在750μl的100mM(毫摩爾每升)的磷酸鈉緩衝液(pH＝8)、0.36mM CaCl2、0.9％NaCl中，加入100μl N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA溶液(9.5mg溶於75mg甘氨酸/10ml、2％吐溫(Tween)20)，37℃溫育10分鐘。加入250μl用鏈激酶預處理的上清液啟動反應，在37℃進一步溫育。在405nm處測量吸光值，表明消耗在增加。同時也測量作為對照的平行組巴斯德畢赤酵母KM71H培養物的上清液，和未用鏈激酶激活的上清液。例如，樣品經過72小時誘導後，檢測其活性值(1U/l定義為1升培養物上清液1分鐘內轉化1μmol N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA)為，KM71H/pMHS476.1-1/12U/l，KM71H/pMHS476.1-1/22U/l，KM71H/pMHS476.1-1/31U/l。經過誘導118小時後，檢測其活性值為，KM71H/pMHS476.1-1/17U/l，KM71H/pMHS476.1-1/29U/l，KM71H/pMHS476.1-1/38U/l。
實施例2a擴增賴氨酸纖溶酶原基因，所述基因5』端插入一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子用兩個寡核苷酸引物NO34和NO57(Seq.ID No.3)來擴增賴氨酸纖溶酶原基因，所述基因插入編碼一個Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，該擴增產物用於插入載體pPICZαA，擴增條件如實施例1a所述。寡核苷酸引物NO57在纖溶酶原基因的的互補鹼基旁，具有Kex2和Ste13酶切位點的密碼子。
實施例2b克隆實施例2a中擴增的賴氨酸纖溶酶原基因到pPICZαA載體中利用與實施例1b類似的方法，將人賴氨酸纖溶酶原基因克隆到載體pPICZαA中以生產融合基因，該融合基因由釀酒酵母α因子的前肽原基因和已插入蛋白酶Kex2和Ste13酶切位點密碼子的人纖溶酶原基因組成。獲得的質粒命名為pSM54.2(圖2)。經序列分析，確認序列(Seq.ID No.9)正確無誤。
實施例2c用質粒pSM54.2轉化巴斯德畢赤酵母如實施例1c中所述的轉化pMHS476.1的方法，用質粒pSM54.2轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株。獲得的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pSM54.2-1/a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
實施例2d巴斯德畢赤酵母KM71H/pSM54.2-1/1至-1/3的培養和纖溶酶原基因的誘導預培養物和主要培養物的生產，以及用甲醇誘導的方法，均與實施例1d中的類似。
實施例2e使用鏈激酶激活後，主要培養物的樣品中纖溶酶原活性的測定鏈激酶激活後的纖溶酶原的活性測定，見實施例1e中對於KM71H/pMHS476.1-1/1至-1/3的描述。誘導72小時後，樣品的活性值如下KM71H/pSM54.2-1/12U/l，KM71H/pSM54.2-1/28U/l，KM71H/pSM54.2-1/36U/l。誘導118小時後測得的活性值如下KM71H/pSM54.2-1/18U/l，KM71H/pSM54.2-1/217U/l，KM71H/pSM54.2-1/313U/l。
實施例3a擴增具有本身信號序列的纖溶酶原基因，並克隆到pPICZA載體中；轉化巴斯德畢赤酵母用兩個寡核苷酸引物NO34和NO37(Seq.ID No.4)來擴增纖溶酶原基因，該基因帶有編碼本身信號肽(前纖溶酶原)的序列，將擴增產物插入載體pPICZA，所使用的條件如實施例1a所述。
用類似實施例1b中所述的方法，將載體和PCR產物都用SfuI和KspI限制性內切酶酶切，然後把纖溶酶原基因克隆到pPICZA載體中。獲得的質粒命名為pSM49.8(圖3)。經序列分析，確認序列(Seq.ID No.11)正確無誤。
類似實施例1c中對pMHS476.1的描述，用質粒pSM49.8轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株。得到的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pSM49.8-1/a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
實施例4a擴增人穀氨酸纖溶酶原基因，並克隆到表達載體pPICZαA中，所述人穀氨酸纖溶酶原基因插入了Kex2酶切位點的密碼子；轉化巴斯德畢赤酵母使用兩條寡核苷酸引物NO34和NO35(Seq.ID No.5)，擴增穀氨酸纖溶酶原基因，並克隆到載體pPICZαA中，所述穀氨酸纖溶酶原基因插入了Kex2酶切位點的密碼子，所述過程所用條件如實施例1a所述。寡核苷酸引物NO35在穀氨酸纖溶酶原基因的互補序列旁具有Kex2酶切位點的密碼子。
將穀氨酸纖溶酶原基因克隆到載體pPICZαA中是為了生產融合基因，所述融合基因由釀酒酵母α因子的前肽原基因，和已插入蛋白酶Kex2酶切位點密碼子的人穀氨酸纖溶酶原基因組成，所述過程類似於實施例1b所述的克隆過程。
獲得的質粒命名為pSM82.1(圖4)。經序列分析，確認序列(Seq.IDNo.13)正確無誤。
類似實施例1c中對pMHS476.1的描述，用質粒pSM82.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株。得到的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pSM82.1/a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
實施例5a擴增人穀氨酸纖溶酶原的基因並克隆到表達載體pPICZa A，所述人穀氨酸纖溶酶原的基因在5』端插入編碼Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子；轉化巴斯德畢赤酵母利用兩個寡核苷酸引物NO34和NO56(Seq.ID No.6)，擴增穀氨酸纖溶酶原的基因，並克隆到表達載體pPICZa A中，所述穀氨酸纖溶酶原的基因插入了編碼Kex2和兩個Ste13酶切位點的密碼子，具體擴增條件見實施例1a。引物NO56在穀氨酸纖溶酶原基因的互補鹼基旁具有Kex2和Ste13酶切位點的密碼子。
將人穀氨酸纖溶酶原的基因克隆到載體pPICZa A中，以生產融合基因，該融合基因由編碼釀酒酵母的a因子的前肽原基因，和已插入編碼蛋白酶Kex2和Ste13酶切位點序列的人穀氨酸纖溶酶原基因組成，具體步驟與實施例1b中提到的步驟相似。獲得的質粒稱為pSM58.1(圖5)。通過序列分析，確認序列(Seq.ID No.15)正確無誤。
如實施例1c中所描述的pMHS476.1一樣，用質粒pSM58.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株，得到的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pSM58.1/a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
實施例6a從質粒pSM54.2中獲得人賴氨酸纖溶酶原基因，並插入到載體pPIC9K中用10U的每種限制性內切酶SacI和NotI(均來自RocheDiagnostics，曼海姆)切割150ng的載體pPIC9K(Invitrogen，Groningen，荷蘭)。用同樣的酶同樣切割300ng的纖溶酶原表達載體pSM54.2(見實施例2b)。然後用0.9％的瓊脂糖凝膠對經酶切的DNA片段進行電泳分離。用QIAgen凝膠純化試劑盒(QIAgen gel extraction kit，Qiagen，Hilden)將較大的片段純化出來。混合兩個較大的片段並在4℃，1U的T4DNA連接酶作用下連接過夜。
用與實施例1b中所述類似的方法，轉化大腸桿菌DH5α，對所得質粒進行純化和鑑定，但是，對於篩選轉化體的抗生素，以氨卞青黴素代替梅衣靈。這樣構建的質粒命名為pAC37.1(圖6)。
實施例6b用質粒pAC37.1轉化巴斯德畢赤酵母如實施例1c中所描述的用pMHS476.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株一樣，用質粒pAC37.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71，所述質粒pAC37.1己用SalI酶切使之線性化。轉化後的細胞接種到不含組氨酸的MD-瓊脂糖培養基中(參見多拷貝Pichia表達試劑盒(multi-copy pichiaexpression kit instruction manual)並進行培養。所得到的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
實施例6c巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/1的培養和纖溶酶原基因的誘導預培養物和主要培養物的生產和甲醇誘導的方法，與實施例1d中的描述的條件類似。誘導持續時間超過216個小時。最初用0.5％的甲醇誘導，24小時後改為2％甲醇，每48小時再加一次2％甲醇。
實施例6d鏈激酶激活後，主要培養物的樣品中纖溶酶原活性的測定鏈激酶激活後纖溶酶原活性的測定方法，與實施例1e中KM71H/pMHS476.1-1/1至1/3的活性測定方法一致。誘導120小時後取出的樣品的活性為120U/L；誘導216小時後，可測得的活性為190U/L。
實施例6e巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/1在基本培養基(BSM)中的誘導和鏈激酶激活後，主要培養物樣品中纖溶酶原活性的測定當在BMGY複合培養基(見實施例1d)培養巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/1後，將80克離心所得的細胞重新懸浮到100毫升包含基本鹽類的基本培養基中進行誘導。包含基本鹽類的培養基-基本培養基組分如下H3PO4，85％26.0ml/l；CaCl2·2H2O0.6g/l；K2SO418.0g/l；MgSO4·7H2O14.0g/l；KOH4.0g/l；甘油20ml/l；止泡劑1.0ml/l；微量元素溶液8.0ml/l；酵母生長素溶液(0.2g/l)8.0ml/l。
微量元素溶液的組成H2SO45.0ml/l；CuSO4·5H2O6.0g/l；KI0.08g/l；MnSO4·H2O3.0g/l；Na2MoO40.2g/l；H3BO30.02g/l；CoCl20.5g/l；ZnCl220.0g/l；FeSO4·7H2O65.0g/l。
為進行誘導，每天加入2％甲醇。鏈激酶激活後，纖溶酶原活性的測定方法，與實施例1e中測定KM71H/pMHS476.1-1/1至-1/3誘導後活性的測定方法一致。誘導120小時後，測定的纖溶酶原活性為193U/l，168小時後測定的活性為289U/l。
實施例6f在Klrhof纖維蛋白溶解試驗中測定主要培養物的樣品中，鏈激酶激活後纖溶酶原的活性Klrhof纖維蛋白溶解試驗[Stack，M.S.，Pizzo，S.V.，和Gonzalez-Gronow，M.(1992)Effect of desialylation on thebiological properties of human plasminogen.(去唾液酸對人纖溶酶原生物學特性的影響)，Biochem.J.284，81-86(13)]的準備如下將1.5克GTG低熔點瓊脂糖，通過煮沸溶解到75毫升50mM的pH＝7.4的磷酸鈉緩衝液中；將35ml纖維蛋白原溶液(每37.5ml 50mM的pH＝7.4的磷酸鈉緩衝液中溶解225mg的纖維蛋白原)與350μl凝血酶溶液(10U/ml，用50mM的pH＝7.4的磷酸鈉緩衝液配製)混合，勿產生氣泡；將混合溶液攪拌加入到所述瓊脂糖溶液中，然後倒入培養皿。纖維蛋白凝固以後在培養基上刻1mm大小的小孔。
為了測定鏈激酶激活後重組纖溶酶原的纖維蛋白溶解活性，在每個小孔中注入20μl組分如下的溶液，並在37℃培養20小時10.5mg/ml纖溶酶原(Roche，曼海姆)；2實施例6e中的KM71/pAC37.1-3/1的培養上清液；30.5mg/ml纖溶酶原，由鏈激酶激活；4由鏈激酶激活的實施例6e中的KM71/pAC37.1-3/1的培養上清液；50.25mg/ml纖溶酶原，由鏈激酶激活；6稀釋一倍的實施例6e中的KM71/pAC37.1-3/1的培養上清液，由鏈激酶激活；70.125mg/ml纖溶酶原，由鏈激酶激活；
8與實施例6e中KM71/pAC37.1-3/1同樣方法獲得的KM71H的培養上清液，由鏈激酶激活。
鏈激酶激活時，將2μl鏈激酶(100U/μl，Sigma，Deisenhofen)加入40μl所述各溶液中，37℃下孵育60分鐘。
由溶解纖維蛋白活性所產生的菌斑見圖10。
實施例6g通過親和層析純化纖溶酶原，該纖溶酶原由在巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/1重組產生將50ml實施例6c/6d中的巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/1的上清液在pH＝7.5的4升50mM磷酸鈉緩衝液中於4℃下透析。24小時後更換透析緩衝液，繼續透析24小時。透析後的產物用0.02μm孔徑的濾器過濾，然後用經過50mM、pH7.5的磷酸鈉緩衝液平衡的賴氨酸-瓊脂糖TM 4B柱(直徑16mm，高95mm)(Amersham Biosciences)進行親和層析。可以通過pH＝7.5的50mM磷酸鈉緩衝液、0.5M的氯化鈉去除柱上的非特異性結合的蛋白。結合的纖溶酶原可以用50mM、pH7.5的磷酸鈉緩衝液、0.01M的ε-氨基己酸洗脫。得到的樣品可以用7.5％的SDS-PAGE進行電泳，然後用銀染法染色(圖11)。在凝膠上，餾分中含有的重組的纖溶酶原與作為對照加入的人纖溶酶原處於同一位置。
圖11顯示了實施例6g中純化的餾分在7.5％的SDS-PAGE電泳的結果。圖11中所用的縮寫代表的含義如下M蛋白大小標準(從上至下為116kDa、66kDa、45kDa、35kDa)D透析液N未結合餾分W清洗餾分F1-F5為洗脫的包含纖溶酶原的餾分Plg纖溶酶原(American Diagnostica，Pfungstadt)實施例6h通過巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/1的發酵，來評價pH值和底物的影響將2ml甘油低溫處理的巴斯德畢赤酵母KM71/pAC37.1-3/1接種到50ml的YEP-G培養基(10克/升酵母提取物、20克/升酪蛋白腖、20克/升甘油)中，所述YEP-G培養基在不含Schikanes的1升寬頸搖瓶中。以30℃、300轉/分鐘的條件培養9個小時。然後將5ml的這種培養物接種到50ml MG培養基[5克/升不含胺基酸的酵母含氮鹼基(nitrgen base)、20克/升甘油、2.5毫升/升生物素溶液(0.2g/l)]中，所述MG培養基在不含Schikanes的1升寬頸搖瓶中。將該第二預培養物以30℃、300轉/分鐘的條件培養16個小時。將主要培養物在「stirrer-pro」(DASGIP，Jülich)多重發酵罐中進行發酵，這種裝置可以允許同時進行4個不同條件下的發酵。因此，將15毫升的第二預培養接種到150ml BSM培養基中(見實施例6e)。在加完一定劑量的底物後，在pH＝6下開始進行發酵，努力維持該pH。不同培養條件下平行進行的發酵的結果見表1表1

在實驗IV的培養基中加入了30克/升的蛋白腖。在甲醇開始作用前，先加入供給甘油的培養基[500克/升無水甘油、10毫升/升微量元素溶液、10毫升/升生物素溶液(見實施例6e)]以24毫升/小時的恆定速度持續4個小時。實驗I、II和IV中的項目組合是由下面的這個公式來確定劑量函數，f(x)＝P1+(P2/1+exp(-P3(t-P4))))+(P5/(1+exp(-P6(t-P7))))，其中P1＝0，P2＝0.7，P3＝0.2，P4＝15，P5-P6＝P7＝0。從表1中可以看出，中性pH且混合甲醇和甘油劑量下所得到的纖溶酶原濃度最高。
實施例7a從pAC37.1獲得賴氨酸纖溶酶原基因，並插入到pGAPZaA中將150ng載體pGAPZαA(Invitrogen，Groningen，荷蘭)用10U的限制性內切酶XhoI和NotI(均來自Roche Diagnostics，曼海姆)進行酶切。同時也用這兩個酶切300ng的纖溶酶原表達載體pAC37.1(見實施例6a)。用0.9％的瓊脂糖對酶切後的DNA片段進行凝膠電泳分離。將pAC37.1酶切後得到的2715個鹼基(bp)長的纖溶酶原基因片段，和pGAPZαA酶切後得到的3073個鹼基長的片段，用QIAgen凝膠純化試劑盒純化(Qiagen，Hilden)。然後混合這兩個片段並在4℃、1U的T4DNA連接酶的作用下連接過夜。
轉化大腸桿菌DH5α，得到質粒的純化和鑑定方法與實施例1b中的方法類似。但是，用氨卞青黴素代替梅衣靈來篩選轉化體。所構建的質粒命名為pJW9.1(圖7)。
實施例7b用質粒pJW9.1轉化巴斯德畢赤酵母如實施例1c中用pMHS476.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株的方法一樣，用質粒pJW9.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株，轉化前先用內切酶BlnI將pJW9.1線性化。轉化後的細胞塗板於含有100微克/毫升梅衣靈的YPDS-瓊脂上(EasySelectTMPichia表達試劑盒使用手冊)並培養。所得到的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pJW9.1-a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
實施例7c通過巴斯德畢赤酵母KM71H/pJW9.1-3的發酵培養，在不同甘油供給速度下來評價pH值預培養物和在「stirrer-pro」中的發酵培養方法見實施例6i，所得結果見表2。
表2

同樣，在中性pH條件下發酵得到的結果最好，從表中也可以清楚地看出，底物劑量(供給速度)對產物形成的影響。
實施例7d巴斯德畢赤酵母KM71H/pJW9.1-3的發酵將巴斯德畢赤酵母KM71H/pJW9.1-3接種到50ml的YEP-G培養基(10克/升酵母提取物、20克/升酪蛋白腖、20克/升甘油)中，所述YEP-G培養基在不含Schikanes的1升寬頸瓶中，以30℃、300轉/分鐘的條件培養9個小時。然後將10ml的所述培養物接種到40ml MG培養基(5克/升不含胺基酸的酵母含氮鹼基、20克/升甘油、2.5毫升/升生物素溶液(0.2g/l)中，所述MG培養基在不含Schikanes的1升寬頸瓶中。以30℃、300轉/分鐘的條件培養所述培養物16個小時。
將上述的30毫升培養物接種到3升的BSM-培養基(見實施例6e)，然後在7.5升的發酵罐(型號Labfors，Infors AG，CH)中發酵。發酵溫度為25℃，氣體恆定供給速度為3.2升/分鐘。24小時後加入甘油溶液[500克/升甘油、10毫升/升微量元素溶液、10毫升/升生物素溶液(見實施例6e)]。在發酵過程中，供應劑量的速度，從10毫升/小時逐步增加到45毫升/小時。250小時後，在鏈激酶激活條件下可以測得1375U/L的纖溶酶原的活性。
實施例8纖溶酶原激活劑的鑑定測定了24種市售的蛋白酶的激活纖溶酶原的活性。實驗反應的體系為100mM pH＝8.0的磷酸鈉緩衝液、0.36mM CaCl2、0.9％NaCl。
如果提供的蛋白酶是粉末，則溶解到緩衝液中；如果是溶液，則直接使用，可以根據需要用緩衝液稀釋。將25μl的蛋白酶溶液與本發明的25μl的纖溶酶原溶液(20mg/ml)混合併在37℃條件下溫育10分鐘。然後通過水解底物N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA的方法，來測定纖溶酶的活性。具體方法是取200μl的底物溶液[9.5毫克的N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA溶解於75毫克甘氨酸/10毫升和2％吐溫20中]加入到850μl緩衝液中，然後與50μl先前溫育的纖溶酶原-蛋白酶溶液混合，並繼續在37℃條件下溫育。消耗的增加程度，可以通過測405nm下的光吸收值來測定。消耗是由於蛋白酶所致。在測定消耗時，使用類似的預溫育的緩衝液和蛋白酶的混合物，來代替預溫育的纖溶酶和蛋白酶的混合物。
灰色鏈黴菌(S.griseus)蛋白酶、蛋白酶VIII、蛋白酶XXIII、蛋白酶XIX、蛋白酶XVIII、無花果蛋白酶、金屬內肽酶、梭菌蛋白酶、Glu-C內蛋白酶、蛋白酶XIII、糜木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶X、菠蘿蛋白酶、舒血管素和蛋白酶A均購自Sigma公司，Deisenhofen；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、Asp-N內蛋白酶、中性蛋白酶I、Lys-C內蛋白酶、凝血酶和彈性蛋白酶均購自Roche，曼海姆；蛋白酶K購自QIAGEN，Hilden。製備的各蛋白酶儲存液的濃度見表3。稀釋係數F表明為進行測定而將蛋白酶儲存液稀釋的倍數。
激活後，可以測定下列纖溶酶的活性(1U/mg＝每分鐘每毫克蛋白質轉化1μmol的N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA)表3

*對於以下的酶，沒有檢測到纖溶酶原的活性蛋白酶XXIII、蛋白酶XIX、糜木瓜蛋白酶、Lys-C內蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶I、蛋白酶X、菠蘿蛋白酶、舒血管素和蛋白酶K。
實施例9藥物製劑下面這些實施例中所用到的重組的功能性纖溶酶原，都是通過本發明的創新方法得到的。根據這種意義而言，「纖溶酶原」指重組的微-、小-、賴氨酸-和穀氨酸纖溶酶原，而「纖溶酶」指蛋白水解切割重組的微-、小-、賴氨酸-和穀氨酸纖溶酶原而得到的纖溶酶。可以用相同的纖溶酶原激活劑激活微-、小-、賴氨酸-和穀氨酸纖溶酶原，尤其是上面所描述的纖溶酶原激活蛋白酶，但也不局限於這些例子；激活劑和纖溶酶原(微-，小-，賴氨酸-和穀氨酸纖溶酶原)的比例約是1∶1000。
可以通過蛋白水解方法激活纖溶酶原，即這些本專利申請中提到的蛋白酶作為組織型纖溶酶原激活劑的尿激酶，或蛋白酶VIII、灰色鏈黴菌蛋白酶等蛋白酶；也可以通過和鏈激酶或者葡激酶形成複合物，從而激活纖溶酶原。
實施例9a藥物製劑水凝膠水凝膠的基本組分(100克)纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U羥乙基纖維素10000 3.5克可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.4％，PHB酯0.1％)純淨水加至100.0克選擇性地，可以分別用羥丙甲纖維素(hypromellose)或甲基纖維素代替羥乙基纖維素，所述羥丙甲纖維素或甲基纖維素的用量為0.5-15.0克。
凝膠纖溶酶原 1000U纖溶酶原激活劑 1U甘油(85％) 150.0克羥乙基纖維素10000 32.5克可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.4％，PHB酯0.1％)不含乳酸鹽的林格液 加至1000.0克或者是100克凝膠包括纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑 0.1U羥乙基纖維素30000 2.5克甘油(85％) 10.0克可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.2％，PHB酯0.1％)純淨水 加至100.0克或者是100克凝膠包含纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑 0.1U多聚丙烯酸 1克丙二醇 8克中聚甘油三酯 8克二乙胺(調節pH) 適量可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.2％，PHB酯0.1％)2-丙醇 0-1克水 加至100克親水性軟膏(聚乙二醇軟膏)50克包含纖溶酶原 50U纖溶酶原激活劑0.05U聚乙二醇400 30.0克聚乙二醇4000 10.0克可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.2％，PHB酯0.1％)純淨水加至50.0克或者是無水聚乙二醇軟膏100克包含纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U聚乙二醇300 50克聚乙二醇1500 加至100克或者是吸水性軟膏纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U十六烷基硬脂醇29克石蠟，粘性34克凡士林，白色 100克疏水性軟膏纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U凡士林80.0克稀液體石蠟加至100克疏水膏劑纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U羥丙甲纖維素400 20克凡士林，白色 加至100克或者是纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U卡波姆(例如聚羰乙烯974p) 15克石蠟，粘性40克凡士林，白色 加至100克乳酯(creme)纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U中聚甘油三酯 20克乳化十六烷基硬脂醇10克羊毛脂10克山梨醇10克可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.2％，PHB酯0.1％)純淨水加至100克非離子親水性乳脂纖溶酶原 100U纖溶酶原激活劑0.1U軟酯醇20克
2-豆蔻酸乙酯10克85％甘油6克山梨酸鉀0.14克檸檬酸 0.07克水 加至100克非離子性乳脂纖溶酶原100U纖溶酶原激活劑 0.1U聚山梨酸酯605克十六烷基硬脂醇 10克85％甘油10克凡士林，白色25克可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.2％，PHB酯0.1％)水 加至100克脂質體製劑纖溶酶原100U纖溶酶原激活劑 0.1U大豆卵磷脂、雞卵磷脂15克可選組分(山梨酸/山梨酸鉀0.1-0.2％，PHB酯0.1％或重氮聯苯脲1-2克)水 加至100.0克膠囊一粒0.25克粉末/顆粒的膠囊，包含纖溶酶原5U纖溶酶原激活劑 0.005U澱粉0.1克二氧化矽 0.02克硬脂酸鎂 0.002克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 0.015克檸檬酸三乙酯 0.0005克滑石粉 0.001克微晶體纖維素 加至0.25克或者是一粒0.25克粉末/顆粒的膠囊，包含纖溶酶原 5U纖溶酶原激活劑 0.005U二氧化矽 0.01克硬脂酸鎂 0.002克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 0.015克檸檬酸三乙酯 0.0001克滑石粉 0.001毫克甘露醇 加至0.25克丸劑100毫克粒狀丸劑包含纖溶酶原 5U纖溶酶原激活劑 0.005U澱粉 30毫克二氧化矽 2毫克硬脂酸鎂 4毫克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 5毫克檸檬酸三乙酯 0-1毫克滑石粉 0.00001毫克微晶體纖維素 加至100毫克小藥丸100克小藥丸包含纖溶酶原2000U纖溶酶原激活劑 2U澱粉20克硬脂酸蔗糖 20克二氧化矽2克硬脂酸鎂3克聚乙烯吡咯烷酮 0-1克聚甲基丙烯酸酯共聚多酯/聚甲基丙烯酸 5克滑石粉 0.2克檸檬酸三乙酯0.1克微晶體纖維素加至100克針劑纖溶酶原500U纖溶酶原激活劑 0.5U乙醇0-1克丙二醇 10克聚乙二醇0-1克氯化鈉 適量可選緩衝液(磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩衝液)純淨水 加至100毫升在所述製劑中，可以使用產生相同活性量的纖溶酶來代替微-、小-、賴氨酸-或穀氨酸-纖溶酶原。如果直接使用纖溶酶，那麼藥物製劑中則不需要含有纖溶酶原激活劑。
實施例9b藥物製劑a)水凝膠水凝膠的基本組分(100克)纖溶酶100U羥乙基纖維素400 2.5-5克純淨水加至100.0克膨脹時間需要1至3小時。
每克水凝膠中可以含有1-1000U的纖溶酶。
b)親水性軟膏親水性軟膏的基本組成(1000克)纖溶酶1000U無水甘油 85.0克羥乙基纖維素10000 32.5克可選擇加入聚煙酸肌醇(polyhexanide)2重量％不含乳酸鹽的林格液加至1000.0克聚煙酸肌醇可以作為抑制微生物生長的活性物質而被選擇性地加入，但不超過總重的0.2％。可以加入羥乙基纖維素400(如TyloseH 300或Natrosol 250HX PHARM)來代替羥乙基纖維素10000(Natrosol 250HXPHARM)。
每克軟膏可以含有1-10000U的纖溶酶。
c)軟膏軟膏的基本組成(50克)纖溶酶 50U聚乙二醇40030.0-32.5克聚乙二醇400012.5-7.5克純淨水 加至50.0克製備將12.5克聚乙二醇4000和30.0克聚乙二醇400(也可使用7.5克聚乙二醇4000和32.5克聚乙二醇400)混合放入軟膏盤，熱水加浴直至聚乙二醇熔化。冷卻後，可加入適量按照本發明所述方法生產的纖溶酶原，該纖溶酶原已溶解於7.5克純淨水中，然後均質化。
d)膠囊0.5克膠囊的基本組成纖溶酶原5U乳糖0.42克澱粉0.06克硬脂酸鎂0.02克每個膠囊可以含有0.1-100U的纖溶酶。
e)針劑/輸液100ml的基本組成纖溶酶 500U乙醇0.01克丙二醇 30毫升純淨水 加至100ml每毫升溶液可以含有1-500U的纖溶酶。
可以用上述活性單位量的微-、小-、賴氨酸-、穀氨酸-纖溶酶原取代纖溶酶，如果同時加入至少一種纖溶酶原激活劑，所述加入的纖溶酶原激活劑與纖溶酶原之比應在1∶10000到1∶100之間，優選1∶1000，所述量為纖溶酶原的活性量。
實施例10a擴增不同形式的小纖溶酶原、微纖溶酶原基因，並克隆到載體pPICZaA中；轉化巴斯德畢赤酵母。
小纖溶酶原、微纖溶酶原是比全長纖溶酶原短的衍生物，缺少N端結構域，但仍然具有被活化成為纖溶酶的活性。為了將小纖溶酶原、微纖溶酶原基因擴增並克隆到載體pPICZαA中，設計了3』端引物NO34和不同的5』端引物NO36a-j(序列號No.19至28)，擴增的條件與實施例1a中所描述的條件一致。除了與纖溶酶原基因的互補鹼基外，寡核苷酸引物NO36a、c、e、j、i還具有Kex2酶切位點的密碼子；引物NO36b、d、f、h、j，則在Kex2酶切位點密碼子的下遊加入了兩個Ste13的酶切位點的密碼子。引物NO34上還有KspI酶切位點，而引物NO36 a-j則含有XhoI酶切位點。
將小纖溶酶原、微纖溶酶原基因克隆到載體pPICZαA中的方法，與實施例1b中的方法類似，只是載體和特定PCR產物都用限制性內切酶XhoI和KspI來酶切。所用引物、得到的纖溶酶原衍生物的名稱、編碼的蛋白酶切位點、所得質粒的名稱和分泌出的纖溶酶原衍生物N端胺基酸的名稱，都歸納於下表。

*指的是由810個胺基酸構成的前纖溶酶原(Seq.ID No.12)。
圖8顯示了例子質粒pPLG1.1。
如實施例1c中的用pMHS476.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株方法一樣，用pPLG1.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株，得到的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pPLG1.1-1/a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
根據產生KM71H/pPLG1.1-1/a菌株的方法，利用以下質粒產生不同的菌株pPLG2.1、pPLG3.2、pPLG4.2、pPLG5.3、pPLG6.1、pPLG7.1、pPLG8.3、pPLG9.1或pPLG10.1。
寡核苷酸引物NO36a-jNO36a AAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTGNO36b AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTGNO36c AAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTGNO36d AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTGNO36e AAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTGNO36f AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTGNO36g AAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTGNO36h AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTGNO36i AAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCCNO36j AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC實施例10b擴增不同形式的小-、微-纖溶酶原基因，並克隆到載體pGAPZaA中；將其轉化巴斯德畢赤酵母。
為了將小-、微-纖溶酶原基因擴增並克隆到載體pGAPZαA中，設計了3』端引物NO34和不同的5』端引物NO36a-j(Seq.ID No.19至28)，擴增的條件與實施例1a中所描述的條件一致。寡核苷酸引物NO36a、c、e、j、i在纖溶酶原基因的互補鹼基旁具有Kex2酶切位點的密碼子；引物NO36b、d、f、h、j則在Kex2酶切位點密碼子的下遊加入了兩個Ste13的酶切位點的密碼子。引物NO34上還有KspI酶切位點，而引物NO36a-j則含有XhoI酶切位點。
將小-、微-纖溶酶原基因克隆到載體pGAPZαA的方法，與實施例1b中的方法類似，只是載體和PCR產物都用限制性內切酶XhoI和KspI酶切。所用引物、纖溶酶原衍生物的名稱、編碼的蛋白酶切位點、所得質粒的名稱和分泌出的纖溶酶原衍生物N端胺基酸的名稱，都歸納於下表。

*指的是由810個胺基酸構成的前纖溶酶原(Seq.ID No.12)。
圖9顯示了例子質粒pPLG11.2。
如實施例7a中用pJW9.1轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株的方法一樣，用pPLG11.2轉化巴斯德畢赤酵母KM71H株，轉化前先用內切酶BlnI切割質粒使之線性化。所得的克隆命名為巴斯德畢赤酵母KM71H/pPLG11.2-1/a，此處「a」仍然代表從1開始的克隆的連續編號。
根據產生KM71H/pPLG1.1-1/a菌株的方法，利用以下質粒產生不同的菌株pPLG12.1、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2和pPLG20.1。
序列記錄序列1寡核苷酸引物NO34AAAAACCGCGGTCAATTATTTCTCATCACTCCC序列2寡核苷酸引物NO36AAAAACTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTG序列3寡核苷酸引物NO57AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTG序列4寡核苷酸引物NO37AAAAATTCGAAAAATGGAACATAAGGAAGTGG序列5寡核苷酸引物NO35AAAAACTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTAT序列6寡核苷酸引物NO56AAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTAT序列7人賴氨酸纖溶酶原融合基因，其含有Kex2蛋白酶切位點的密碼子，和釀酒酵母α因子的信號序列的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAG
AGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGA
GGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTzGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列8人賴氨酸纖溶酶原融合蛋白，其含有Kex2蛋白酶切位點和釀酒酵母α因子的信號肽MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列9人賴氨酸纖溶酶原融合基因，其含有Kex2蛋白酶切位點、兩個Ste3蛋白酶切位點的密碼子，和釀酒酵母α因子的信號肽序列ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC
TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列10人賴氨酸纖溶酶原融合蛋白，其含有Ste3、Kex2蛋白酶切位點，和釀酒酵母α因子的信號肽。
MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*
序列11人前纖溶酶原基因ATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGT
GCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列12人前纖溶酶原MEHKEVVLLLLLFLKSGQGEPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECF
ITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列13人穀氨酸纖溶酶原融合基因，其含有Kex2蛋白酶切位點的密碼子，和釀酒酵母α因子的信號序列ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACA
GGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列14人穀氨酸纖溶酶原融合蛋白，其含有Kex2蛋白酶切位點，和釀酒酵母α因子的信號肽MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEE
CMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列15人穀氨酸纖溶酶原融合基因，其含有Kex2、兩個Ste13蛋白酶切位點的密碼子，和釀酒酵母α因子的信號肽基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGA
GAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGAC
AAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列16人穀氨酸纖溶酶原融合蛋白，其含有Kex2、Ste13酶切位點，和釀酒酵母α因子的信號肽MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAEPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列17分泌到培養基中的穀氨酸纖溶酶原的序列(pSM49.8、pSM58.1和pSM82.1)EPLDDYVNTQGASLFSVTKKQLGAGSIEECAAKCEEDEEFTCRAFQYHSKEQQCVIMAENRKSSIIIRMRDVVLFEKKVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTK
NGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列18分泌到培養基中的賴氨酸纖溶酶原的蛋白序列(pMHS476.1、pSM54.2、pAC37.1和pJW9.1)。
KVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEECMHCSGENYDGKISKTMSGLECQAWDSQSPHAHGYIPSKFPNKNLKKNYCRNPDRELRPWCFTTDPNKRWELCDIPRCTTPPPSSGPTYQCLKGTGENYRGNVAVTVSGHTCQHWSAQTPHTHNRTPENFPCKNLDENYCRNPDGKRAPWCHTTNSQVRWEYCKIPSCDSSPVSTEQLAPTAPPELTPVVQDCYHGDGQSYRGTSSTTTTGKKCQSWSSMTPHRHQKTPENYPNAGLTMNYCRNPDADKGPWCFTTDPSVRWEYCNLKKCSGTEASVVAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADR
TECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列19寡核苷酸引物NO36aAAAAACTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTG序列20寡核苷酸引物NO36bAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTG序列21寡核苷酸引物NO36cAAAAACTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTG序列22寡核苷酸引物NO36dAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTG序列23寡核苷酸引物NO36eAAAAACTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTG序列24寡核苷酸引物NO36fAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTG序列25寡核苷酸引物NO36gAAAAACTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTG序列26寡核苷酸引物NO36hAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTG
序列27寡核苷酸引物NO36iAAAAACTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCC序列28寡核苷酸引物NO36jAAAAACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCC序列29小纖溶酶原(pPLG1.1和pPLG2.1)APPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列30微纖溶酶原(pPLG3.2和pPLG4.2)KLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列31微纖溶酶原(pPLG5.3和pPLG6.1)。
LYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFV
TWIEGVMRNN*序列32微纖溶酶原(pPLG7.1和pPLG8.3)。
APSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列33微纖溶酶原(pPLG9.1和pPLG10.1)。
SFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列34pPICZαA中的釀酒酵母α因子的DNA序列，該序列位於Kex2酶切位點的上遊ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAG序列35pPICZαA中的釀酒酵母α因子的胺基酸序列，所述序列位於Kex2酶切位點的上遊MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLE
序列36Kex2酶切位點的DNA序列AAAAGA序列37Ste13酶切位點的DNA序列GAGGCTGAAGCT序列38Kex2酶切位點的胺基酸序列KR序列39Ste13酶切位點的胺基酸序列EAEA序列40由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG1.1中的人小纖溶酶原、Kex2酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPRAGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列41由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG2.1中的人小纖溶酶原、Kex2酶切位點、兩個Ste1酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAPPPVVLLPDVETPSEEDCMFGNGKGYRGKRATTVTGTPCQDWAAQEPHRHSIFTPETNPR
AGLEKNYCRNPDGDVGGPWCYTTNPRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWI EGVMRNN*序列42由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG3.2中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列43由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG4.2中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點、兩個Ste13酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAKLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列44由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG5.3中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRLYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHS
WPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列45由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG6.1中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點、兩個Ste13酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEALYDYCDVPQCAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列46由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG7.1中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列47由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG8.3中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點、兩個Ste13酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAAPSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVI
ENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列48由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG9.1中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKRSFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列49由以下序列組成的胺基酸序列質粒pPLG10.1中的人微纖溶酶原、Kex2酶切位點、兩個Ste13酶切位點和釀酒酵母α因子的前肽原MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEASFDCGKPQVEPKKCPGRVVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFGMHFCGGTLISPEWVLTAAHCLEKSPRPSSYKVILGAHQEVNLEPHVQEIEVSRLFLEPTRKDIALLKLSSPAVITDKVIPACLPSPNYVVADRTECFITGWGETQGTFGAGLLKEAQLPVIENKVCNRYEFLNGRVQSTELCAGHLAGGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYVRVSRFVTWIEGVMRNN*序列50由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG1.1中的人小纖溶酶原基因、Kex2酶切位點的密碼子和釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAG
GACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列51由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG2.1中的人小纖溶酶原基因，Kex2酶切位點和Ste13酶切位點的密碼子，以及釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGG
GGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列52由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG3.2中的人微纖溶酶原基因、Kex2酶切位點的密碼子和釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT
TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列53由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG4.2中的人微纖溶酶原基因，Kex2酶切位點和Ste13酶切位點的密碼子，以及釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列54由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG5.3中的人微纖溶酶原基因，Kex2酶切位點的密碼子和釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTA
TTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列55由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG6.1中的人微纖溶酶原基因，Kex2酶切位點和Ste13酶切位點的密碼子，以及釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTG
GTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列56由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG7.1中的人微纖溶酶原基因、Kex2酶切位點的密碼子和釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列57由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG8.3中的人微纖溶酶原基因、Kex2酶切位點和Ste13酶切位點的密碼子，以及釀酒酵母α因子前肽原的基因
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列58由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG9.1中的人微纖溶酶原基因、Kex2酶切位點的密碼子和釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGATCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCC
TTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列59由以下序列組成的核酸序列質粒pPLG10.1中的人微纖溶酶原基因、Kex2酶切位點和Ste13酶切位點的密碼子，以及釀酒酵母α因子前肽原的基因ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
序列60質粒pPLG1.1和pPLG2.1中的人小纖溶酶原基因的核酸序列。
GCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列61質粒pPLG3.2和pPLG4.2中的人微纖溶酶原基因的核酸序列AAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGA
GTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列62質粒pPLG5.3和pPLG6.1中的人微纖溶酶原基因的核酸序列CTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列63質粒pPLG7.1和pPLG8.3中的人微纖溶酶原基因的核酸序列GCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGC
AATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列64質粒pPLG9.1和pPLG10.1中的人微纖溶酶原基因的核酸序列TCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列65人穀氨酸纖溶酶原基因的核酸序列GAGCCTCTGGATGACTATGTGAATACCCAGGGGGCTTCACTGTTCAGTGTCACTAAGAAGCAGCTGGGAGCAGGAAGTATAGAAGAATGTGCAGCAAAATGTGAGGAGGACGAAGAATTCACCTGCAGGGCATTCCAATATCACAGTAAAGAGCAACAATGTGTGATAATGGCTGAAAACAGGAAGTCCTCCATAATCATTAGGATGAGAGATGTAGTTTTATTTGAAAAGAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAG
ACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTCAGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCT
TGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA序列66人賴氨酸纖溶酶原基因的核酸序列AAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGAGTGTTGTAGCACCTCCGCCTGTTGTCCTGCTTCCAGATGTAGAGACTCCTTCCGAAGAAGACTGTATGTTTGGGAATGGGAAAGGATACCGAGGCAAGAGGGCGACCACTGTTACTGGGACGCCATGCCAGGACTGGGCTGCCCAGGAGCCCCATAGACACAGCATTTTCACTCCAGAGACAAATCCACGGGCGGGTCTGGAAAAAAATTACTGCCGTAACCCTGATGGTGATGTAGGTGGTCCCTGGTGCTACACGACAAATCCAAGAAAACTTTACGACTACTGTGATGTCCCTCAGTGTGCGGCCCCTTCATTTGATTGTGGGAAGCCTCAAGTGGAGCCGAAGAAATGTCCTGGAAGGGTTGTGGGGGGGTGTGTGGCCCACCCACATTCCTGGCCCTGGCAAGTC
AGTCTTAGAACAAGGTTTGGAATGCACTTCTGTGGAGGCACCTTGATATCCCCAGAGTGGGTGTTGACTGCTGCCCACTGCTTGGAGAAGTCCCCAAGGCCTTCATCCTACAAGGTCATCCTGGGTGCACACCAAGAAGTGAATCTCGAACCGCATGTTCAGGAAATAGAAGTGTCTAGGCTGTTCTTGGAGCCCACACGAAAAGATATTGCCTTGCTAAAGCTAAGCAGTCCTGCCGTCATCACTGACAAAGTAATCCCAGCTTGTCTGCCATCCCCAAATTATGTGGTCGCTGACCGGACCGAATGTTTCATCACTGGCTGGGGAGAAACCCAAGGTACTTTTGGAGCTGGCCTTCTCAAGGAAGCCCAGCTCCCTGTGATTGAGAATAAAGTGTGCAATCGCTATGAGTTTCTGAATGGAAGAGTCCAATCCACCGAACTCTGTGCTGGGCATTTGGCCGGAGGCACTGACAGTTGCCAGGGTGACAGTGGAGGTCCTCTGGTTTGCTTCGAGAAGGACAAATACATTTTACAAGGAGTCACTTCTTGGGGTCTTGGCTGTGCACGCCCCAATAAGCCTGGTGTCTATGTTCGTGTTTCAAGGTTTGTTACTTGGATTGAGGGAGTGATGAGAAATAATTGA
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序列表110N-酶生物技術有限公司120在微生物中生產重組蛋白質的方法130P04TK074108140
141
150EP 02 002 716.51512002-02-06150US60/357,8091512002-02-2116066170PatentIn Ver.2.1210121133212DNA213智人(Homo sapiens)4001aaaaaccgcg gtcaattatt tctcatcact ccc 33210221137212DNA213智人4002aaaaactcga gaaaagaaaa gtgtatctct cagagtg 37210321149212DNA213智人4003aaaaactcga gaaaagagag gctgaagcta aagtgtatct ctcagagtg 49210421132212DNA213智人4004aaaaattcga aaaatggaac ataaggaagt gg 32
210521135212DNA213智人4005aaaaactcga gaaaagagag cctctggatg actat35210621147212DNA213智人4006aaaaactcga gaaaagagag gctgaagctg agcctctgga tgactat 4721072112400212DNA213智人4007atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta240tctctcgaga aaagaaaagt gtatctctca gagtgcaaga ctgggaatgg aaagaactac300agagggacga tgtccaaaac aaaaaatggc atcacctgtc aaaaatggag ttccacttct360ccccacagac ctagattctc acctgctaca cacccctcag agggactgga ggagaactac420tgcaggaatc cagacaacga tccgcagggg ccctggtgct atactactga tccagaaaag480agatatgact actgcgacat tcttgagtgt gaagaggaat gtatgcattg cagtggagaa540aactatgacg gcaaaatttc caagaccatg tctggactgg aatgccaggc ctgggactct600cagagcccac acgctcatgg atacattcct tccaaatttc caaacaagaa cctgaagaag660aattactgtc gtaaccccga tagggagctg cggccttggt gtttcaccac cgaccccaac720aagcgctggg aactttgcga catcccccgc tgcacaacac ctccaccatc ttctggtccc780acctaccagt gtctgaaggg aacaggtgaa aactatcgcg ggaatgtggc tgttaccgtt840tccgggcaca cctgtcagca ctggagtgca cagacccctc acacacataa caggacacca900gaaaacttcc cctgcaaaaa tttggatgaa aactactgcc gcaatcctga cggaaaaagg960gccccatggt gccatacaac caacagccaa gtgcggtggg agtactgtaa gataccgtcc1020tgtgactcct ccccagtatc cacggaacaa ttggctccca cagcaccacc tgagctaacc1080cctgtggtcc aggactgcta ccatggtgat ggacagagct accgaggcac atcctccacc1140accaccacag gaaagaagtg tcagtcttgg tcatctatga caccacaccg gcaccagaag1200accccagaaa actacccaaa tgctggcctg acaatgaact actgcaggaa tccagatgcc1260gataaaggcc cctggtgttt taccacagac cccagcgtca ggtgggagta ctgcaacctg1320aaaaaatgct caggaacaga agcgagtgtt gtagcacctc cgcctgttgt cctgcttcca1380gatgtagaga ctccttccga agaagactgt atgtttggga atgggaaagg ataccgaggc1440aagagggcga ccactgttac tgggacgcca tgccaggact gggctgccca ggagccccat1500agacacagca ttttcactcc agagacaaat ccacgggcgg gtctggaaaa aaattactgc1560cgtaaccctg atggtgatgt aggtggtccc tggtgctaca cgacaaatcc aagaaaactt1620tacgactact gtgatgtccc tcagtgtgcg gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa1680gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt gtgggggggt gtgtggccca cccacattcc1740tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg1800atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca1860tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa1920atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta1980agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta atcccagctt gtctgccatc cccaaattat2040
gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc actggctggg gagaaaccca aggtactttt2100ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc2160tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc accgaactct gtgctgggca tttggccgga2220ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa2280tacattttac aaggagtcac ttcttggggt cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt2340gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact tggattgagg gagtgatgag aaataattga24002108211799212PRT213智人4008Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser1 5 10 15Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln20 25 30Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe35 40 45Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu50 55 60Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val65 70 75 80Ser Leu Glu Lys Arg Lys Val Tyr Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn85 90 95Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr100 105 110Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro115 120 125Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro130 135 140Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys145 150 155 160Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His165 170 175Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly180 185 190Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr195 200 205Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg210 215 220Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn225 230 235 240
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1.一種在微生物中重組生產功能性纖溶酶原的方法，所述方法至少包括以下步驟a)將至少編碼纖溶酶原的功能部分的核酸序列與至少編碼一段信號肽的核酸序列融合，為了切割信號肽，所述編碼功能性纖溶酶原的核酸序列和至少編碼信號肽的核酸序列由蛋白酶的酶切位點密碼子偶聯。
2.如權利要求1所述的重組生產方法，其中，所述至少編碼纖溶酶原的功能部分的核酸序列包含纖溶酶原的蛋白水解結構域，或其變異體或片段。
3.如權利要求1或2所述的重組生產方法，其中，所述至少編碼纖溶酶原的功能部分的核酸序列編碼穀氨酸纖溶酶原或賴氨酸纖溶酶原。
4.如權利要求1至3任一項所述的重組生產方法，其中，所述至少編碼一段信號肽的核酸序列編碼前肽原、前肽或原肽；和/或所述密碼子編碼蛋白酶Kex2和/或Ste13的酶切位點。
5.如權利要求4所述的重組生產方法，其特徵在於，所述編碼至少一段信號肽的核酸序列編碼α因子的信號肽，或釀酒酵母的SUC2、PHA-E或PHO1的信號肽。
6.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，生產出至少為20mg/l的功能性穀氨酸纖溶酶原或賴氨酸纖溶酶原。
7.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，在經過120小時的處理後，生產出至少為120U/l的功能性賴氨酸纖溶酶原。
8.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其中，用於擴增的兩條寡核苷酸引物選自NO36a(Seq.ID No.19)、NO36b(Seq.ID No.20)、NO36c(Seq.ID No.21)、NO36d(Seq.ID No.22)、NO36e(Seq.ID No.23)、NO36f(Seq.ID No.24)、NO36g(Seq.ID No.25)、NO36h(Seq.ID No.26)、NO36i(Seq.ID No.27)或NO36j(Seq.ID No.28)。
9.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其中，用於擴增的兩條寡核苷酸引物選自NO34(Seq.ID No.1)、NO36(Seq.ID NO.2)、NO57(Seq.ID No.3)、NO37(Seq.ID No.4)、NO35(Seq.ID No.5)、NO56(Seq.ID No.6)；以及選自NO36a(Seq.ID No.19)、NO36b(Seq.ID No.20)、NO36c(Seq.ID No.21)、NO36d(Seq.ID No.22)、NO36e(Seq.ID No.23)、NO36f(Seq.ID No.24)、NO36g(Seq.ID No.25)、NO36h(Seq.ID No.26)、NO36i(Seq.ID No.27)或NO36j(Seq.ID No.28)。
10.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其中，將步驟a)產生的融合產物整合到表達載體中，該表達載體適用於微生物。
11.如權利要求10所述的重組生產方法，其中，所述的表達載體適用於真菌。
12.如權利要求10或11所述的重組生產方法，其中，所述的表達載體包含誘導型啟動子或組成型啟動子。
13.如權利要求10或11所述的重組生產方法，其中，所述的表達載體包含巴斯德畢赤酵母的組成型GAP啟動子。
14.如權利要求12所述的重組生產方法，其特徵在於，所獲得的核酸是質粒，優選所述質粒選自pPLG11.2、pPLG12.1、pPLG13.1、pPLG14.2、pPLG15.1、pPLG16.3、pPLG17.2、pPLG18.1、pPLG19.2、pPLG20.1、pAC37.1、pJW9.1、pMHS476.1、pSM54.2、pSM49.8、pSM82.1或pSM58.1。
15.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，所述密碼子編碼蛋白酶Kex2的酶切位點；所述纖溶酶原的融合基因具有如下所示的核酸序列Seq.ID No.7、13、50、52、54、56或58。
16.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，所述密碼子編碼蛋白酶Kex2的酶切位點；所述纖溶酶原的融合蛋白具有如下所示的胺基酸序列Seq.ID No.8、14、40、42、44、46或48。
17.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，所述密碼子編碼蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位點；所述纖溶酶原的融合基因具有如下所示的核酸序列Seq.ID No.9、15、51、53、55或57。
18.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，所述密碼子編碼蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位點；所述纖溶酶原的融合蛋白具有如下胺基酸序列Seq.ID No.10、16、41、43、45、47或49。
19.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其中，用權利要求14的方法中所述的質粒轉化所述微生物宿主。
20.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其中，所使用的宿主為真核微生物。
21.如權利要求20所述的重組生產方法，其特徵在於，所使用的宿主屬於真菌屬。
22.如權利要求21所述的重組生產方法，其特徵在於，所使用的宿主屬於畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、漢森酵母屬(Hansenula)、念珠菌屬(Candida)或麴黴屬(Aspergillus)。
23.如權利要求22所述的重組生產方法，其特徵在於，所使用的宿主屬於以下種巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、黑麴黴(Aspergillus niger)、米麴黴(Aspergillus oryzae)或構巢麴黴(Aspergillus nidulans)。
24.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其中過表達的核酸序列至少編碼纖溶酶原的功能部分，而且所述至少纖溶酶原的功能部分由一種宿主微生物分泌，該宿主微生物由步驟a)產生的融合產物轉化得到。
25.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其中，所述纖溶酶原核酸序列的功能部分是下列序列之一Seq.ID No.60、61、62、63、64、65或66。
26.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，生產出一種功能性人纖溶酶原。
27.如前述任一項權利要求所述的重組生產方法，其特徵在於，生產出一種與人類同源的功能性纖溶酶原。
28.一種質粒，其為質粒pPLG11.2、質粒pPLG12.1、質粒pPLG13.1、質粒pPLG14.2、質粒pPLG15.1、質粒pPLG16.3、質粒pPLG17.2、質粒pPLG18.1、質粒pPLG19.2或質粒pPLG20.1。
29.一種質粒，其為質粒pMHS476.1、質粒pSM54.2、質粒pSM49.8或質粒pSM82.1。
30.一種質粒，其為質粒pSM58.1、質粒pAC37.1或質粒pJW9.1。
31.根據權利要求1至27中任一項所述的重組生產方法獲得的核酸序列，其特徵在於，至少編碼纖溶酶原功能部分的核酸序列與在酵母中具有活性的啟動子可操作性偶聯；所述至少編碼纖溶酶原功能部分的核酸序列還和至少編碼一段信號肽的核酸序列偶聯，所述編碼功能性纖溶酶原的核酸序列和至少編碼信號肽的核酸序列由蛋白酶Kex2和Ste13的酶切位點密碼子偶聯。
32.纖溶酶原，該纖溶酶原由權利要求1至27中的任一項所述的重組生產方法獲得。
33.如權利要求32所述的纖溶酶原，其特徵在於，所述纖溶酶原為微纖溶酶原、小纖溶酶原、賴氨酸纖溶酶原、穀氨酸纖溶酶原或纖溶酶原衍生物。
34.如權利要求33所述的纖溶酶原衍生物，其特徵在於，該衍生物包含纖溶酶原的功能性蛋白水解結構域，並包含至少一個缺失，和/或至少一個胺基酸置換，和/或與至少另一個胺基酸或至少一段肽或至少一個蛋白質融合。
35.如權利要求33或34所述的纖溶酶原衍生物，其特徵在於，所述衍生物被至少一種纖溶酶原激活劑激活為具有活性的纖溶酶。
36.如權利要求33至35任一項所述的纖溶酶原衍生物，其特徵在於，所述衍生物至少包含纖溶酶原的功能性蛋白水解結構域並且與微纖溶酶原、小纖溶酶原、賴氨酸纖溶酶原或穀氨酸纖溶酶原的同源性高於80％，優選高於90％，特別優選高於95％。
37.纖溶酶，該纖溶酶由至少一種纖溶酶原激活劑激活權利要求32-36任一項所述的纖溶酶原或纖溶酶原衍生物獲得。
38.宿主微生物，該宿主微生物含有根據權利要求1至27任一項所述的方法在步驟a)中得到的融合產物或由其衍生的任一核酸序列。
39.如權利要求38所述的宿主微生物，其特徵在於，該宿主微生物選自下列微生物巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、釀酒酵母、多形漢遜酵母、黑麴黴、米麴黴或構巢麴黴。
40.根據權利要求1至27任一項所述的方法生產的功能性纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶在製備藥劑中的應用。
41.根據權利要求1至27任一項所述的方法生產的功能性纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶在製備用於治療創傷、血栓事件或預防血栓事件的藥物中的應用。
42.根據權利要求1至27任一項所述的方法生產的功能性纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶在作為抗血栓活性劑和抗凝結活性劑中的應用。
43.如權利要求42所述的應用，該應用尤其為預防和/或治療以下疾病心臟病發作、中風、血栓形成、靜脈血栓、心瓣膜術後再狹窄、缺氧、缺血、凝固性壞死、血管炎症、急性肺栓塞、急性和亞急性動脈血栓、新發性的或陳舊性的靜脈血栓凝結、臀部和肢端深靜脈血栓、閉塞血管區域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纖溶酶原缺乏導致的結膜炎、燒傷、鹼或酸灼傷和凍傷、休克時瀰漫性血管內凝血、急性肢端動脈栓塞、慢性閉塞性動脈病、動靜脈短路處血栓形成；以下疾病的後續治療心臟病發作、搭橋手術、血管形成術、球囊擴張術；急性心臟病發作的溶栓治療；動靜脈短路的再通；急性心臟病發作時，對堵塞的冠狀動脈再灌注。
44.如權利要求40至43任一項所述的應用，其中聯合使用所述的功能性纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶，和抗凝劑。
45.如權利要求44所述的應用，其特徵在於，所述抗凝劑為肝素、肝素衍生物或乙醯水楊酸。
46.根據權利要求1至27任一項所述的方法生產的功能性纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶在加入到敷料、膏劑中的應用或與創傷藥聯合使用中的應用。
47.敷料、創傷用繃帶或膏劑，該敷料、創傷用繃帶或膏劑含有根據權利要求1至27任一項所述的方法生產的功能性纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶。
48.如權利要求47所述的敷料、創傷用繃帶或膏劑，其中每平方釐米藥物製劑中含有0.01-500U的纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶，優選為0.1-250U，特別優選為1-150U。
49.權利要求47或48所述的敷料、創傷用繃帶或膏劑在製備用於治療燒傷、凍傷、鹼或酸灼傷、損傷和/或創傷的藥物中的應用。
50.藥物組合物，該藥物組合物含有權利要求1至27任一項所述的方法生產的功能性纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶，和藥物學上可接受的載體、添加劑和/或溶劑，如果需要也含有活性抗凝劑。
51.如權利要求50所述的藥物組合物，該藥物組合物適用於以下用藥途徑口服、局部或胃腸外、血管內、腹膜內、皮下、或肌肉內，所述血管內優選靜脈內。
52.如權利要求51所述的藥物組合物，在局部用藥時，每克所述藥物組合物含有0.01-500U纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶，優選為0.1-250U，特別優選為1-150U。
53.如權利要求51所述的藥物組合物，在口服用藥時，每克所述藥物組合物含有0.1-100,000U纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶，優選為100-80,000U，特別優選為1,000-50,000U。
54.如權利要求51所述的藥物組合物，在注射或輸液用藥時，每10ml溶液含有0.1-100百萬U纖溶酶原和/或由其得到的纖溶酶，優選為1-10百萬U，特別優選為3-5百萬U。
55.如權利要求50至54任一項所述的藥物組合物在製備用於治療以下疾病的藥物中的應用預防和/或治療以下疾病心臟病發作、中風、血栓形成、靜脈血栓、心瓣膜術後再狹窄、缺氧、缺血、凝固性壞死、血管炎症、急性肺栓塞、急性和亞急性動脈血栓、新發性的或陳舊性的靜脈血栓凝結、臀部和肢端深靜脈血栓、閉塞血管區域的早期血栓形成、急性眼中央血管栓塞、I型纖溶酶原缺乏導致的結膜炎、燒傷、鹼或酸灼傷和凍傷、休克時瀰漫性血管內凝血、急性肢端動脈栓塞、慢性閉塞性動脈病、動靜脈短路處血栓形成；以下疾病的後續治療心臟病發作、搭橋手術、血管形成術、球囊擴張術；急性心臟病發作的溶栓治療；在動靜脈短路的再通；在急性心臟病發作時，對堵塞的冠狀動脈再灌注。
56.載體，該載體包含由權利要求1中步驟a)得到的融合產物或由其衍生出的核酸序列。
57.DNA分子，該DNA分子包含由權利要求1中步驟a)得到的融合產物或由其衍生出的核酸序列。
58.RNA分子，該RNA分子包含由權利要求1中步驟a)得到的融合產物或由其衍生出的核酸序列。
59.鑑定纖溶酶原激活劑的篩選方法，該方法使用權利要求36或37所述的功能性纖溶酶原。
60.如權利要求59所述的篩選方法，其特徵在於，在將蛋白酶與權利要求35或36所述的功能性纖溶酶原預孵育後，檢測得到的纖溶酶的活性。
61.如權利要求59或60所述的篩選方法，其特徵在於，使用合成肽作為底物，來檢測得到的纖溶酶的活性。
62.如權利要求61所述的篩選方法，其特徵在於，使用合成肽N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA來檢測得到的纖溶酶的活性。
全文摘要
本發明公開了一種在微生物中生產重組功能性纖溶酶原的方法，和一種鑑定纖溶酶原激活劑的方法。編碼纖溶酶原的功能部分的核酸序列與至少編碼一段信號肽的核酸序列融合。編碼功能性纖溶酶原的核酸分子和編碼信號肽的核酸分子由蛋白酶的酶切位點密碼子偶聯，所述蛋白酶的酶切位點密碼子確保信號肽的切割。適當施用含有所述重組纖溶酶原或相應纖溶酶的製劑，可治療慢愈性或難愈性創傷。
文檔編號A61K38/48GK1768138SQ03803326
公開日2006年5月3日 申請日期2003年2月6日 優先權日2002年2月6日
發明者魯迪·舒希洛, 漢斯·克裡斯琴·科廷, 漢斯·貢特爾·加森, 馬丁·希爾斯, 拉爾夫·帕斯特納克 申請人:N-酶生物技術有限公司