檢測幽門螺桿菌抗原的免疫膠體金試紙及其製備方法
2023-08-11 12:35:51
專利名稱：檢測幽門螺桿菌抗原的免疫膠體金試紙及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測抗原的免疫膠體金試劑及其檢測方法，同時還涉及該試劑的製備方法。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)在全世界人群中的慢性感染率達50％以上，在我國普通人群的感染率約為50％--80％，並仍以每年1％--2％速度增加。Hp是B型胃炎、消化性潰瘍及胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的主要致病因素，並且與胃癌的發生密切相關，現已被WTO列入第一級生物致癌源。還可引起其他疾病如冠心病絞痛、兒童生長遲緩或消化不良、蕁麻疹、免疫性血小板紫癜、肝昏迷、症狀性低血糖、高血壓、膽結石。
流行病學顯示，人群中幾乎一半人終生感染幽門螺桿菌，但只有10％的感染者發展為有明顯症狀的消化性潰瘍、胃炎，甚至胃癌。在患慢性胃炎的病人中，證實有70~90％的幽門螺桿菌感染率，Hp感染的準確診斷有利於控制Hp傳播與流行及根除Hp感染治療的監測。
目前，國內外診斷幽門螺桿菌感染的方法從檢測手段上分為侵入性和非侵入性兩大類。其中，侵入性方法有通過胃鏡取胃液或胃黏膜標本進行分離培養，直接塗片鏡檢；快速尿素酶試驗，藥敏試驗；非侵入性方法中有13C和14C-尿素呼吸試驗、PCR技術和血清學檢測Hp的IgG抗體。根據患者的症狀嚴重程度、危險因素、病史、用藥情況、檢測方法的特點和相關費用等，可以選擇不同的方法。
內窺鏡檢查取活檢標本進行組織學檢查是侵襲性的，儘管檢測結果比較準確，但由於Hp培養難度較大，活檢組織Hp培養成功率僅僅在70％--80％，同時需要內窺專家和病理專家；快速尿素酶試驗，市場上有試劑盒供應，但產品質量標準不統一，檢測結果出入很大，因此在臨床應用上造成了一些混亂。同時，消化道其他一些細菌如空腸螺桿菌、變形桿菌也產生尿素酶，使該法的特異性也受到影響。以上方法最大的缺點是必需通過胃鏡取標本。除了會造成胃病患者額外增加一些損傷與痛苦，若消毒不嚴密，胃鏡檢查本身就是一種傳播Hp感染的媒介。
非侵入性診斷方法中的使用同位素13C、14C和15N-尿氨示蹤能即時檢測全胃的感染情況，中國專利01809797.9和96119034.5中公開了該技術的應用與改進，但由於受設備限制而難於普遍推廣。
PCR法對根除Hp治療後的監測較為準確，但是對檢測人員的專業知識及操作技術的要求比較高，不適合在基層醫院的應用。
血清學的檢測手段，如用全菌或粗製抗原檢測患者血清中的Hp抗體，由於與空腸彎曲菌存在共同抗原，敏感性可能較高，但特異性較差。若用第三代精製抗原(測Hp的尿素酶或外膜蛋白等)特異性較高，但敏感性可能會削弱一些。在中國專利95108003.2、美國專利5262156和歐洲專利0329570中公開了此類技術。但是，血清學陽性只能說明患者必定感染過Hp，或者該患者目前還可能在感染中。但是由於胃中Hp經治療後已被殺滅，血清中IgG不可能立即降下來，還可持續6～12個月，因此血清抗體測定一般不適宜用作對根除Hp治療效果的監測。
中國專利01223042.1、02115746.4和97103112.6中公開了通過使用針對幽門螺桿菌的多克隆抗體直接從糞便中檢測幽門螺桿菌的方法。然而，多克隆抗體通常具有交叉反應性，在特異性上較差，此外，多克隆抗體的滴度和特異性可以隨抗血清的批次而變化，難於進行質量控制，造成假陽性和低特異性的問題(Medical Tribune，4-5，1999.6.3；Am JGastroenterol.941830～1833，1999)。但毫無疑問，直接檢測Hp抗原，可以了解患者當前的感染狀態。
尿素酶為Hp的特徵酶，其主要活性部分位於菌體表面，可分解尿素產生大量的氨，對Hp的定植和生存起著重要的作用，但尿素酶在其它細菌中如空腸彎曲桿菌、結彎曲菌、變形桿菌屬、摩根菌屬、普羅威登斯菌也有發現，故僅以尿素酶的單克隆抗體來檢測Hp感染會存在假陽性；細胞空泡毒素(VacA)能使細胞產生空泡變性的蛋白，Mr87000，是Hp導致潰瘍的毒力因子之一；細胞毒素相關蛋白(CagA)，Mr120000～140000，無致空泡變性的作用，但與VacA之間存在良好的相關性。研究表明，只有產生細胞毒素相關蛋白A(CagA)的Hp菌株才有致病性，而60％一80％的Hp表達CagA，CagA與慢性胃炎及消化性潰瘍有密切關係，同時CagA可能是胃癌發生的一個重要因素(臨床兒科雜誌2003，21(12)779-801)。因此，本發明採用抗Hp尿素酶單克隆抗體與抗細胞空泡毒素或細胞毒素相關蛋白抗原的單克隆抗體其中兩種組合，製備成免疫膠體金試紙，檢測哺乳動物口腔唾液、胃液、返流嘔吐、牙斑、糞便中存在的幽門螺桿菌抗原，從而監測患者幽門螺桿菌的感染狀態，輔助醫生對胃炎、消化性潰瘍等疾病病因的診斷，提示胃癌發生的可能性。
本發明目的是為了克服現有技術在使用中存在的缺陷，提供一種不需要特定儀器設備並且有效、快速、準確測定人體中幽門螺桿菌及高毒力幽門螺桿菌感染的即時情況，同時能有效的降低檢測成本，減輕病人的接受檢查時的痛苦，並減小檢測人員的工作量。
發明內容
本發明提供了一種檢測唾液中幽門螺桿菌的免疫膠體金試紙及其製備方法。該試紙條包括吸水紙，玻璃纖維膜，硝酸纖維素膜，吸水纖維及PVC底板組成。PVC背襯一端依次粘有吸水紙，玻璃纖維膜，中間黏附硝酸纖維素膜，另一端粘附有吸水纖維。其中玻璃纖維膜上吸附著金標尿素酶單克隆抗體1A及金標VacA或CagA單克隆抗體2A或3A混合物，硝酸纖維素膜上依次包被著尿素酶不同表位的單克隆抗體1B，及抗VacA或CagA不同表位的的單克隆抗體2B或3B和抗鼠的多克隆抗體。
該試紙的製備方法包括以下步驟(1)幽門螺桿菌單克隆抗體的製備用純化的幽門螺桿菌抗原去多次免疫BALB/C小鼠，獲得幾株單克隆抗體。這幾株單克隆抗體經過電泳分析，效價測定及特異性的比較，篩選出六株單克隆抗體1A、1B、2A、2B、3A、3B。即單克隆抗體1A、1B經鑑定分別為抗尿素酶的不同表位的單克隆抗體，2A、2B為抗不同表位的空泡細胞毒素A的單克隆抗體，單克隆抗體3A、3B為抗不同表位的空泡細胞毒素的單克隆抗體。
(2)單克隆抗體的大量製備及提純將產生單克隆抗體的兩株雜交瘤細胞注射於已致敏的小鼠腹腔，一周後收集腹水，離心，即可獲取大量的單克隆抗體。大量的單克隆抗體須經硫酸銨分級抽提、PBS透析、離心、Sephedex G-200柱層析等步驟得以純化。
(3)兔抗鼠或羊抗鼠多克隆抗體的製備提取鼠血清免疫家兔或山羊，純化後得兔抗鼠或羊抗鼠的多克隆抗體。
(4)製備膠體金用檸檬酸三鈉等還原劑並且通過微波爐將氯金酸還原成10-50nm左右的膠體金顆粒。
(5)製備幽門螺桿菌單克隆抗體膠體金標記物膠體金與幽門螺桿菌單克隆抗體1A，2A或3A分別按一定比例混勻，使膠體金與抗體形成單克隆抗體1A，2A或3A膠體金標記物。
(6)單克隆抗體1A和2A或3A膠體金標記物混合後包被在玻璃纖維膜上，將單克隆抗體1B、2B或3B和抗鼠多克隆抗體分別包被在硝酸纖維素膜上的檢測區1、2和質控區，充分乾燥。
檢測結果
第一條檢測帶尿素酶抗原陽性表明患者體內存在幽門螺桿菌或其它有尿素酶抗原菌的感染，如為流行病普查，則要警剔；如為Hp根除治療監測，提示醫生Hp感染的存在；第二條檢測帶同時呈現陽性，說明患者感染了高毒力的Hp。
具體實施例方式
實施例一幽門螺桿菌抗原製備Hp國際標準株NCTC11637，經系統鑑定後接種於含10％脫纖維羊血的Skirrow瓊脂中，置於5％O2、10％CO2、和85％的N2的環境條件下，37℃培養3d後收菌。4000轉/分離心10分鐘，棄上清，沉澱加1×PBS緩衝液，吹散，用超聲波粉碎、濃縮，即為抗原，蛋白濃度為5mg/ml。
實施例二免疫膠體金試紙1的製備將PVC背襯一端依次粘有吸水紙，玻璃纖維膜，中間黏附硝酸纖維素膜，另一端粘附有吸水纖維。其中玻璃纖維膜上吸附著金標尿素酶與空泡毒素A的單克隆抗體混合物，硝酸纖維素膜上檢測區1、2分別包被有相應的抗尿素酶及抗空泡毒素A不同表位的單克隆抗體，羊抗鼠的多克隆抗體包被在硝酸纖維素膜上作為質控區。
按以下步驟製備(1)幽門螺桿菌單克隆抗體的製備用幽門螺桿菌抗原去多次免疫BALB/C小鼠，獲得十株單克隆抗體。這十株單克隆抗體經過電泳分析，效價測定及特異性的比較，篩選出來四株單克隆抗體1A、1B、2A、2B，這四株單克隆抗體經蛋白質大小的鑑定分別為抗尿素酶的單克隆抗體和抗空泡細胞毒素A單克隆抗體。
(2)單克隆抗體的大量製備及提純將產生單克隆抗體的兩株雜交瘤細胞注射於已致敏的小鼠腹腔，一周後收集腹水，離心，即可獲取大量的單克隆抗體。大量的單克隆抗體須經硫酸銨分級抽提、PBS透析、離心、Sephedex G-200柱層析等步驟得以純化。
(3)羊抗鼠多克隆抗體的製備提取鼠抗血清免疫家兔，純化後得兔抗鼠的多克隆抗體。
(4)製備膠體金將100ml0.01％氯金酸(HAuCL4)放於微波爐中，在高檔沸騰2分鐘，迅速一次加入40ml的檸檬酸三鈉水溶液，放於微波爐中在中檔保持3分鐘，出現透明的橙紅色。
(5)製備幽門螺桿菌單克隆抗體1A和2A膠體金標記物用0.1M K2CO3調膠體金溶液PH至等電點8.2左右；將膠體金與幽門螺桿菌單克隆抗體1A或2A按一定比例混勻，使膠體金與抗體形成單克隆抗體1A、2A膠體金標記物。再通過多次離心，棄上清，清洗，濃縮形成門螺桿菌單克隆抗體1A或2A膠體金標記物，冷藏備用。
(6)單克隆抗體1A和2A膠體金標記物混合包被在玻璃纖維膜上，將單克隆抗體1B，2B和羊抗鼠多克隆抗體分別包被在硝酸纖維素膜上的檢測區1、2和質控區，充分乾燥。
(7)將PVC背襯一端依次粘有吸水紙，玻璃纖維膜，中間黏附硝酸纖維素膜，另一端粘附有吸水纖維。
(8)將粘好的PVC材料切成一定寬度的試紙條，即製成檢測口腔唾液中幽門螺桿菌抗原的免疫膠體金試紙。
實施例三免疫膠體金試紙2的製備將PVC背襯一端依次粘有吸水紙，玻璃纖維膜，中間黏附硝酸纖維素膜，另一端粘附有吸水纖維。其中玻璃纖維膜上吸附著金標尿素酶與細胞相關毒素A的單克隆抗體混合物，硝酸纖維素膜上檢測區1、2分別包被有相應的抗尿素酶及抗細胞相關毒素A不同表位的單克隆抗體，兔抗鼠的多克隆抗體包被在硝酸纖維素膜上作為質控區，其它操作與實施例二相同。
實施例四試紙條檢測待檢樣品處理唾液、胃液、返流嘔吐物、牙菌斑、糞便待檢樣品的處理取一定量的樣品，按1∶10稀釋於樣品緩衝液1×PBS中，充分攪拌混勻，200轉/分離心2分鐘，取上清液，7000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清，沉澱重懸於樣品緩衝液中，600W超聲10次，待檢。
將試紙條在室溫條件下放置30分鐘，使其恢復至室溫；從鋁箔袋中取出檢測試劑條，按MARK線下箭頭所示的方向將試劑條浸入樣本溶液中，3-15分鐘即可判斷檢測結果。
結果判斷陽性結果，質控線上呈現紅色條帶，一條檢測線呈現紅色，說明有幽門螺桿菌感染，強毒株幽門螺桿菌感染質控線上呈現紅色條帶，同時會有兩條檢測線呈現紅色；陰性結果，無檢測線呈現紅色，但質控線上呈現紅色條帶，說明樣本中沒有幽門螺桿菌的存在；如果質控線上不出現紅色條帶，則產品失效。
實施例五免疫膠體金試紙臨床應用結果應用「細菌培養法」金標準與本發明試紙檢驗100位疑似幽門螺桿菌感染者，「細菌培養法」金標準，尿素酶陽性率為86％；用本發明試紙條檢測唾液樣品，陽性率88％，強毒株感染陽性率為41％；胃液樣品陽性率90％，強毒株感染陽性率為45％；糞便樣品陽性率92％，強毒株感染陽性率為44％。共同檢為陰性者做PCR擴增，均未出現幽門螺桿菌特異性條帶，與金標準檢測不符者，均有幽門螺桿菌特異性條帶。
說明書附
圖1為試紙條正視圖及正面各區段說明，說明書附圖2為試紙條檢測結果說明。
權利要求
1.一種測定樣品中幽門螺桿菌抗原的免疫膠體金試紙，包括吸水紙、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、吸水纖維及PVC底板，其特徵在於1)在玻璃纖維膜上包被抗幽門螺桿菌抗原的金標單克隆抗體1A和2A或3A的混合物，在硝酸纖維膜上檢測區依次包被幽門螺桿菌抗原單克隆抗體1B和2B或3B；2)在硝酸纖維膜上的質控區包被抗IgG的多克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌抗原的免疫膠體金試紙，其特徵在於金標單克隆抗體1A為抗尿素酶單克隆抗體，金標單克隆抗體2A為抗空泡毒素A抗原，3A為抗細胞毒素相關蛋白A抗原，單克隆抗體2B為抗尿素酶抗原，單克隆抗體2B為抗空泡毒素A抗原，3B為抗細胞毒素相關蛋白A抗原。
3.根據權利要求1所述的幽門螺桿菌抗原的免疫膠體金試紙，其特徵在於可以用於檢測口腔唾液、胃液、返流嘔吐物、牙斑、糞便樣品。
全文摘要
本發明涉及一種檢測幽門螺桿菌抗原的免疫膠體金試紙及其製備方法。該試紙包被了尿素酶單克隆抗體、CagA或VacA單克隆抗體和抗鼠的多克隆抗體，用以檢測哺乳動物口腔唾液、胃液、返流嘔吐、牙斑、糞便中存在的幽門螺桿菌相關抗原，從而監測患者幽門螺桿菌的感染狀態，輔助醫生對胃炎、消化性潰瘍等疾病病因的診斷，提示胃癌發生的可能性。本發明具有取樣簡便，特異性強，敏感性高，幾分鐘即可肉眼觀測結果等特點。
文檔編號G01N33/543GK1847854SQ200510200228
公開日2006年10月18日 申請日期2005年4月11日 優先權日2005年4月11日
發明者李紅玉, 肖曼, 李靜賢 申請人:蘭州大學