一種治療股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑的製作方法

2023-08-10 20:38:36 2

專利名稱：：一種治療股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於治療的配製品，具體涉及治療早期股骨頭缺血性壞死的醫用配製品。
背景技術：
：骨髓基質幹細胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)是一種由骨髓中分離獲得的具有多種分化潛能的間質幹細胞，取材方便、對機體損傷小，分離和擴增容易，同時還能分泌大量的促細胞和血管生長因子；另外，BMSCs成分中含有骨祖細胞，具有良好的向成骨細胞分化的潛能，在體外經地塞米松、p-甘油磷酸鈉、維生素C、骨形態發生蛋白等的誘導，可以向成骨細胞分化；在體內主要的分化環境為骨髓及松質骨骨小梁，在局部"成骨微環境"下，能夠進行增殖，並經骨原細胞、前成骨細胞最終分化為成骨細胞，被認為是骨組織工程近階段最有希望應用於臨床的種子細胞。目前，用自體BMSCs治療早期(Ficatl、II期)股骨頭缺血性壞死(ANFH)已顯示出誘人的應用前景。2006年，王五洲等採用髓芯減壓加自體BMSCs移植治療了19例I-III期ANFH患者，術後隨訪12個月，MRI復査顯示，平均股骨頭壞死體積由31.89%縮小至13.18%,其中I-II期改善更為明顯，患者髖關節疼痛在3周即有緩解，肢體功能在6個月開始恢復，髖關節Harris評分由58.74升至75.54，達到良好標準，證實了自體BMSCs治療ANFH的有效性和安全性(文獻王五洲，刑更彥，張可超，麻立剛，白曉東，李冰.髓芯減壓並自體幹細胞移植治療早期股骨頭壞死的療效觀察，中國醫師雜誌，2006，8(4):436-438)。但是，移植區低灌注、細胞成活率低是削弱其治療效果的重要因素；而且ANFH的根本原因是血供障礙，並且病程的發展會造成進一步的血供障礙，引發ANFH的加重，是—個惡性循環的發病過程，只有誘導新血管生成並建立新的側枝循環，才是打破治股骨頭壞死病理惡性循環最有效的手段，單純BMSCs移植難以實現這一目標。而且ANFH骨內壓高，如果直接將轉HGF基因的BMSCs經髓芯減壓隧道植入壞死區，細胞會隨骨內壓的釋放而流失。《骨髓間質幹細胞與纖維蛋白膠生物相容性的實驗研究》一文公開了BMSCs和纖維蛋白膠複合的方法(彭松林，方煌，陳安民.骨髓間質幹細胞與纖維蛋白膠生物相容性的實驗研究.生物骨科材料與臨床研究，2004.11(3):34-37)，該方法是利用纖維蛋白膠在凝血酶的作用下形成網狀凝膠將BMSCs包裹在內，在患者體內形成一種緩釋體系控制BMSCs的釋放，防止細i隨骨內壓的釋放而流失。
發明內容本發明要解決的技術問題是進一步提髙用BMSCs移植治療早期ANFH的生物治療效率。本發明解決上述技術問題的技術方案是一種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，該生物分裝劑由以下試劑組成-試劑I:纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為60100mg/mL，抑肽酶的含量為10003000KIU/mL，最佳是纖維蛋白原80mg/mL、抑肽酶2000KIU/mL;試劑II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250~500IU/mL，CaCl2的含量是40mmol/mL，最佳是凝血酶400IU/mL;試劑m:轉基因骨髓基質幹細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)的基因。本發明試劑I是將纖維蛋白原和抑肽酶按配比與水混合得到:試劑II是將凝血酶和CaCl2按配比與水混合得到。試劑m中所述的骨髓基質幹細胞為同種異體骨髓基質幹細胞或自體骨髓基質幹細胞。所述的人肝細胞生長因子基因的結構記載於《MolecularcloningandsequenceanalysisofcDNAforhumanhepatocytegrowthfactor》(MiyazawaJfC.，Tsubouchi，H"NakaJ).，Takahashi,K.,Okigaki，M"Arakaki，N.，Nakayama^H"Hirono，S.，Sakiyama^O"Gohda3"DaikuharajY.andKitamur^N.Biochem.Biophys.Res.Commun.1989，163(2):967-973)。本發明試劑ffl中所述的骨髓基質幹細胞的製備方法由以下步驟組成(1)利用AdMax系統，製備重組腺病毒Ad-HGF:將人HGF基因插入到穿梭質粒載體pDC316構建穿梭質粒pDC316/HGF，將pDC316/HGF與包裝質粒pBHGloxAEl，3Cre共轉染293細胞，得重組腺病毒Ad-HGF;(2)擴增重組腺病毒Ad-HGF，採用HPLC色譜層析純化；(3)髂骨穿刺抽取同種異體或自體骨髓，分離、純化BMSCs，體外培養至第二代，按腺病毒感染複數量(MOI)=300取厶<1-110轉染第二代8]^8€5，即可。上述方法中所述的穿梭質粒pDC316/HGF可用酶切方法鑑定將pDC316/HGF經SacI+&/1雙酶切後將得到大小分別為2，200bp和3,913bp的片段。所述的重組腺病毒Ad-HGF可用PCR方法鑑定引物為上遊引物5'-TAGAGCTCATGTGGGTGACCAAACTCCT-3'(SEQNO.l)，下遊引物5'-TAGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTAT-3'(SEQNO.2);反應體系為取50fil毒種上清液，加入2ia1蛋白酶K，56"C溫育，煮沸10min，冰浴冷卻，取lnl作為模板，10pM上遊引物1^1、10fiM下遊引物lpl、10mMdNTPlnl、2.5U/filTaq酶1^1、10XPCRBuffer5pl、ddH2O40nl，反應體系為50nl;反應程序為95'C預變性5min，然後95°C30s，58'C30s，72°C2min，共30個循環，最後72'C延伸10min，擴增產物為一長2，200bp的DNA片斷。上述的轉基因骨髓基質幹細胞可通過RT-PCR、原位雜交方法檢測HGFmRNA的表達、免疫組化方法檢測HGF蛋白的表達、ELISA方法檢測HGF蛋白的分泌。本發明生物分裝劑用於治療早期ANFH的方法是先根據不同患者對試劑在人體內形成的凝膠的降解速度的實際需要，選擇試劑I與試劑II的按1:19;l比例，然後將試劑I加入試劑ni中混合均勻，使得試劑n在體內混合後細胞終濃度為1(^個/mi，將試劑i和m混合液與試劑n在ct引導下行髓芯減壓術時，用雙聯注射器經減壓隧道注入股骨頭壞死區。本發明試劑m中的轉基因骨髓基質幹細胞在移植到體內後分泌HGF，HGF能誘導新血管生成，改善股骨頭血供；HGF對BMSCs有趨化作用，局部高分泌的HGF可使BMSCs"停留"在壞死區局部，利於其向成骨細胞分化；HGF能抑制BMSCs凋亡、其誘生的血管可改善移植細胞的生存環境，提高BMSCs移植存活率，進而提高治療效果。本發明試劑I和II注入體內，試劑i中的纖維蛋白原在試劑n中的凝血酶作用下快速形成立體網狀結構凝膠，所形成的凝膠結構猶如一個海綿狀的藥物儲存庫，防止移植的轉基因骨髓基質幹細胞流失，且轉基因骨髓基質幹細胞分泌的HGF從中持續緩慢地釋放，從而維持其局部有效的作用濃度，其治療ANFH的效果比在手術中單純使用轉HGF基因骨髓基質幹細胞顯著提高。此膠一般在體內2周完全降解，通過調整試劑I中的纖維蛋白原濃度或抑肽酶的量，可以改變凝膠降解的速度和時間。圖1是穿梭質粒pDC316/HGF的酶切鑑定電泳圖，其中1為pDC316/HGF經&cl單酶切結果，2為pDC316/HGF經&cI+SWI雙酶切結果，3為pDC316經雙酶切結果，4為DL15000marker。圖2是Ad-HGF的PCR鑑定，其中1以正常293細胞上清為模板，2以產毒293細胞上清為模板，3以PDC316/HGF質粒為模板，4為DL2000marker。圖3是本發明試劑m的轉基因兔BMSCs中HGFmRNA表達的RT-PCR分析，其中1為DL15000marker,2為未轉染的BMSCs陰性對照，3為本發明試劑m的轉基因骨髓基質幹細胞。圖4是轉基因兔BMSCs中HGF表達的原位雜交分析，其中圖4-A為未轉染的BMSCs陰性對照，圖4-B為本發明試劑m的轉基因BMSCs組。圖5是轉基因兔BMSCs中HGF表達的免疫組化分析，其中圖5-A為未轉染的BMSCs陰性對照，圖5-B為本發明試劑m的轉基因BMSCs組。圖6是轉基因兔BMSCs中的HGF表達的ELISA分析圖7是對兔早期激素性ANFH治療的DR檢査圖，其中圖7-A為正常組，圖7-B為造模組，圖7-C為轉HGF基因骨髓基質幹細胞治療組，圖7-D為本發明生物分裝劑治療組。圖8是對兔早期激素性ANFH治療的MRI檢査圖，其中圖8-A為正常組，圖8-B為造模組，圖8-C為轉HGF基因骨髓基質幹細胞治療組，圖8-D為本發明生物分裝劑治療組。圖9是對兔早期激素性ANFH治療的常規CT檢査圖，其中圖9-A為正常組，圖9-B為造模組，圖9-C為轉HGF基因骨髓基質幹細胞治療組，圖9-D為本發明生物分裝劑治療組。圖10對兔早期激素性ANFH治療的CT灌注檢査(血容量BV圖)，其中圖IO-A為正常組，圖10-B為造模組，圖10-C為轉HGF基因骨髓基質幹細胞+髓芯減壓治療組，圖10-D為單純髓芯減壓治療組，圖10-E為本發明生物分裝劑治療組。圖11是對兔早期激素性ANFH治療的墨汁灌注造影(X10),其中圖ll-A為正常組，圖ll-B為模型組，圖ll-C為單純髓芯減壓治療組，圖11-D為轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組，圖11-E為本發明生物分裝劑治療組。圖12是對兔早期激素性ANFH治療的病理組織學HE染色圖(X200)，其中圖12-A為正常組，圖12-B為模型組，圖12-C為單純髓芯減壓治療組，圖12-D為轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組，圖12-E為本發明生物分裝劑治療組。圖13是對兔早期激素性ANFH治療的病理組織學觀察(VEGF免疫組化觀察，X400)，其中圖13-A為正常組，圖13-B為模型組，圖13-C為單純髓芯減壓治療組，圖13-D為轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組，圖13-E為本發明生物分裝劑治療組。具體實施例方式下面將以紐西蘭大白兔為例通過實施例和實驗證明本發明具有的優點。製備例1:本實施例的生物分裝劑的組成如下(1)試劑I:纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為80mg/mL，抑肽酶的含量為2000KIU/mL;(2)試劑II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是400IU/mL，CaCl2的含量是40mmol/mL;(3)試劑m:轉基因骨髓基質幹細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子的基因。其中，試劑I是將纖維蛋白原和抑肽酶按配比與水混合得到；試劑II是將凝血酶和CaCl2按配比與水混合得到；試劑ni的製備方法是1、利用AdMax系統，製備重組腺病毒Ad-HGF(1)構建穿梭質粒pDC316/HGF，具體方法是①目的塞因的擴增上遊引物5'-TAGAGCTCATGTGGGTGACCAAACTCCT-3',引入S"cI位點；下遊引物5'-TAGTCGACCTATGACTGTGGTACCTTAT-3'，引入S"/I位點。提取共表達人HGF-Met的NIH3T3-H0細胞的總RNA，以OligdT為引物進行逆轉錄，然後加入上、下遊引物進行PCR擴增95。C預變性5min，然後95°C30s，30s，2min,共30個循環，最後72"C延伸10min②穿梭質粒的構建將PCR產物插入pGEM-T載體，轉化感受態菌DH5a。提取質粒，DNA測序正確後，以SflcI及SG/I雙酶切，回收2,200bp片段，插入穿梭載體pDC316的相同位點，以連接產物轉化DH5a感受態菌，提取質粒pDC316/HGF，酶切鑑定如圖1所示。(2)pDC316/HGF與包裝質粒pBHGloxAEl，3Cre共轉染293細胞，具體方法是①轉染前一天，將293細胞接種於六孔板中，每孔5X105個細胞，培養基為DMEM+10%Hyclone胎牛血清，置37'C含5%C02的培養箱中培養過夜。②轉染當天換液，用新鮮的含10。/c胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。待細胞生長至底面積的80-90%時，取骨架質粒包裝質粒pBHGloxAEl,3Cre和穿梭質粒pDC316/HGF，用Lipofectamine2000脂質體進行轉染。具體步驟為1)每個轉染孔取骨架質粒pBHGloxAEl，3Cre4嗎，穿梭質粒pDC316/HGFl嗎，混和均勻。2)質粒用300W的DMEM培養液進行稀釋，室溫放置5min。3)取lOjil的脂質體用300fil的DMEM培養液進行稀釋，室溫放置5min。4)將兩者混和，室溫避光放置30min。然後將混合物加入到細胞中。③轉染後第二天，將長滿的細胞傳代於25cm2細胞培養瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養，每天觀察，待細胞長滿瓶底時，再傳入75cn^細胞培養瓶中，密切觀察有無出毒跡象。④結果在第八天時，發現細胞有出毒跡象，細胞變大變圓，呈葡萄狀，並開始出現明顯噬斑。第11天時，細胞大部分病變並從底部脫落。⑤收毒。將出毒的細胞培養瓶先後置於液氮和37"C水浴鍋中反覆凍融三次，使病毒從病變細胞中充分釋放。將凍融液離心，3000rpm,收集含病毒的上清液，棄掉細胞碎片沉澱。該病毒上清即為第一代毒種(Pl)，命名為Ad-HGF，作為隨後大量病毒擴增的毒種。⑥毒種鑑定在25cn^細胞瓶中培養293細胞，待細胞生長至90%滿時，取上述第一代毒種500)li1接種於細胞上，待細胞完全病變時按前述方法凍融細胞三次，離心收集病毒上清液，此即為第二代毒種(P2)。取50^1P2毒種上清液，加入2^il蛋白酶K(10mg/ml)，55。C消化lh，煮沸10min，立即放入冰浴5min，取1^1作為模板，用HGF上、下遊引物進行PCR鑑定，擴增條件同上。若能夠特異地擴增出2，200bp條帶，證明該重組腺病毒攜帶目的片段。2、擴增病毒，採用HPLC色譜層析純化，具體方法是(1)在1個750112方瓶中接種4乂106293細胞，培養過夜，待細胞生長至90%滿時，取2mlP2代毒種接種培養瓶內，24h，顯微鏡下觀察發現有60%細胞病變，44h後細胞完全病變。(2)收穫病變細胞混懸液後，凍融三次，離心，取上清，按同樣方法接種於另外4個75ci^方瓶中，44h完全出毒，收穫病毒，用於接種轉瓶。(3)在每個轉瓶中接種1.8X1S個293細胞，共接種4個轉瓶，等細胞生長至90%融合時，按10ml/轉瓶(MOI約為1)接種第2步收穫的病毒上清，染毒後70h收穫病變細胞混懸液。(4)混懸液3000rpm離心，棄上清，細胞沉澱用Tris緩衝液重懸，反覆凍融三次，6000rpm離心，取上清，用DNase酶消化後，用0.45nm的濾膜過濾，然後利用Waters600EHPLC進行純化，具體步驟如下①先用含25%甘油的50mmol/LTris(pH7.5)緩衝液將樣品稀釋至5xlUvp/ml;②使用20(HU定量環(即上樣1.0xl0"vp)。使用lmlResourceQ柱(6.4x30mm),置於30'C下使用；③洗脫梯度從50mmol/LTris(pH7.5)到50mmoi;LTris，lmol/LNaCl(pH7.5),洗脫時間30min,流速lml/min;使用260nm和280nm兩個紫外波長進行檢測，依據腺病毒特徵吸收U60/280=1.25±0.08，收集腺病毒峰；將純化後的病毒保存於腺病毒保存液中，經除鹽處理後用0.22拜一次性濾器過濾除菌，分裝保存於-70'C冰箱。(5)純化後Ad-HGF質量檢定測病毒OD260值，按公式v.p,/mlOD260X1.1X稀釋倍數X1012，計算得到每ml製品中的病毒顆粒數，即物理滴度；用TCID50檢測病毒的感染性滴度。結果顯示純化的Ad-HGF物理滴度1.0xlOl2v.p./ml，感染性滴度2.6xl01QTCID50/ml，HPLC鑑定純度98X，PCR鑑定目的基因如圖2所示。3、兔BMSCs的分離和培養取4-8周齡健康紐西蘭大白兔，麻醉後，以髂後上棘為穿刺點，用16號髂骨穿刺針抽吸骨髓3ml，混入含肝素鈉的DMEM培養基中反覆抽吸吹打，800g離心5min，棄上清，用5ml含10。/。FCS、100u青黴素、100ug鏈黴素的完全DMEM培養液重懸細胞，接種入25cn^培養瓶中，置37'C、5。/。C02孵箱中培養，4d時換液去除未貼壁細胞，其後每3d換液l次，待細胞匯合成單層，用0.125W胰蛋白酶/0.0P/。EDTA消化，傳代細胞以1-2><105/孔密度接種於6孔板，培養至第二代備用。按MOI-300，將Ad-HGF轉染第二代兔BMSCs，具體的過程為(1)待傳代細胞貼壁生長至60-70%融合時，吸去培養基，用PBS洗1次。(2)加無血清DMEM培養液，置37°C、5%C02孵箱孵育20min。(3)按感染複數(MOIp300加入病毒液，置37'C、5%0)2孵箱孵育45min後，補加完全DMEM培養液使體系中血清濃度為5%。(4)置37。C、5。/。C02孵箱孵育4h後換為完全DMEM培養液，48h後檢測指標。4.RT-PCR檢測轉染後BMSCs的HGFmRNA表達(1)從培養的BMSCs中提取樣本總RNA①在25cr^細胞培養瓶(約lxl(^個細胞)中加入400^1TRKLysisBuffer裂解細胞；②倒置顯微鏡觀察，細胞完全裂解後，吸出細胞裂解液，轉入套在2ml收集管上的HomogenizationSpin柱子中，室溫14，000g離心lmin;③將收集的濾過液轉移至一新的2ml收集管中，加入4(KHd70y。乙醇，渦旋混勻；將HiBindRNASpin柱子套在2ml收集管中，並將上述溶液(包括沉澱)轉移至柱子上，室溫10,000g離心lmin，棄濾過液；⑤將柱子套回收集管，加入300nlWashBufferI至柱子上，按上述條件離心，棄濾過液；⑥將柱子套回收集管，加DNase酶消化處理；⑦加入500|JRNAWashBufferI至柱子上，放置5min，室溫lO,OOOg離心lmin，棄濾過液；⑧將柱子套回收集管，加入500fi1RNAWashBufferII(已用無水乙醇稀釋)，室溫lO，OOOg離心lmin，棄濾過液。重複該步驟1次；⑨將柱子套回收集管，室溫10,000g離心lmin;⑩將柱子轉移至新的1.5ml的Eppendorf管中，加入30jUDEPC水至柱子的膜中央，放置lmin，室溫10，000g離心lmin;(2)測定總RNA的純度和濃度測260mn和280nm值，計算純度(260nm/280nm)和濃度(RNAng/ml=A260x40x稀釋倍數)。(3)One-StepRT-PCR擴增HGF基因①cDNA反應總體系為50^1,取約l嗎總RNA為模板，分別加入2xReactionMix25ji1，IOiliM上下遊引物各ljil，RT/PlatinumT叫HiFiMix2nl，補充DEPC水至50fil，輕輕混勻。②cDNA合成反應條件為55°C30min，94°C2min，1個循環；③PCR擴增反應條件為94"C15s，60。C30s，68。C1.5min，35個循環；72。C延伸10min。取PCR產物5nl經l。/。瓊脂糖凝膠電泳，20min，溴化乙錠染色後採用凝膠成像系統照相，剩餘產物-2(TC保存備用。檢測結果RT-PCR擴增出2，200bp條帶，表明轉染後BMSCs有HGFmRNA表達，結果如圖3所示。5.原位雜交檢測轉染後BMSCs的HGFmRNA表達(1)消化BMSCs，以1.5xl0"孔的濃度接種於6孔板中，在37'C，5%C02，飽和溼度培養箱中培養24h。(2)按照前述方法，將Ad-HGF病毒以MOI=300轉染細胞。(3)48h後胰酶消化細胞，計數。以0.51.0xlS/200nl的濃度滴加於經紫外照射消毒的矽化玻片上，置於溼盒中，在37。C、5^C02飽和溼度培養箱中培養過夜。(4)取出玻片，0.1MPBS(pH7.4)洗滌2minx3次後，置於4。C丙酮中固定30min。蒸餾水充分洗滌，乾燥後置於-2(TC冰箱備用，或直接進行檢測。(5)30%H2021份+純甲醇50份混合，室溫處理30min。蒸餾水洗滌3次。(6)暴露mRNA片段玻片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(lml3。/。檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，室溫消化10s。0.1MPBS洗滌5minx3次。蒸餾水洗滌1次。(7)預雜交溼盒的準備---幹的雜交盒底部加20o/。甘油20ml以保持溼度。按每張切片20nl加預雜交液。恆溫箱38-42'C孵育2-4h。吸取多餘液體，不洗。(8)雜交按每張玻片2(^1雜交液，加在切片上。恆溫箱38-42t:雜交過夜。(9)雜交後洗滌37。C左右水溫的2xSSC洗滌5minx2次；37'C0.5xSSC洗滌15minxl次；37°C0.2xSSC洗滌15minxl次。(10)滴加封閉液37°C30min。甩去多餘液體，不洗。(11)滴加生物素化鼠抗地高辛37°C60min或室溫120min，原位雜交用PBS洗滌5minx4次0(12)滴加SABC:37°C20min或室溫30min，原位雜交用PBS洗滌5minx3次。(13)滴加生物素化過氧化物酶:37°C20min或室溫30min，原位雜交用PBS洗滌5minx3次。(14)DAB顯色使用DAB顯色試劑盒--1ml雙蒸水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標本上，顯微鏡下觀察至出現明顯的特異性染色，充分水洗。(15)蘇木素復染蘇木素染色5min，充分水洗後，1%鹽酸-乙醇分化23，充分水洗，玻片浸於水中反藍至適當的程度。(16)系列濃度的酒精脫水，二甲苯透明，封片。(17)顯微鏡觀察照相。檢測結果Ad-HGF轉染的BMSCs胞漿中有棕黃色陽性染色顆粒，表明轉染後BMSCs有HGFmRNA表達，結果如圖4所示。6.免疫組化檢測HGF蛋白的表達①消化BMSCs，以1.5xl5/孔的濃度接種於6孔板中，在37"C，5%C02，飽和溼度培養箱中培養24h。②按照前述方法，將Ad-HGF病毒以MOI-300轉染細胞。③48h後胰酶消化細胞，計數。以O.51.0xl0V20Onl的濃度滴加於經紫外照射消毒的矽化玻片上，置於溼盒中，在37'C，5%(202飽和溼度培養箱中培養過夜。④取出玻片，0.1MPBS(pH7.4)洗滌2minx3次後，置於4。C丙酮中固定30min。蒸餾水充分洗滌，乾燥後置於-2(TC冰箱備用，或直接進行檢測。⑤每張玻片上滴加適量0.01%胰酶消化細胞5min以暴露抗原，充分水洗。⑥每張玻片上滴加1滴或50nl過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育lOmin，0.02MPBS衝洗3minx3次。⑦除去PBS液，每張玻片上滴加1滴或封閉液，室溫下孵育10min。⑧除去多餘的封閉液，每張玻片上滴加1滴或50planti-hHGF單克隆抗體(用10。/。BSA-PBS做1:IOO倍稀釋)，4'C過夜。⑨0.02MPBS衝洗5minx3次。除去PBS液，每張玻片上滴加1滴或50^1生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10min。0.02MPBS衝洗3minx3次。⑩除去PBS液，每張玻片上滴加1滴或50[U鏈黴菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10min，0.02MPBS衝洗3minx3次。(11)除去PBS液，每張玻片上滴加2滴或100nl新鮮配製的DAB溶液(lml雙蒸水加顯色劑A、B、C各l滴，混勻)，顯微鏡下觀察至出現明顯的特異性染色，充分水洗。(12)蘇木素復染蘇木素染色5min，充分水洗後，1%鹽酸-乙醇分化28，充分水洗，玻片浸於水中反藍至適當的程度。(13)系列濃度的酒精脫水，二甲苯透明，封片。(14)顯微鏡觀察照相。檢測結果Ad-HGF轉染的BMSCs胞漿中有棕黃色陽性染色顆粒，表明轉染後BMSCs有HGF蛋白表達，結果如圖5所示。7.ELISA檢測HGF蛋白的分泌(1)將ELISA檢測試劑盒平衡至室溫(20-25°C)後取出反應板，並於臨用前15min配製工作液。(2)將濃縮洗滌液(40x)用雙蒸水稀釋成lx(至1000ml)。(3)稀釋標準品和待測樣品①用樣品稀釋液稀釋標準品標準品用lml標準品稀釋液復溶，得到16000pg/ml的高濃度標準品。將之稀釋成一組標準品，BP:8000、4000、2000、1000、500、250、125、Opg/ml。②用樣品稀釋液稀釋待測樣品將各個待測樣品從-80C冰箱中取出，室溫融化後分別用標準品稀釋液首先5倍稀釋，然後倍比稀釋成一組樣品。(4)加100^1標準品、100^1待測樣品於相應反應板孔中。(5)輕輕混勻30s，封住板孔，37'C溫育60min。(6)洗板甩盡板內液體，用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入35(HU洗滌液)，並去除水滴(在厚疊吸水紙上拍幹)；反覆洗滌5次。(7)臨用前15min配製1xBiotin:—支BiotineantiHGF加入6mlBiotin稀釋液，混勻。每孔加入100^1lxBiotin。輕輕混勻30s，封住板孔，37X:溫育60min。(8)洗板甩盡板內液體，用洗滌液洗滌反應板(每孔內加入350^1洗滌液)，並去除水滴(在厚疊吸水紙上拍幹)；反覆洗滌5次。(9)臨用前15min配製lxHRP:—支HRP加入6m酶聯物稀釋液，混勻。每孔加入100WlxHRP。輕輕混勻30s，封住板孔，37'C溫育30min。(10)洗板甩盡板內液體，用洗漆液洗滌反應板(每孔內加入350^1洗滌液)，並去除水滴(在厚疊吸水紙上拍幹)；反覆洗滌5次。(11)每孔加入100^1TMB顯色液。輕輕混勻10s，37'C暗處溫育I5±10min。(12)每孔加入l(KHil終止液(StopSolution)。輕輕混勻30s;30min內在450nrn處讀OD值。(13)以OD值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪製標準曲線。根據樣品的OD值可在標準曲線上査出其濃度。檢測結果轉染後BMSCs表達的HGF蛋白分泌到培養上清中，表達高峰在轉染後48h,表達量為103ng/ml，表達持續至少2周以上，結果如圖6所示。8.流式細胞術檢測細胞周期(1)取第2代BMSCs，用0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA室溫消化後製成單細胞懸液，PBS漂洗3次。(2)收集大約lxl(^個細胞，用預冷至4X:的70n/。乙醇固定30min;預冷的PBS漂洗3次。(3)50mg/LRNA酶0.3ml37°C處理30min。(4)將細胞懸液移入流式細胞儀專用試管，加入50mg/L的PI0.4ml，避光染色30min後上機檢測。檢測結果Ad-HGF轉染對BMSCs的細胞周期無影響。結果如表1所示，衣1:T問組別細胞周期流式細胞儀分析結果(％)(x±s，n=3)tableseeoriginaldocumentpage13製備例2本實施例的生物分裝劑的組成如下-(1)試劑I:纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為60mg/mL，抑肽酶的含量為1000KIU/mL;(2)試劑II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250IU/mL，CaCl2的含量是40mmol/mL;(3)試劑m:轉基因骨髓基質幹細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子的基因。其中，試劑in的製備方法與實施例1相同；試劑I是將纖維蛋白原和抑肽酶按配比與水混合得到；試劑II是將凝血酶和CaCl2按配比與水混合得到。製備例3本實施例的生物分裝劑的組成如下(1)試劑I:纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為100mg/mL，抑肽酶的含量為3000KIU/mL;(2)試劑II:凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是500IU/mL，CaCl2的含量是CaCl240mmol/mL;(3)試劑m:轉基因骨髓基質幹細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子的基因。其中，試劑m的製備方法與實施例1相同；試劑I是將纖維蛋白原和抑肽酶按配比與水混合得到；試劑II是將凝血酶和CaCl2按配比與水混合得到。應用例1、製作兔早期激素性ANFH模型採用紐西蘭大白兔，平均體重3kg，經耳緣靜脈注射10ml/kg馬血清，間隔二周後，按5ml/kg連續2天以相同方法注射馬血清；2周後，腹腔注射7.5mg/kg醋酸潑尼松龍，每周二次，共4次，製造兔激素性ANFH模型，於注射激素第5周末進行影像學和病理組織學檢査，確定ANFH分期，選擇I、II期進行治療。模型組動物隨機分3組進行治療本發明生物分裝劑治療組、轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組、單純髓芯減壓治療組，每組IO只，其中轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組中的轉HGF基因的BMSCs製備方法見製備例l。2、實驗方法以下效果實驗所用的本發明生物分裝劑的組成和製備方法見實施例1。①試劑in以0.125%胰蛋白酶/0.01%EDTA消化，低速度離心800gX5min，收集細胞沉澱，PBS洗滌三次、無血清DMEM培養基洗滌一次，在計數板上計數，調整細胞密度為107個/1111，取100nl低速度離心800gX5min，收集細胞沉澱；②用試劑I90^1懸浮步驟①所得的細胞沉澱；③將I、II期股骨頭壞死的兔麻醉後，在CT引導下行髓芯減壓術，取懸浮細胞的試劑I9(^1和試劑II通過雙聯注射器經減壓隧道移植入兔股骨頭壞死區。-術後4周，採用DR數字放射成像、MRI、CT、CT灌注、動脈墨汁灌注造影、病理切片HE染色、免疫組化等方法對療效進行綜合評價。3、實驗結果(1)對兔早期激素性ANFH治療的DR檢査(見圖7):具體實驗過程兔麻醉後採用仰臥位，固定雙側髖關節，攝包括雙側髖關節後前位片。照射條件75KV，250mA，16ms/4mAs。檢査結果A.正常組股骨頭邊界清楚，表面光滑，骨骺線清晰。B.造模組造模5周時開始出現雙側股骨頭密度增高，骺線不清楚，骨紋理不清晰，關節間隙正常，股骨頭無變形；未見股骨頭塌陷。C.轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組實驗動物右側為轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓側，密度稍增高，紋理較清楚；實驗動物左側為單純髓芯減壓側，股骨頭密度明顯增高硬化，紋理不清楚。D.本發明生物分裝劑治療組雙側股骨頭密度低於治療組，邊界清楚，紋理清晰。(2)對兔早期激素性ANFH治療的MRI檢查(見圖8)①實驗兔麻醉方法將獸用速眠新II注射液1支(1.5ml)與硫酸阿託品注射液1支(lml)混勻，臀肌注射，首次劑量按體重0.7-0.8ml/kg，30-40min後半量追加。②採用頭部正交線圈，將線圈中心定於髖關節位置。掃描序列選用快速自旋迴波序列(fastspinecho,FSE)，丁2加權像(T2weightedimaging,T2WI)TR/TE4500ms/96ms，T!加權像(Tiweightedimaging,乃WI)TR/TE550ms/20ms,以及T2WI脂肪抑制像(FS-T2WI)，均為2次採集，冠狀位，層厚3mm，層間隔0.3mm，掃描野(FieldofView，FOV)100xl00mm2。檢查結果A.正常組正常股骨頭雙側對稱，FS-T2WI股骨頭皮質下高信號脂肪、髖臼高信號脂肪均明顯被抑制呈低信號B.造模組關節腔積液增多；FS-T2WI幹骺端高信號，提示骨髓水腫，股骨頭松質骨出現小點/線狀不均勻高信號影，提示囊變壞死。C.轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組實驗動物右側為轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓側，左側為單純髓芯減壓側，MRIFS-T2WI可見右側關節腔積液較前減少，股骨頭點線狀高信號影左較治療側明顯，提示右側骨壞死囊變輕。D.本發明生物分裝劑治療組雙側股骨頭對稱，關節腔積液進一步減少，股骨頭點線狀高信號影較治療組弱。(3)對兔早期激素性ANFH治療的常規CT檢査(見圖9)①實驗兔麻醉方法將獸用速眠新II注射液1支(1.51111)與硫酸阿託品注射液1支(lml)混勻，臀肌注射，首次劑量按體重0.7-0.8ml/kg，30-40min後半量追加。②常規CT掃描實驗兔麻醉後仰臥固定於自製木板架上，雙髖關節呈外展位，儘量使雙側髖關節對稱。行包括髖關節上下緣的常規橫斷面掃描，掃描參數電壓100KV，電流220mA，探測器組合16x0.625mm，螺距0.625:1(床速5.62mm/r),重建層厚1.25mm，FOV直徑9.6cm。檢査結果A.正常組雙側股骨頭對稱，關節面清晰，皮質光滑、清晰、完整，骨質密度正常，骨松質紋理正常，骺線清楚。B.造模組股骨頭點狀低密度影，示囊變區，乾薪端密度增高，有骨硬化，股骨頭皮質模糊，關節受損，骨皮質變薄、密度減低。雙側股骨頭基本對稱。C.轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組實驗動物右側為轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓側，左側為單純髓芯減壓側，治療側股骨頭點狀低密度影較單純髓芯減壓組數量減少，提示治療組骨壞死輕；D.本發明生物分裝劑治療組:股骨頭點狀低密度影少於轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組，提示壞死程度更輕。(4)對兔早期激素性ANFH治療的CT灌注檢査(見圖10)具體實驗過程根據常規掃描圖像，定位選擇包括雙側股骨頭在內的lcm範圍內的層面，進行同層動態增強掃描。選擇軸掃(axial)模式，層厚2.5mmx4，lsl次，間隔ls，電壓、電流、FOV同上。碘海醇注射液4ml(約相當於1.5ml/kg)，用CT壓力注射器自耳緣靜脈自動推注，注射速度1.51111/3，注射後延遲0s開始掃描，共掃描45次，產生180帖圖像(每次4帖)，監控時間90s。檢査結果A.正常組雙側股骨頭基本對稱，BV較高呈紅色；B.造模組雙側股骨頭基本對稱，血容量較正常組明顯減少，呈蘭色；C.轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組實驗動物右側，血容量明顯恢復，BV較高呈紅色；D.單純髓芯減壓治療組實驗動物左側，血容量較治療組少，紅色/綠色區增多；E.本發明生物分裝劑治療組雙側血容量接近正常組，BV較高呈紅色。(5)對兔早期激素性ANFH治療的墨汁灌注造影(見圖ll)具體實驗過程動物麻醉後，靜脈注射肝素1萬IU，切開腹部，暴露腹主動脈，用帶12號針頭的聚乙烯管離心方向插入，生理鹽水加壓灌洗約3000ml，最後用墨水(上海墨水廠出品214型)和右旋糖酐(上海富民製藥廠)以7:3的比例混合注入血管約100ml，至雙側下肢皮膚、甲床變為均勻黑色。屍體放4'C冰箱過夜，第二天取材，置於4%多聚甲醛溶液固定3天；10%EDTA-PBS緩衝液脫鈣(將EDTA溶於0.02M,PH7.4的PBS緩衝液中製成)，每3天更換脫鈣液一次，觀察骨標本表面顏色並用物理法測定其脫鈣程度，直到滿意為止。取材逐級脫水，二甲苯透明，水楊酸酯鈉透明，切成50阿的切片，立體顯微鏡下觀察股骨頭形態結構和血管分布和生長情況。檢査結果A.正常組血管分布均勻豐富；B.模型組血管閉塞，血管稀少，股骨頭淺層血管幾乎消失；C.單純髓芯減壓治療組血管部分恢復，仍有明顯栓塞；D.轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組軟骨下血管重建，乾薪端大血管恢復。E.本發明生物分裝劑治療組血管重建，軟管下和幹骺端血管較均勻豐富。(6)對兔早期激素性ANFH治療的病理組織學觀察(HE染色，見圖12)實驗兔以空氣注射法處死，剖取雙側股骨頭連同幹骺端及股骨，肉眼觀察後，置於4%多聚甲醛溶液固定3天；10%EDTA-PBS緩衝液脫鈣(將EDTA溶於0.02M,PH7.4的PBS緩衝液中製成)，每3天更換脫鈣液一次，觀察骨標本表面顏色並用物理法測定其脫鈣程度，直到滿意為止。取材逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，然後行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察骨膜、軟骨組織、骨小梁、造血組織的變化。檢查結果A.正常組股骨頭關節面表面光滑，軟骨細胞排列整齊，骨小梁結構清晰，骨髓造血組織豐富；B.模型組股骨頭關節面不規整，部分軟骨細胞壞死脫落，結構紊亂，骨小梁變細，結構紊亂，骨細胞消失，骨髓中造血組織明顯減少或消失。C.單純髓芯減壓治療組造血組織部分恢復，但較為稀少，以脂肪細胞為主，可見空陷窩和血栓；幹骺端成骨細胞增殖旺盛，有新骨生成。D.轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組:骨小梁排列基本規則,骨基質量增多；仍可見少量空骨陷窩，邊緣有大量成骨細胞，骨髓中造血組織基本恢復。E.本發明治療組骨小梁排列基本規則，明顯有新骨生成，骨小梁骨板上可見新生毛細血管，骨髓中造血組織豐富，可見新生血管擴張。(7)對兔早期激素性ANFH治療的病理組織學觀察(VEGF免疫組化觀察，見圖13)實驗兔以空氣注射法處死，剖取雙側股骨頭連同幹骺端及股骨，肉眼觀察後，置於4%多聚甲醛溶液固定3天；10%EDTA-PBS緩衝液脫f5(將EDTA溶於0.02M，PH7.4的PBS緩衝液中製成)，每3天更換脫鈣液一次，觀察骨標本表面顏色並用物理法測定其脫銬程度，直到滿意為止。取材逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片。①病理切片經二甲苯和系列濃度的乙醇逐級脫蠟後，按前述方法行免疫組化檢測VEGF蛋白的表達。浸於雙蒸水中備用。②每張玻片上滴加適量0.01%胰酶消化細胞5min以暴露抗原。充分水洗。③每張玻片上滴加1滴或50nl過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10min。0.02MPBS衝洗3minx3次。除去PBS液，每張玻片上滴加1滴或50jxl封閉液，室溫下孵育10min。◎除去多餘的封閉液，每張玻片上滴加1滴或50filanti-hVEGF單克隆抗體(用10。/oBSA-PBS做l:100倍稀釋)。4'C過夜。⑥0.02MPBS衝洗5minx3次。除去PBS液，每張玻片上滴加1滴或生物素標記的第二抗體，室溫下孵育l0min。0.02MPBS衝洗3minx3次。⑦除去PBS液，每張玻片上滴加l滴或50^1鏈黴菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10min。0.02MPBS衝洗3minx3次。⑧除去PBS液，每張玻片上滴加2滴或lOOjd新鮮配製的DAB溶液(lml蒸餾水加顯色劑A、B、C各l滴，混勻)，顯微鏡下觀察至出現明顯的特異性染色。充分水洗。⑨蘇木素復染蘇木素染色5min，充分水洗後，1%鹽酸-乙醇分化23，充分水洗。玻片浸於水中反藍至適當的程度。⑩系列濃度的酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡觀察照相。A.正常組軟骨細胞和血管內膜上可見淡黃色顆粒，有較低水平的VEGF表達。B.模型組血管內膜VEGF表達缺失，骨髓腔中不見破骨細胞，少見成骨細胞。C.單純減壓治療組血管內皮細胞和骨小梁表面的成骨細胞可見淡染黃色顆粒，VEGF表達水平較D治療組低。D.轉HGF基因的BMSCs移植+髓芯減壓治療組VEGF表達上升。血管內皮細胞和骨小梁表面的成骨細胞可見深染黃色顆粒，成骨細胞和破骨細胞功能活躍。E.本發明分裝劑治療組VEGF表達顯著上升。成骨細胞成多層粘貼在骨小梁表面，並成批演化為骨細胞。髓腔中骨小梁之間破骨細胞增多，緊貼於壞死骨小梁的表面，功能活躍。陽性軟骨細胞顯著上升，軟骨下陽性血管明顯增多。結果表明，本發明生物分裝劑用於髓芯減壓術能有效促進壞死區血管再生和骨質重建，並且效果優於的轉HGF基因的BMSCs聯合髓芯減壓治療組和單純髓芯減壓治療組。SEQUENCELISTING南方醫科大學—種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑2Patentlnversion3.3128DNA人工序列1tagagctcatgtgggtgaccaaactcct28228DNA人工序列2tagtcgacctatgactgtggtaccttat28權利要求1、一種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，該生物分裝劑由以下試劑組成試劑I纖維蛋白原和抑肽酶的混合水溶液，其中纖維蛋白原的含量為60～100mg/mL，抑肽酶的含量為1000～3000KIU/mL；試劑II凝血酶和CaCl2的混合水溶液，其中凝血酶的含量是250～500IU/mL，CaCl2的含量是CaCl240mmol/mL；試劑III轉基因骨髓基質幹細胞，其中所含的外源基因是編碼人肝細胞生長因子的基因；所述的骨髓基質幹細胞為同種異體骨髓基質幹細胞或自體骨髓基質幹細胞。2、根據權利要求1所述的治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，其特徵在於所述的試劑I中各組分的含量為纖維蛋白原80mg/mL，抑肽酶2000KIU/mL。3、根據權利要求1所述的治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，其特徵在於所述的試劑II中凝血酶的含量為400IU/mL。4、根據權利要求l、2或3所述的治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，其特徵在於所述的試劑I中各組分的含量為纖維蛋白原80mg/mL，抑肽酶2000KIU/mL;所述的試劑II中凝血酶的含量為400IU/mL。全文摘要本發明提供了一種治療早期股骨頭缺血性壞死的生物分裝劑，該生物分裝劑主要由纖維蛋白原、凝血酶和轉HGF基因骨髓基質幹細胞組成。該生物分裝劑中的試劑是在行髓芯減壓術以雙聯注射器經減壓隧道注入兔股骨頭壞死區，纖維蛋白膠在凝血酶的作用下形成立體網狀結構凝膠作為轉HGF基因骨髓基質幹細胞的支架，並控制細胞分泌的HGF緩慢釋放，達到防止移植的轉基因骨髓基質幹細胞流失，維持HGF局部有效的作用濃度的目的，進而促進壞死區血管再生和骨質重建。文檔編號A61K38/48GK101108253SQ20071002841公開日2008年1月23日申請日期2007年6月5日優先權日2007年6月5日發明者驪馬申請人:南方醫科大學