Cntf家族拮抗物的製作方法

2023-08-10 16:38:21 2

專利名稱：Cntf家族拮抗物的製作方法
雖然由於不同的生物學活性而得以發現，但是纖毛神經營養因子(CNTF)，白血病抑制因子(LIF)，oncostatin M(OSM)和白介素6(IL-6)包含於一個新近定義的細胞因子家族(在此指細胞因子「CNTF」家族)。這些細胞因子由於它們遠緣的結構相似性[Bazan，J.Neuron 7197-208(1991)；Rose and Bruce，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888641-8645(1991)]，而且也許更重要的是因為它們共享「β」信號轉導組分[Baumann，etal.，J.Biol.Chem.26519853-19862(1993)；Davis.et al.，Science 2601805-1808(1993)；Gearing et al.，Science2551434-1437(1992)；lp et al.，Cell 691121-1132(1992)；Stahl，et al.，J.Biol.Chem.2687628-7631(1993)；Stahl and Yancopoulos，Cell 74587-590(1993)]。而歸於一類。該細胞因子家族可以由這些β組分的同二聚體化或異二聚體化而進行受體激活。[Davis，et al.，Science 2601805-1808(1993)；Murakaml，et al.，Science 2601808-1810(1993)；Stahl and Yancopoulos，Cell 74587-590(1993)]。IL-6受體激活需要gp130同二聚體化[Murakaml，et al.，Science 2601808-1810(1993)；Hibi，et al.，Cell 631149-1157(1990)]，gp130是一種蛋白，它最初被鑑定為IL-6信號轉換部[Hibi，et al.，Cell 631149-1157(1990)]。由gp130和被稱為LIFR β的第二個gp130相關蛋白之間的異二聚體化而引起CNTF LIF和OSM受體激活[Davis，et al.，Science 2601805-1808(1993)]。LIFR β最初由於它結合於LIF而得以鑑定[Gearing et al.，EMBO J.102839-2848(1991)]。
在β組分之外，這些細胞因子之中幾個還需要決定特異性的「α」組分。與β組分相比，「α」組分在其組織分布上更受限制，因而決定了特定細胞因子的細胞靶點[Stahl and Yancopoulos，Cell74587-590(1993)]。因此，LIF和OSM是廣泛作用因子，它們可能僅需應答細胞上gp130和LIFR的出現，而CNTF則需要CNTFR α[Stahl and Yancopoulos，Cell 74587-590(1993)]，IL-6需要IL-6Rα[Kishimoto，et al.，Science 258593-597(1992)]。CNTFRα(Davis et al.，Science 2591736-1739(1993)和IL-6Rα[Hibi，et al.，Cell 631149-1157，Murakami et al.，Science 2601808-1810(1990)；Taga，et al.，Cell 58573-581(1989)]作為可溶性蛋白而起作用，這與這一學說相一致它們並不與胞內信號分子相互作用，而是輔助它們的配體與合適的信號轉導β亞基相互作用[Stahl and Yancopoulos，Cell 74587-590(1993)]。
來自其它細胞因子系統的另外的證據也支持這一學說二聚體化提供了一種共同機制，藉此機制所有細胞因子受體起始信號轉導。關於這點生長激素(GH)可能能夠作為最好的例證。晶體學研究揭示每個GH分子包含兩個不同的受體結合位點，這兩個位點都可被受體的同一結合域所識別，使得單個GH分子接合了兩個受體分子[deVos，et al，Science 255306-312(1992)]。二聚體化順次發生，GH上的位點I首先結合於受體分子，然後結合於第二個受體分子[Fuh，et al.，Science 2561677-1680(1992)]。關於促紅細胞生成素(EPO)受體的研究結果與二聚體化在受體激活過程中的重要性相一致，因為藉助於改變一個胺基酸而導入一個半胱氨酸殘基，從而造成二硫鍵相聯的同二聚體，使得EPO受體被組成性地激活[Watowich，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892140-2144(1992)]。
在以β亞基的同或異二聚體化作為受體激活的關鍵步驟之外，第二個重要的特點是由細胞因子CNTF家族形成最終受體複合物，該複合物的形成藉助於一種通過配體有順序的與受體組分逐個結合的機制[Davis，et al.，Science 2601805-1808(1993)]。因而CNTF首先與CNTFRα形成一個複合物，該複合物隨後與gp130結合以形成並不足以產生信號的中間產物(在此叫做αβ1中間產物)，因為在最終補充LIFRβ以形成起始信號轉導的β組分的異二聚體之前，它僅有一個單個的β組分。雖然一個類似的包含結合於IL-6Rα的IL-6和gp130的單個分子的中間產物還沒有被直接分離得到，通過與其遠親CNTF類比，以及激活的IL-6受體複合物補充了兩個gp130單體的事實我們推斷上述中間產物並不存在，總之，這些發現引起關於遺傳的細胞因子受體複合物(Figune 1)的結構的建議每個細胞因子可有多至3個受體結合位點一個位點結合於任選的α特異性決定組分(α位點)，一個位點結合於第一個β信號轉導組分(β1位點)，以及一個位點結合於第二個β信號轉導組分(β2位點)[Stahl and Yancopoulos，Cell 74587-590(1993)]。這3個位點被順次使用，在最後步驟中形成複合物——導致β組分二聚體化--這對於起始信號轉導來說，是關鍵性的[Davis，et al.，Science 2601805-1818(1993)]。受體激活的細節的知曉和對於CNTF非功能性β1中間產物的存在，引出這樣的發現在一些情況下CNTF是IL-6的高度親和拮抗物，並提供了在下面詳盡描述的設計細胞因子CNTF家族的配體或基於受體的拮抗物的戰略基礎。
一旦細胞因子結合誘導了受體複合物的形成、β組分二聚體化激活胞內酪氨酸激酶活性，引起多種底物磷酸化[Ip et al.，Cell691121-1132(1992)；Nakajima and Nall，Mol.Cell.Biol.111409-1418(1991)]。酪氨酸激酶的激活看來對於下遊事件是關鍵性的，因為封阻酪氨酸磷酸化的抑制劑也阻止了晚期事件，例如基因誘導的發生[Ip et al.，Cell 69121-1132(1992)，Nakajima and Wall，Mol.Cell.Biol.111409-1418(1991)]。近來，我們證實了一個新近發現的非受體酪氨酸激酶家族，包括Jak1，Jak2及Tyk2(稱為Jak/Tyk激酶) [Firmbach-Knaft，et al.，Oncogene 51329-1336(1990)；Wilks et al.，Mol.Cell.Biol.112057-2065(1991)]以及與其它細胞因子一同捲入了信號轉導[，et al.，Cell 74237-244(1993)；Silvennoinen，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(in press；1993)；Velazquez，et al.，Cell 70313-322(1992)；Witthuhn，et al.，Cell 74227-236(1993)]。在沒有配體的情況下，預先結合gp130和LIFRβ的β亞基的胞漿域，在配體加入時，變為酪氨酸磷酸化的和激活的[Stahl，et al.，Science(submitted；(1993)]。因而這些激酶看來是由配體在細胞外結合引起的胞內信號轉導在細胞內激活的最接近的一步。在下面描述了基於此系統的，用於篩選具有特異激動物或拮抗物活性的小分子收集物的試驗系統。
細胞因子的CNTF家族在很多生理過程中起重要作用，因而具有作為拮抗物和激動物在治療中應用的潛能。
發明概要本發明的一個目的是生產可用於治療IL-6相關疾病和紊亂的IL-6拮抗劑。
本發明的另一目的是在此描述的IL-6拮抗劑在治療骨質疏鬆中的應用。
本發明的另一目的是在此描述的IL-6拮抗劑在治療癌症，包括多發性骨髓瘤的首發及繼發效應中的應用。
而本發明的中另一目的是在此描述的IL-6拮抗劑在治療惡性病質中的應用。
本發明的另一目的是建立一種篩選體系，這種體系用於鑑定細胞因子CNTF家族成員的新的激動劑或拮抗劑。
本發明的另一目的是建立一種篩選體系，這種體系用於鑑定作為細胞因子CNTF家族成員的激動劑或拮抗劑的小分子。
這些和其他目的都通過使用CNTF家族受體組分以形成非功能性中間產物而實現，這些中間產物具有IL-6和CNTF拮抗劑治療活性，以及在用於鑑定CNTF細胞因子家族成員的新激動劑和拮抗劑的試驗體系的實用性。
附圖簡述

圖1遺傳的細胞因子受體模型中受體組分的順序結合。本模型指出細胞因子最多含有3個受體結合位點，通過首先與任選的組分結合隨之與β1結合，然後與β2結合而與它們的受體組分相互作用。許多細胞因子受體的β組分通過近膜區(陰影方塊)與Jak/Tyk家族的胞漿蛋白酪氨酸激酶相互作用。只有當β組分二聚體化時才起始信號轉導。正如所示的β組分和Jak/Tyk激酶酪氨酸磷酸化。圖2CNTF抑制PC12細胞系(稱為PC12D)中IL-6應答。PC12表達IL6Rα、gp130、CNTFRα，但不表達LIFRβ。將無血清培養的PC12D與在如圖所示的加入或不加入CNTF的情況下加上IL-6(50ng/ml)溫育。如圖所示一些板上也加入了可溶性IL6Rα(1mg/mL)或可溶性CNTFRα(1mg/mL)細胞溶胞物用抗-gp130抗體進行免疫沉澱，用抗磷酸酪氨酸抗體進行免疫印跡。gp130的酪氨酸磷酸化是IL-6誘導的IL-6受體系統激活的指徵，這種激活在同加入CNTF時被封阻。圖3碘標記CNTF結合於PC12D細胞的Scatchard分析。在加入或不加入過量非放射活性競爭物的情況下，將PC12D細胞與不同濃度的碘標CNTF溫育，從而確定特異性結合。圖中出示了碘標CNTF特異性結合的量的Satchard曲線，並給出數據。數據與解離常數分別是9pM和3.4nM兩個結合位點相一致。
發明詳述本發明基於為細胞因子例如CNTF細胞因子家族所共有的受體組分，提供了一類新的拮抗物。
這一項發明仔細考慮了針對使用了α特異性決定組分的任何細胞因子的拮抗物的產生，當該組分與細胞因子結合後，結合到第一個β信號轉導組分而形成非功能性中間產物，然後結合到第二個β信號轉導組分而引起β受體的二聚體化，緊接著進行信號轉導，根據本發明，受體的可溶性α特異性決定組分和細胞因子受體(β1)的第一β信號轉導組分的胞外域結合而形成異二聚體，通過結合細胞因子而形成非功能性複合物，對細胞因子行使拮抗物的功能。
象例1所描述的那樣，CNTF和IL-6共有β1受體組分gp130。CNTF與CNTFRα和gp130形成一個中間產物的事實可以在缺乏LIFRβ的細胞系中得以證明。在這一細胞系中，CNTF和CNTFRα的複合物結合gp130，而阻礙了gp130通過IL-6和IL-6Rα的同二聚體化，因此阻斷了信號轉導。這些研究為IL-6拮抗物的發展提供了一個基礎，正象他們所顯示的那樣，如果在一個配體存在的情況下，一個由配體它的α受體組分和β1受體組分構成的非功能性的中間複合物能夠形成的話，將很有效地阻止配體激活。其它的細胞因子可能使用其它的β1受體組分，例如LIFRβ，根據本發明，也可被用來產生拮抗物。
例如在本發明的實施方案中，IL-6或CNTF的有效的拮抗物由其受體(sIL-6Rα和sCNTFRα)的α特異性決定組分的胞外域與gp130的胞外域的異二聚體構成。這個如此生成的異二聚體在此分別稱為sIL-6Rα∶β1和sCNTFRα∶β1，各自作為IL-6和CNTF的高度親和的陷阱，使細胞因子不能和其受體的天然的膜結合形式接近，形成信號轉導複合物。
雖然來源受體胞外部分的可溶配體結合域已被證明對配體在某些程度上有效地作為陷阱來行使拮抗物的功能[Bargetzi，et al.，Cancer Res.534010-4013(1993)；et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 898616-8620(1992)；Mobler，et al.，J.Innunol.1511548-1561(1993)；Narazaki，et al.，Blood821120-1126(1993)]，但IL-6和CNTF受體是不一般的，因為α受體組分組成了配體結合域，和它們的配體聯合共同以可溶性形式有效地行使受體拮抗物的功能[Davis，et al.Science 2591736-1739(1993)；Taga，et al.，Cell 58573-581(1989)]。根據本發明sRα∶β1異二聚體為配體提供了有效的陷阱，以微微克分子的範圍的親和力結合配體(根據CNTF和PC12D細胞的結合研究)，而不產生功能性的中間複合物。
這一α和β受體胞外域可根據本領域技術人員所公知的方法而製備出來。CNTFRα受體已經被克隆，測序和表達出來[Davis，et al.(1991)Science 25359-63所有文獻在此引入作為參考]。LIFRβ和gp130克隆已經在(Gearing et al.in EMBO J.102839-2848(1991)，Hibi，et al.Cell 631149-1157(1990)and in published PCT application WO 93/10151published May 27，1993，所有文獻在此全文引入作為參考)有所記載。
對實施本發明有用的受體分子可以通過被克隆並在原核或真核表達系統中表達而製備。重組的受體基因可利用任一方法被表達和純化出來。編碼因子的基因可以被亞克隆到細菌表達載體，例如PCP110，但並不限於此。
重組因子可以任何能夠隨後形成穩定的生物學活性蛋白的技術被純化出來。例如但不限於，因子可以作為可溶蛋白或作為包涵體而從細胞中回收，其中後者可通過8M鹽酸胍和滲析的方法定量地分離。為了進一步純化因子，可採用傳統的離子交換層析，疏水反應層析，反相層析或凝膠過濾。
sRα∶β異二聚體受體可以使用所知的融合域來構建，如描述了β受體異二聚體的產生的於1993年5月27日公開的PCT申請WO 93/10151「Oncostatin M和白血病抑制因子的受體」所描述的那樣，或通過化學方法將胞外域交叉聯接而製備。這一所利用的域可以由完整的α、β組分的胞外域構成，或其是保持和其配體或其它sRα∶β1複合物中的組分形成複合物的能力的突變體或片段。
在本發明的一個實施方案中，使用亮氨酸拉鏈來構建胞外域，人的轉錄因子c-jun和c-fos的亮氨酸拉鏈域已被表明可以1∶1的化學計量學比例形成穩定的異二聚體結構[Busch and Sassone-Corsi，Trends Genetics 636-40(1990)；Gentz，et al.，Science 2431695-1699(1989)]。雖然jun-jun同二聚體也可以形成，但與jun-fos異二聚體比較起來，穩定性只及後者的1/1000，fos-fos同二聚體沒有被檢測到。
通過遺傳工程嵌合基因，在讀碼框內將c-jun或c-fos亮氨酸拉鏈域融合在以上所提到的受體組分的可溶性或胞外域的c端。這種結合可以是直接的，或通過一個柔性連接物域，例如人IgG的絞鏈區，或由小胺基酸例如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或丙氨酸以不同長度和組合方式構成的多肽連接物。另外，這一嵌合蛋白可以由His-His-His-His-His-His(His6)，SEQ ID NO.1]標記，使之能夠通過金屬螯合層析迅速純化，和/或可能得到抗體的抗原決定簇進行標記，使之進行蛋白印跡、免疫沉澱或活性缺失/封阻的生物分析進行探測。
在另一實施方案中，sRα∶β1異二聚體可以使用相同的方法來構建，只是使用人IgG1的Fc域[Aruffo，et al.，Cell 6735-44(1991)]。和後者不同，異二聚體的形成必須通過生物化學的方法來獲得，因為載有Fc-域的嵌合分子將作為二硫鍵連接的同二聚體表達。因此在這種傾向間二硫鍵斷裂而對內二硫鍵無影響的條件下，同二聚體被減少。然後將含有不同胞外部分的單體以等克分子量混合，氧化形成同或異二聚體的混合物。混合物組分通過層析分開。或者，通過遺傳工程和表達分子的途徑使這類異二聚體更傾向於形成，表達分子包含受體組分的可溶性或胞外部分，人IgG的Fc域，c-jun或c-fos亮氨酸拉鏈域[Kostelny，et al.，J.Immunol.1481547-1553(1992)]。由於這些亮氨酸拉鏈易形成異二聚體，他們可以用來驅動所需異二聚體的形成，對於以上描述的使用亮氨酸拉鏈的嵌合蛋白，也可以用金屬螯合物成抗原決定簇來標記。標記的域可以通過金屬螯合層析進行快速純化，和/或通過抗體進行蛋白印跡、免疫沉澱或進行活性缺損/封阻的生物分析進行探測。
在本發明另一實施方案中，sRα∶β1異二聚體通過作為利用柔性連接物環嵌合分子表達而得以製備。一個編碼此嵌合蛋白的DNA構建物被如此設計使得它所表達的2個可溶性或胞外域蛋白通過一個柔性環串聯(頭碰頭)融合。這個環可以是完全人工的，(例多聚甘氨酸重複序列被絲氨酸或蘇氨酸以特定間隔打斷)或從自然出現的蛋白借用(例如hIgG的絞鏈區)。工程化分子中，可溶性或胞外域的融合順序可以改變(例如，sIL6Rα/loop/gp130或sgp130/loop/sIL-6Rα)，和/或環的長度和組成是變化的，以利於所需特徵的分子的選擇。
或者，根據本發明，異二聚體可以從合適的α、β組分共轉染的細胞系中純化出來，異二聚體可以本領域技術人員所熟知方法從同二聚體中分離出來，例如限量的異二聚體可通過從製備型非變性的聚丙烯醯胺膠上被動洗脫分出來而得以回收。或者異二聚體也可使用高壓陽離子交換層析被純化，通過Mono S陽離子交換柱獲得很好的純化效果。
除了sRα∶β1異二聚體通過結合游離的CNTF或IL-6作為拮抗劑外，本發明考慮使用工程的突變的IL-6變體，它具有一些新特性；它可以結合到IL-6Rα和一個單一的gp130分子，但不能結合第二個gp130完成β組分的同二聚體化。因此可以作為任一IL-6應答細胞的IL-6拮抗物。IL-6和CNTF受體複合物結構模型表明這些細胞因子對α、β1和β2受體組分有不同的結合位點[Sathl and Yancopoulos，Cell 74587-590(1993)]，包含這些位點的每一個位點上的關鍵的胺基酸殘基的突變產生了新的分子，它們具有所需的拮抗性質。β1位點的切除將產生出一個分子，它仍可與α受體組分結合，但不與β1組分結合，這樣可以形成納克分子親和力的拮抗物，包括IL-6的β2位點(IL-6β2)的關鍵胺基酸殘基的突變將形成一類分子，它將結合到IL-6Rα和第一個gp130單體上，但不能結合第二個gp130，因此功能性失活。同樣，CNTFβ2位點的突變將形成一分子(CNTFβ2-)，它將結合CNTFRα和gp130，但不能結合ILFRβ，因此通過形成非功能性的β1中間產物而拮抗CNTF作用，根據以上CNTF形成具有高度親和力的β1中間體的結合的結果，CNTFβ2-和IL-6β2-將構成親和力在10pM範圍內的拮抗物。
很多方法可用來產生和鑑定具有所需要的特性的IL-6或CNTF的突變株。使用常規方法對編碼IL-6或CNTF的DNA進行隨機突變，然後收集產物進行分析來鑑定具有如下描述的期望的新特性的突變細胞因子廣泛地使用遺傳工程方法進行突變以便闡明重組蛋白功能域的結構組成，幾種不同的對於刪除或替代突變的探索已經在某些文獻中描述過，最成功的方法是使用丙氨酸掃描突變[Cunningham andWells(1989)，Science 2441081-1085]和同聚物掃描突變[Cunningham et al.，(1989)，Science 2431330-1336]。
用此方法進行IL-6或CNTF核酸序列靶突變以產生CNTFβ2或IL-6β2-待選物，適於靶突變位點的區域的選擇系統地完成，或者是這樣一項研究，藉助於抗各因子的單克隆抗體對細胞因子區域作出圖譜，該區域在細胞因子與α受體成分單獨結合或與αβ1異二聚體可溶性受體結合時是暴露的。同樣的，對單獨或以上述結合α受體組分或αβ1異二聚體的可溶受體的複合物形式存在的細胞因子，進行化學修飾或有限蛋白酶水解，然後對所保護或暴露區域的分析可以揭示潛在的β2結合位點。
對於鑑定具有所期望活性的CNTF或IL-6突變株的分析涉及在合適的應答細胞系中高親和力地封阻IL-6或CNTF反應的能力[Davis，et al.Science 2591736-1739(1993)；Murakamiet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8811349-11353(1991)]，這樣的分析包括CNTF或IL-6所驅使的細胞增殖，存活或DNA合成，或細胞系的構建，此細胞系中因子的結合誘導了報導蛋白的產生，例如CAT或β-半乳糖苷酶[Savino，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904067-4071(1993)]。
此外，不同突變體的性質可以通過基於受體的分析方法進行評價。一個這樣的方法包括使用抗原決定簇標記的sRα∶β1試劑對上述突變體就其對上述sRα∶β2受體異二聚體結合的能力進行篩選[Davis et al.，Science 25359-63(1991)]。通過一個抗原決定簇標記的可溶性β2試劑是否在α∶β1異二聚體存在時與細胞因子結合，來探知β2位點的存在或缺失。例如，在CNTFRα和gp130[Davis，et al.Science 2601805-1808(1993)；Stahl，et al.J.Biol.Chem.2687628-7631(1993)]存在時，CNTF只結合於ILFRβ(β2組分)上。因此，在可溶性sRα∶β1二聚體CNTFRα∶β1存在時，一種可溶性ILFRβ試劑僅與CNTF結合。對於IL-6，sRα∶β1試劑為IL-6Rα∶β1，β2位點的探針是抗原決定基標記的sgp130。因此，CNTF的β2-突變體應被確認為與sRα∶β1試劑結合的那些分子，這表明雖然細胞因子的α和β1位點是完整的，然而它卻不能結合β2試劑。
此外，本發明還提供一種通過測量β-受體組分或信號轉導組分的磷酸化來探查或測量潛在的β2-突變體活性的方法，這些組分選自Jak1、Jak2和Tyk2或任一其它信號轉導組分，例如CLIPs。已確定這些組分響應於細胞因子CNTF家族的某個成員，而被磷酸化。
表達在此描述的信號轉導組分的細胞，可以是天然的或基因工程促使其表達。例如，用Veiazquez等[Cell，Vol.70313-322(1992)]描述的Jak1和Tyk-2編碼核酸序列，然後可通過轉導、轉染、微注射、電穿孔、動物轉基因等任何已知的方法導入細胞。
根據本發明，將細胞經潛在拮抗物處理，將β-組分或信號轉導組分的酪氨酸磷酸化過程與同一組分在無拮抗物條件下的酪氨酸磷酸化相比較。
本發明還進行了用潛在拮抗物接觸上述細胞導致的酪氨酸磷酸化與同一細胞經母系CNTF家族成員處理的酪氨酸磷酸化的比較。依據這種分析，細胞必須是要麼表達細胞外受體(α-組分)，要麼在可溶性受體組分存在時經試驗試劑處理。這樣，在一個設計用來鑑定CNTF激動劑或拮抗劑的試驗體系中，細胞可以表達CNTFRα的α-組分、gp130β-組分與LIFRβ，以及某個信號轉導組分，如Jak1。把該細胞經試劑處理，把β-組分或信號轉導組分的酪氨酸磷酸化與CNTF存在時產生的磷酸化方式進行比較。或者，比較加入試劑處理後的酪氨酸磷酸化與無試劑情況。又如對於一個試驗體系，如IL-6的試驗體系，該體系牽涉到將細胞同與可溶性IL-6受體連接的試劑接觸，該細胞表達gp130β-組分和諸如Jak1、Jak2或Tyk2的信號轉導組分。
在本發明的另一實施方案中，用以上途徑建立了一種篩選方法，用以篩選在配體結合、受體複合物形成及接下來的信號轉導過程的各步中起作用的小分子拮抗劑。通過評估對可溶性受體與配體之間如上文所述的複合物形成的介入潛在介入配體-受體相互作用的分子而篩選。或者，為鑑定潛在拮抗劑，在IL-6或CNTF誘發報告基因響應的基於細胞的試驗中，對小分子或天然產物庫篩選。那些顯示拮抗活性的分子在響應其他因子(如GMCSF或類似神經營養因子-3能激活受體酪氨酸激酶的因子)的基於細胞的試驗中再篩選以評價對CNTF/IL-6/OSM/LIF因子家族的特異性。這些基於細胞的篩選用於鑑定抑制信號轉導過程中的靶點之任一的拮抗劑。
在一個這樣的試驗體系中，拮抗劑的特異性靶點是激酶的Jak/Tyk家族[Firmbach-Kraft，Oncogene 51329-1336(1990)；Wilks，et al.，Mol.Cell.Biol.112057-2065(1991)]與受體β亞基的相互作用。如上所述，LIFRβ和gp130與胞質蛋白酪氨酸激酶的Jak/Tyk家族成員預結合，後者響應配體-誘導的β組分的二聚體化而被激活[Stahl，et al.Science(1993年已投稿)]。因此，能進入胞質破壞β組分與Jak/Ty激酶相互作用的小分子可以潛在地封阻所有後序的細胞外信號。此種活性可以通過一體外方案篩選，該方案可評價小分子封阻純化的β-組分和Jak/Tyk激酶相關結合域之間相互作用的能力。可替代的方法可用二雜交相互作用體系[Chien，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.889578-9582(1992)]較容易地篩選在基於酵母的試驗中能抑制結合於Jak/Tyk激酶的β組分的分子。在這一體系中，兩種蛋白(β組分和Jak/Tyk激酶或此例中相關域)的相互作用誘導一種如β-半乳糖苷酶的方便標記物的生成。試驗小分子收集物的破壞所要求的相互作用而不抑制兩種對照蛋白的相互的作用能力。這種篩選方法的優點在於這樣一種要求試驗化合物在抑制β組分和Jak/Tyk激酶相互作用之前進入細胞。
這裡描述的CNTF家族拮抗劑或者結合於胞質的CNTF和IL-6，或者與二者相競爭。因此，它們被用於治療由CNTF或IL-6介導的疾病或紊亂。例如，IL-6拮抗劑具有如下的治療作用1)骨質疏鬆會由於絕經後婦女雌激素水平的降低或卵巢切除而惡化。IL-6似乎是成骨細胞生成的關鍵介質，它引起骨吸收[Horowitz，Science 260626-627(1993)；Jilka，et al.，Science 25788-91(1992)]。重要的是，IL-6似乎僅在雌性激素枯竭狀態下起主要作用，卻極少參與正常的骨維持。實驗證據與此相符說明了IL-6的功能封阻抗體能減少成骨細胞的數量。雖然雌性激素替代療法也被適用，但這種方法似乎帶來了一些副作用，如增加患子宮內膜癌和乳腺癌的危險。因此，這裡介紹的IL-6拮抗劑能更加特異地降低成骨細胞生成到正常水平。
2)IL-6似乎直接參與形成多發性骨髓瘤，通過從自分泌或旁分泌的方式作用促進腫瘤形成[Van Oers，et al.，AnnHematol.66219-223(1993)]。升高的IL-6水平還造成不期望的繼發效應，如骨吸收、高血鈣症和惡病質；為數有限的研究表明，IL-6或IL-6Rα的功能封阻抗體對此有一定療效[Klein，et al.，Blood 781198-1204(1991)；Suzuki，et al.，Eur.J.Immunol.221989-1993(1992)]。因此，這裡介紹的IL-6拮抗劑將有利於對繼發效應和腫瘤生長的抑制。
3)IL-6可能是導致與愛滋病和癌症有關的惡病質的腫瘤壞死因子(TNF)的媒介[Strassmann，et al.，J.Clin.Invest.891681-1684(1992)]，其作用可能在於降低脂肪組織中脂蛋白脂酶的活性[Greenberg，et al.，Cancer Research 524113-4116(1992)]。據此，這裡介紹的拮抗劑將對減輕或減少這類病人的惡病質有所裨益。
治療這類或其它與CNTF家族有關的疾病或紊亂的有效劑量可以用專業人員所知的方法[參照Fingl等，The PharmacologicalBasis of Therapeutics，Goodman and Gilman，eds，MacmillanPubllshing Co.，New York，pp.1-46(1975)]來確定。根據本發明實用的藥物組合物包括將上述的拮抗劑溶解於一種藥用的液態、固態或半固態載體中，然後與某種載體或靶分子(如抗體、荷爾蒙、生長因子等)連接，和/或在體內給藥之前裝入脂質體、微膠囊、緩釋製劑(含拮抗物表達細胞)。例如，藥物組合物可以包含一種或多種溶於水溶液，如滅菌水、鹽水、磷酸緩衝液或葡萄糖溶液的拮抗劑。也可以將活性試劑包含於一個固態(如蠟)或半固態(如明膠)中，植入需要治療的病人體內。給藥途徑可以是已知的任何方式，包括但不限於靜脈、鞘內、皮下、注射入相關組織、動脈內、鼻內、口服或藉助於值入裝置等。
給藥後將引起本發明的活性試劑在全身或局部區域的分配。例如，在某些涉及神經系統遠程區域，應採用靜脈或鞘內注射。在一些情況下，可將包含活性試劑的植入物直接植入損傷區或鄰近區域。合適的植入物包括但不局限於gelfoam蠟或微粒型植入物等。
實例一.CNTF與IL-6競爭結合gp130材料與方法材料響應IL-6(PC12D)的PC12細胞克隆購自DNAX。大鼠CNTF參照Masiakowskl et al.，J.Neurochem.571003-10012(1991)自行製備。IL-6和sIL-6R購自R D系統。抗血清在兔體內製備，能抗從gp130 C-末端附近區域衍生的肽[序列CGTEGQVERFETVGME(SEQ ID NO.2)]，方法參照[Stahl，et al.，J.Biol.Chem.2687628-7631(1993)]。抗磷酸酪氨酸的單克隆抗體4G10購自UBI，ECI試劑購自Amersham。
信號轉導測定PC12D板(10cm)在無血清培養基中(RPM1 1640+穀氨醯胺)飢餓1小時，然後分別在有或無大鼠CNTF情況下與IL-6(50ng/ml)和sIL-6R(1μg/ml)溫浴，濃度為指示濃度、時間5分鐘，溫度37℃。然後將樣品與抗gp130抗體免疫沉澱，SDS PAGE電泳和抗-磷酸酪氨酸免疫印跡[方法參照Stahl，et al.，J.Biol.Chem.2687628-7631(1993)]。結果CNTF封阻IL-6應答的能力可用PC12細胞系(被稱作PC12D)測量，該細胞系表達IL-6Rα、gp130和CNTFRα，但不表達LIFRβ。正如預測，這些細胞響應IL-6，但不響應CNTF(如圖2)，因為LIFRβ是CNTF信號轉導的必需組分[Davis，et al.，Science26059-63(1993)]。與其它細胞系[Ip，et al.，Cell 691121-1132(1992)]一致，PC12D細胞系響應2nM IL-6而使gp130(和各種稱作CLIPs的其它蛋白)酪氨酸磷酸化。加入可溶性重組體IL-6Rα可提高gp130酪氨酸磷酸化水平，這一點已在其它體系中有所報導[Taga，et al.，Cell 58573-581(1989)]。然而，加入IL-6的同時加入2nM CNTF，則嚴重減少gp130酪氨酸磷酸化。雖然在CNTF、IL-6和sIL-6Rα存在時仍保留輕度的gp130酪氨酸磷酸化反應，但在將CNTF濃度提高3倍而到3nM時，此反應完全消除。因此，在含有CNTFRα而不含LIFRβ的IL-6響應細胞中，CNTF更象IL-6的潛在拮抗劑。
實例二.CNTF結合於CNTFRα∶β材料與方法CNTF結合的Scatchard分析125I-CNTF的製備與純化方法參照Stahl et al.，JBC 2687628-7631(1993)。飽合結合研究在PC12細胞中進行，所用125I-CNTF濃度範圍從20pM到10nM。結合直接在細胞單層上進行。將培養基從孔中取出，將細胞採用試驗緩衝液衝洗一次，此緩衝液含有磷酸緩衝鹽溶液(PBS，pH7.4)、0.1mM桿菌肽，1mM PMSF、1μg/ml Leupeptin和1mg/ml BSA。細胞在125I-CNTF中室溫培養2小時，然後用試驗緩衝液快速衝洗兩次。用含1％SDS的PBS緩衝液使細胞溶胞，再用Packard Gamma計數器計數，效率為90～95％。在未標記的CNTF過量100倍時測定非特異性結合。特異性結合範圍從70％到95％。結果CNTF結合CNTFRα∶β1的平衡常數由結合PC12D細胞上的碘化CNTF的Scatchard分析得到(如圖3)。此數據與具解離常數9pM和3.4nm的兩位點配合(2 site fit)相一致。低親和力位點對應於CNTF與CNTFRα的相互作用，Kd≈3nM[Panaytotatos，et al.，J.Biol.Chem.26819000-19003(1993)]。我們將高親合力複合物解釋為含CNTF、CNTFRα和gp130的中間產物。Ewing肉瘤細胞系(EW-1)確實含有CNTFRα、gp130和LIFRβ，因此響應CNTF而使強大的酪氨酸磷酸化，具有解離常數1nM和10pM[Wong，et al.，未發表數據]，顯示了極相似的兩位點配合。因此，可以明顯看出CNTF以與其結合CNTFRα、gp130及LIFRβ複合物的同樣的高親合力結合僅含有CNTFRα與gp130複合物，這說明了形成sRα∶β拮抗劑的可行性。
序列表(1)一般信息(i)申請人Regeneron Pharmaceuticals，INC(ii)發明題目CNTF家族拮抗物(iii)序列數2(iv)通訊地址(A)收件人Regeneron Pharmaceuticals，INC(B)街道777 Old Saw Mill River Road(C)市名Tarrytown(D)州名 New York(E)國家 U.S.A(F)郵編10591(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patentln Release #1.0，Version #1.25(vi)現行申請數據(A)申請號(B)提交日期(C)分類(viii)律師事務所信息(A)名字Kempler Ph.D.，Gail M.
(B)註冊號碼32，143(C)查詢/摘要號REG 200
(ix)電信信息(G)電話 914-345-7400(H)電傳 914-345-7721(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特徵(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO1序列描述His His His His His His1 5(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特徵(A)長度16個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型未知(D)拓撲學未知(ii)分子類型肽(xi)SEQ ID NO2序列描述Cys Gly Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg1 5 10Phe Glu Thr Val Gly Met Glu1權利要求
1.一種sRα∶β1異二聚體蛋白，它包括一種可溶性決定α特異性的細胞因子受體組分和一種可溶性細胞因子受體的β1組分。
2.權利要求1的蛋白，其中細胞因子是CNTF細胞因子家族的成員。
3.權利要求1的蛋白，其中β1受體是gp130。
4.權利要求1的蛋白，其中β1受體是LIFRβ。
5.權利要求2的蛋白，其中細胞因子是CNTF，所述α受體是sCNTFRα，所述β1受體是gp130。
6.權利要求2的蛋白，其中細胞因子是IL-6，所述α受體是sIL-6Rα，所述β1受體是gp130。
7.一種IL-6蛋白，它包括一種β2突變，其中所述突變使得當所述IL-6與IL-6Rα和第一個gp130分子形成複合物後，不能與第二個gp130分子結合。
8.一種CNTF蛋白，它包括一種β2-突變體，其中所述突變使得當CNTF與CNTFRα和gp130形成複合物後，不能與LIFRβ結合。
9.一種分離IL-6拮抗物的方法包括1)得到一種產IL-6的克隆；2)用隨機突變或靶突變的方法使此種克隆突變以產生表達IL-6突變體的亞克隆；3)回收此亞克隆所產生的突變的IL-6分子；4)將具有以下特性的突變的IL-6分子鑑定為IL-6拮抗物，當該分子與IL-6Rα和第一個gp130分子形成複合物後，就不能再結合第二個gp130。
10.權利要求9的方法，其中的鑑定包括i)將IL-6Rα∶β1異二聚體加至突變的IL-6分子以形成IL-6/IL-6Rα∶β1中間產物；ii)將可探測的gp130加至所述中間產物以形成IL-6∶IL-6Rα∶β1∶β2複合物；iii)通過測定IL-6∶IL-6Rα∶β1∶β2複合物中可探測的gp130的量來確定所述可探測gp130與IL-6/αβ1中間產物的結合。
11.一種分離IL-6拮抗物的方法包括1)得到一種產IL-6的克隆；2)用隨機突變或靶突變的方法使此種克隆突變為產生表達IL-6突變體的亞克隆；3)表達突變的IL-6分子；4)將所述突變的IL-6分子與IL-6Rα結合形成IL-6/IL-6Rα複合物；5)將可探測的gp130加至所述IL-6/IL-6Rα複合物；6)將具有以下特性的突變IL-6分子鑑定為IL-6拮抗物，當該分子出現在所述IL-6/IL-6Rα複合物中時，該分子不能與所述可探測gp130結合。
12.一種分離CNTF拮抗物的方法包括1)得到一種產CNTF的克隆；2)用隨機突變或靶突變的方法使此種克隆突變以產生表達CNTF突變體的亞克隆；3)回收此亞克隆所產生的突變的CNTF分子；4)將具有以下特性的突變的CNTF分子鑑定為CNTF拮抗物，當該分子與CNTF Rα和第一個gp130分子形成複合物後，就不能再結合LIFRβ。
13.權利要求12的方法，其中鑑定包括i)將CNTF Rα∶β1異二聚體加至突變的CNTF分子以形成CNTF/CNTF Rα∶β1中間產物；ii)將可探測的LIFRβ加至所述中間產物以形成CNTF∶CNTF Rα∶β1∶β2複合物；iii)通過測定CNTF∶CNTF Rα∶β1∶β2複合物中可探測的LIFRβ的量來確定所述可探測LIFRβ與CNTF/αβ1中間產物的結合。
14.一種分離CNTF拮抗物的方法包括1)得到一種產CNTF的克隆；2)用隨機突變或靶突變的方法使此種克隆突變為產生表達CNTF突變體的亞克隆；3)表達突變的CNTF分子；4)將所述突變的CNTF分子與CNTFiRα結合形成CNTF/CNTF Rα複合物；5)將可探測的gp130加至所述CNTF/CNTF Rα複合物；6)將具有以下特性的CNTF分子鑑定為CNTF拮抗物，當該分子出現在所述CNTF/CNTFRα複合物中時，不能與可探測gp130結合。
15.編碼權利要求1-8之任一的蛋白的DNA序列。
16.以上權利要求1、7或8之任一特別提及的蛋白。
17.一種藥物組合物包括權利要求1至8或16之任一的蛋白和藥用載體。
18.一種用於治療與IL-6相關疾病或紊亂的藥物組合物，該組合物包括權利要求6或7的蛋白和一種藥用載體。
19.權利要求6或7的蛋白它用於一種治療雌激素衰竭患者的骨質疏鬆症的方法。
20.權利要求6或7的蛋白，它用於一種治療患者的多發性骨髓瘤的方法。
21.權利要求6或7的蛋白，它用於一種治療患者的惡病質的方法。
全文摘要
包含細胞因子受體的可溶性α特異性決定組分以及β受體組分的細胞外域的異二聚體蛋白，行使CNTF和IL-6拮抗物功能。
文檔編號C07K14/715GK1138350SQ94194575
公開日1996年12月18日 申請日期1994年10月19日 優先權日1993年10月20日
發明者N·斯塔爾赫爾, A·埃科挪米德斯, G·D·楊科波勞斯 申請人:裡珍納龍藥品有限公司