魚腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜sod提取工藝的製作方法
2023-08-11 01:37:16 2
專利名稱：魚腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜sod提取工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物酶分離與提純工程技術領域，尤其是涉及在魚腥草、枳犋子、刺 梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜等植物中提取高純度超氧化物歧化酶(SOD)的技術。
背景技術：
超氧化物歧化酶(SOD)作為生物體內一種重要的氧自由基清除劑，能夠平衡機體 的氧自由基，避免生物體內超氧陰離子自由基濃度過高引起的不良反應。在防輻射、糖尿 病、肺病、肝炎、心血管病、腫瘤、紅斑狼瘡、白內障、類風溼、關節炎症、變質性炎症、滲出性 炎症、增生性炎症、特異性炎以及自身免疫治療等方面具有獨特的功效。同時，超氧化物歧 化酶可以作為美容化妝品、保健食品飲品的活性成分。目前用於動物或者植物SOD的提取工藝，大多都採用分步鹽析和有機溶劑沉澱等 傳統的分離純化技術。這些傳統的分離純化技術在工業應用上都存在一定的局限性，如分 步鹽析和有機溶劑沉澱容易引起蛋白質的變性和失活等。
發明內容
本發明的目的在於提供一種可以在魚腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜等 植物適於工業應用的高純度超氧化物歧化酶提出工藝，解決現有存在的缺陷。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案魚腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，包括如下步驟A)對原料進行預處理，將所述的植物原料經過循環超聲提取破碎後，經勻漿機勻 漿後，8000 IOOOOrpm高速離心6 30min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩衝液調整為7 8;D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥，製備 得凍乾粉，備用。優選的方案是還包括對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組 利用的步驟F)；所述活性物質包括RNA、維生素、安基酸、短肽等。更優的方案是還包括對植物原料經破碎機破碎後過濾的濾渣進行加工處理的步 驟G)，所述步驟G)為Gl)對渣加入保護液進一步提取，等濃縮後，噴霧乾燥，製備果糖或者果膠；和/或者G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層 析柱層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得其它活性物質；所述其它活性物質包括RNA、維生素、安基酸、短肽等。通過本發明所述的高純度超氧化物歧化酶提出工藝，通過循環超聲提取破碎，GST 及Ni分步親和層析以及超濾幾個步驟便能從魚腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜 等植物中分離純化到高純度超氧化物歧化酶，分離純化到的高純度超氧化物歧化酶純度可 以高達98%，酶活力可以高達5 6X 106U/g。本發明所述的提出工藝，更是可以對超濾液 濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用；並對植物原料經破碎機破碎後過濾 的濾渣進行加工處理，製得果糖以及其它活性物質，使原材料的價值得到充分的利用。本發 明所述的高純度超氧化物歧化酶提出工藝填補了國內天然多元抗氧化活性物的空白，為人 類的健康及再次改良高經濟作物具有超前創新重大意義，將會使食品和保健品行業得到革 命性的調整。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。實施例1魚腥草高純度SOD的提取A)取清潔的魚腥草經過循環超聲機充分破碎，經勻漿機勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心6 30min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩衝液調整為7 8;D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶，測定純度及酶活力，測定結果純 度高達98. 2%，酶活力可以高達5. 3X 106U/g ；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥6 8h，製備得凍乾粉，備用。F)對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用。G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層 析柱層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得其它活性物質。實施例2枳犋子高純度SOD的提取A)取清潔的枳犋子經過循環超聲機充分破碎，經勻漿機勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心10 30min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩衝液調整為7. 2 7. 8 ；D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為40 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶，測定純度及酶活力，測定結果純 度高達97. 8%，酶活力可以高達5. 5X 106U/g ；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥6 8h，製備得凍乾粉，備用。F)對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用。
Gl)對渣加入保護液進一步提取，等濃縮後，噴霧乾燥，製備果膠；G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層析柱層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得其它活性物質。實施例3刺梨高純度SOD的提取A)取清潔的刺梨經過循環超聲機充分破碎，經勻漿機勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 30min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩衝液調整為7. 5 8 ；D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶，測定純度及酶活力，測定結果純 度高達98. 5%，酶活力可以高達5. 2X 106U/g ；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥6 8h，製備得凍乾粉，備用。F)對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用。Gl)對渣加入保護液進一步提取，等濃縮後，噴霧乾燥，製備果膠；G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層 析柱層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得其它活性物質。實施例4油柑子高純度SOD的提取A)取清潔的油柑子經過循環超聲機充分破碎，經勻漿機勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 30min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩衝液調整為7 8;D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶，測定純度及酶活力，測定結果純 度高達97. 5%，酶活力可以高達5. 4X106U/g ；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥6 8h，製備得凍乾粉，備用。F)對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用。Gl)對渣加入保護液進一步提取，等濃縮後，噴霧乾燥，製備果膠；G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層 析柱層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得其它活性物質。實施例5葫瓜高純度SOD的提取A)取清潔的葫瓜經過循環超聲機充分破碎，經勻漿機勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 20min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩衝液調整為7 7. 5 ；
D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶，測定純度及酶活力，測定結果純 度高達98. 6%，酶活力可以高達5. 6X 106U/g ；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥6 8h，製備得凍乾粉，備用。F)對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用。Gl)對渣加入保護液進一步提取，等濃縮後，噴霧乾燥，製備果膠；G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層 析柱層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得其它活性物質。實施例6佛手瓜高純度SOD的提取A)取清潔的佛手瓜經過循環超聲機充分破碎，經勻漿機勻漿約lmin，8000 IOOOOrpm高速離心15 20min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100 500mM的Tris和100 500mM的PBS 緩衝液調整為7 7. 5 ；D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30 50kDa和截留分子量為70 150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶，測定純度及酶活力，測定結果純 度高達98.4%,酶活力可以高達5. 8X 106U/g ；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥6 8h，製備得凍乾粉，備用。F)對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用。Gl)對渣加入保護液進一步提取，等濃縮後，噴霧乾燥，製備果膠；G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層析柱層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得其它活性物質。
權利要求
魚腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，包括如下步驟A)對原料進行預處理，將所述的植物原料經過循環超聲提取破碎後，經勻漿機勻漿後，8000～10000rpm高速離心6～30min，過濾製得粗提液；B)將步驟A)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通過100～500mM的TRIS和100～500mM的PBS緩衝液調整為7～8；D)對步驟C)所得的洗脫液依次用截留分子量為30～50kDa和截留分子量為70～150kDa的超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥，製備得凍乾粉，備用。
2.如權利要求1所述的魚腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，其特 徵是還包括對超濾液濃縮得到的小分子物質中的活性物質進一步重組利用的步驟F)。
3.如權利要求1所述的魚腥草、枳犋子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，其特 徵是還包括對植物原料經破碎機破碎後過濾的濾渣進行加工處理的步驟G)，所述步驟G) 為Gl)對渣加入保護液進一步提取，等濃縮後，噴霧乾燥，製備果糖或果膠；和/或者G2)對渣加入保護液並同時添加烯醇液進一步分離黃酮後，對分離分離液通過層析柱 層析精製，並對層析洗脫液進一步濃縮，製得活性物質。
全文摘要
本發明公開了魚腥草、枳椇子、刺梨、油柑子、葫瓜、佛手瓜SOD提取工藝，包括步驟A)對原料進行預處理，經勻漿機勻漿後，8000～10000rpm高速離心，過濾製得粗提液；B)所得的粗提液依次通過PEG、GST、Ni親和層析柱純化目的蛋白；C)將步驟B)所得的粗提液pH值通調整為7～8；D)對步驟C)所得的洗脫液用超濾膜進行超濾，製備高純度的超氧化物歧化酶；E)對超濾液進行進一步濃縮，製得SOD濃縮液；對SOD濃縮液進行冷凍乾燥，製備得凍乾粉，備用。本發明所述的提出工藝分離純化到的高純度超氧化物歧化酶純度可以高達98％，酶活力可以高達5～6×106U/g，具有極高的經濟價值。
文檔編號C12N9/08GK101812432SQ20101015179
公開日2010年8月25日 申請日期2010年4月21日 優先權日2010年4月21日
發明者張衛國 申請人:張衛國