中藥材或中藥製劑中細胞保護生物活性測定的新方法
2023-08-11 13:24:06 3
中藥材或中藥製劑中細胞保護生物活性測定的新方法
【專利摘要】本發明公開了一種適合水蛭、地龍等中藥材或由其組成的中藥製劑細胞保護生物活性測定方法，體外實驗證明水蛭或地龍的提取液能夠劑量相關的激活ERK激酶所在的信號傳導通路，因此本發明通過採用蛋白免疫印跡法測定ERK等激酶的激活作用可反映含有水蛭或地龍藥材成分的藥物製劑的細胞保護活性，方法重現性較好。
【專利說明】中藥材或中藥製劑中細胞保護生物活性測定的新方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥製劑的新發現的一種生物活性或者根據該活性研製的質量檢測方法，確切的說，本發明涉及一種含有水蛭或地龍藥材成分的中藥製劑的新發現的生物活性及其測定方法，該方法可用於產品的質量控制或有效成分的確定。
【背景技術】
[0002]近年來，絲裂原激活蛋白激酶家族(mitogenactivated protein kinases, MAPKs)在適應性細胞保護中的作用日益受到重視。MAPK酶屬於酪氨酸激酶系統，是信號從細胞外轉到細胞內的傳遞者。它可以誘導某些應激性蛋白的快速表達，如熱休克蛋白、超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶、ATP敏感性鉀通道、抗氧化因子等，而這些內源性效應分子表達的增加是預處理延遲保護的物質基礎。
[0003]細胞外信號調節蛋白激酶(Extracellularsignal-regulated kinases,ERKs)是MAPK家族的成員之一，分為ERKl (p44)和ERK2 (p42)兩種同工型。細胞外的不同刺激如絲裂原、生長因子、血管緊張素6和氧化應激等均可激活ERKs。活化的ERKs主要參與細胞生長、分化和抗凋亡作用。Guyton等(Guyton KZ, Liu Y, GorospeM，Xu Q，Holbrook NJ.Activat1n of mitogen-activated protein kinase by H2O2.Role in cell survival following oxidantinjury.J B1l Chem.1996Feb23 ；271 (8):4138-42.)報導，ERK可對抗氧化應激損傷，提高細胞存活率。神經遞質去甲腎上腺素可通過激活ERK1/2而增強對多巴胺能神經元的保護作用(Troadec JD, Marien M,Mourlevat S, eT al.Activat1n of the mitogen-activated protein kinase(ERK(1/2))signaling pathway by cyclic AMP potentiates the neuroprotective effect of theneurotransmitter noradrenaline on dopaminergic neurons.Mol Pharmacol.2002Nov ；62(5):1043-52.)。ERK 的激活也能促進 PC12 細胞的生長(Hansen Tv，Rehfeld JF，NielsenFC.KCl potentiates forskolin-1nduced PC12celI neurite outgrowth via proteinkinase A and extracellular signal-regulated kinase signaling pathways.NeurosciLett.2003Augl4 ；347(1):57-61.)。越來越多的研究表明，ERK在多種預處理引起的細胞保護中起著重要的作用。也有報導指出，ERK1/2參與了藥物或缺血預處理誘導的心肌延遲保護作用(Fryer RM, Hsu AK, Gross GJ.ERK and p38MAP kinase activat1n are componentsof op1id-1nduced delayed card1protect1n.Basic Res Card1l.2001Apr ；96 (2):136-42.)。因此，ERK的細胞保護作用是多方面的。
[0004]水蛭是一味傳統的中藥，始載於《神農本草經》，中醫認為它具有破血、逐瘀、通經的作用。歷來用於治療症瘕、痞塊、血瘀閉經、跌打損傷。現代醫學發現水蛭主含蛋白質，此外含有17種胺基酸，包括人體必需的8種胺基酸，還含有Zn、Mn、Fe、Co、Cr、Se、Mo、Ni等14種元素。具有抗凝、降低血小板聚集率、降低血脂、抗炎作用等。水蛭中的水蛭素是作用最強的凝血酶特異性抑制劑，它不僅能阻止纖維蛋白原的凝固，也可阻止凝血酶催化的進一步血瘀反應，如凝血誘導的血小板反應等。由於水蛭素能有效地抑制游離的和凝血塊上的凝血酶，因此可用以防止各類血栓的形成及延伸。
[0005]地龍也是一味傳統中藥，在《神農本草經》列為下品，具有清熱定驚、通絡、平喘、利尿的功效。常炒制後用於高熱、神昏、驚癇抽搐、關節痺痛、肺熱喘咳、尿少水腫、高血壓等症。李時珍在《本草綱目》稱之為具有通經活絡、活血化瘀、預防治療心腦血管疾病作用，在《本草綱目》虫部中有40多種藥用作用。現代研究表明，地龍含有豐富的酶類，其中纖維蛋白溶解酶、蚓激酶、蚓膠質酶對體內凝血和纖溶系統具有廣泛的影響。含有地龍成分的中藥製劑如複方地龍膠囊、腦心通膠囊等臨床廣泛用於腦中風等疾病的防治。
[0006]含有水蛭或地龍藥材的中藥製劑多具有抗凝、溶栓等多方面生理活性，臨床上多用於心腦血管相關疾病的防治。近年來，由於細胞保護劑在臨床上應用的日益廣泛，對傳統中藥的細胞保護作用的研究也越來越多。一系列的文獻報導含有水蛭或地龍的多種中藥製劑具有明顯的細胞保護活性。由水蛭和地龍兩味藥材組方的中藥注射劑疏血通注射液，研究表明可以抑制局灶腦缺血(MCAO)模型大鼠的神經細胞凋亡(張璇，胡長林疏血通注射液對大鼠急性腦梗死神經細胞凋亡及相關基因表達的影響[J].江西中醫學院學報，2005，
(I):58-60 ;)，減輕自由基介導的缺血性腦組織損傷(張璇，吳蘇寧，張林亭疏血通注射液對局灶腦缺血自由基損傷的腦保護作用[J].實用心腦肺血管病雜誌，2007，(2):94-95)。處方中含有地龍的中藥複方製劑腦心通膠囊，對大鼠腦微血管內皮細胞模擬腦缺血再灌注損傷有明顯的保護作用(劉振權，徐秋萍，張文生等[J].中國藥學雜誌，2007，(10):733-736)。但是，由於中藥成分的複雜性，對於這類中藥製劑的細胞保護活性，多數只能確證活性，但並不能明確其靶點或作用機制，也就沒有很好的測定這類活性的體外生物學方法。
[0007]發明人收集了含有水蛭、地龍藥材組方的一些中藥製劑，並對其進行了研究。發現這類中藥製劑具有激活細胞ERK激酶的活性，進一步對ERK激酶所在的信號通路相關蛋白或激酶靶點進行研究，發現EGFR、Sr c、MAPK、PKC、Akt、P13K等分子也能被激活，這與附圖1中所述的細胞保護相關信號通路是一致的。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是克服現有含水蛭或地龍藥材的中藥製劑細胞保護生物活性測定方法的不足，提供一種新的體外生物活性檢測方法，以控制產品的質量或可進一步分離並純化有效物質。
[0009]本發明提供的測定含水蛭或地龍藥材的中藥製劑細胞保護生物活性測定方法，主要包括以下步驟:
[0010](I)配製製劑供試品溶液:對於注射劑，可直接取注射液作為供試品溶液，注射用粉針劑可以採用無菌生理鹽水溶解後作為供試品溶液，固體製劑可以採用適當方法提取活性成分後，用水、生理鹽水或緩衝液溶解後無菌過濾作為供試品溶液。
[0011](2)細胞培養:採用細胞培養皿或細胞瓶培養細胞，當達到90-95%的覆合度時，傳代培養。
[0012](3)供試品激活並製備細胞裂解液:傳代細胞達到80-90%覆合度後，採用無血清培養基培養。使用含供試品的無血清培養基激活細胞5?20min後，洗滌並裂解細胞。將細胞裂解液離心取上清，進行蛋白定量測定。[0013](4)蛋白電泳-免疫印跡分析:按常規操作，使用ECL試劑檢測信號，並定量。
[0014]所述步驟(1)中固體製劑的供試品配製方法為精密稱取固體製劑0.1~10g，採用水、生理鹽水或甲醇、乙醇溶液提取，提取方式可以採用浸泡、加熱提取或超聲提取，提取液減壓濃縮至乾燥，用水、生理鹽水或Tris緩衝液溶解後作為供試品溶液。
[0015]所述步驟(2)中細胞培養器皿採用1cm直徑的細胞培養皿，也可以採用細胞培養瓶。根據細胞類型不同傳代時可用胰酶消化，也可以不用。細胞培養和傳代具體條件可參考ATCC相關培養說明。
[0016]所述步驟(4)中ECL試劑盒檢測信號定量的方法可以採用對纖維素膜上的信號進行光敏膠片顯影，然後對顯色條帶的灰度進行掃描積分獲得。也可以採用凝膠成像分析儀等設備進行積分定量。以不含供試藥品的溶劑對照所得信號值為V1，供試品所得的信號值為V2，則細胞保護生物活性可以相關激酶激活上調率表示:
[0017]細胞保護活性(％)
【權利要求】
1.一種含有水蛭或地龍成分的中藥製劑的生物活性檢測方法，其特徵在於，通過檢測ERK激酶所在信號傳導通路的激活反映該中藥製劑的細胞保護生物活性。
2.根據權利要求1所述的細胞保護生物活性，其特徵在於，其細胞保護作用涉及的人體組織或器官有心臟、腎臟、肝臟、肺以及腦神經和血管。
3.根據權利要求1所述的生物活性測定方法，其特徵在於，所檢測的ERK激酶信號通路中的蛋白分子包括EGFR、Src、MAPK、PKC、Akt、P13K等分子。
4.根據權利要求1所述的生物活性測定方法，其特徵在於，所檢測ERK激酶所在信號傳導通路的激活採用的細胞類型為哺乳動物細胞。
5.根據權利要求1所述的生物活性測定方法，其特徵在於，提取這類中藥材或中藥製劑纖溶活性成分後進行測定，提取方法可以採用水溶液或有機溶劑提取，供試品溶液應為水性溶液。
6.根據權利要求1所述的生物活性測定方法，其特徵在於，通過蛋白免疫印跡法測定激酶的激活以間接反映含有水蛭或地龍成分的中藥製劑的細胞保護作用。
【文檔編號】G01N33/68GK104034900SQ201410162543
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】李振國, 陳豔明, 張忠兵 申請人:牡丹江友搏藥業股份有限公司