螢光素酶活性片段及其應用的製作方法

2023-07-08 13:12:06 1

專利名稱：螢光素酶活性片段及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學和細胞生物學研究領域，具體涉及Gaussia螢光素酶活性核 心片段GLuc 148的改造和應用。
背景技術：
螢光素酶(Luciferase)是生物體內催化螢光素或脂肪醛氧化發光的一類酶的總 稱。由於其獨特的發光特點和檢測簡便、靈敏、快速，螢光素酶基因在基因工程方面已成 為廣泛使用的報告基因(reporter)；其在發光免疫分析、活體成像、活細胞共振能量轉移 (BRET)及環境監測、微生物檢測等方面的應用也愈來愈受到關注。目前研究最多且常用的螢光素酶主要是細菌螢光素酶(Bacterial Luciferase, 簡稱BLuc)、螢火蟲螢光素酶(Firefly Luciferase, FLuc)和海腎螢光素酶(Renilla Luciferase, RLuc)。相比而言，這些螢光素酶分子量相對較大，酶蛋白在溶液中的穩定性較 差，有的在使用時需要共激活因子如ATP、Mg2+離子或Ca2+離子等，這在很大程度上限制了 它們的應用範圍。Gaussia螢光素酶(Gaussia Luciferase，簡稱GLuc)是從海洋橈腳類動物中分離 出的一種新型螢光素酶，目前關於它的研究和報導較少。GLuc不需要ATP來催化底物腔腸 素(coelenterazine，CTZ)的氧化反應，且與其它發光報告基因相比還有許多如下的獨特 優勢(1)GLuc的螢光信號比RLuc和FLuc高約1000倍，這使其成為更理想的轉錄報告 因子；(2) Gluc表達時分泌進細胞培養液中，測定不需要裂解細胞；(3)在哺乳動物細胞中表達相對更穩定，為檢測提供了便利；(4)GLuc只有185個胺基酸，是所有已知螢光素酶中分子量最小的一種，便於進行 性質改造和優化，未來可能成為最有發展前景的一種工具酶。雖然，GLuc具有上述優點，但本領域仍然需要開發出分子量更小、可在真核細胞中 非分泌型表達並產生強螢光信號的發光報告基因。

發明內容
本發明的目的之一正是提供一種經改造的螢光素酶，其具有發光活性高、不需要 輔因子、生化性質穩定、分子量更小、在真核細胞中非分泌型表達，更適合作為報告因子和 螢光能量供體，應用於細胞和活體成像、高通量篩選、微生物檢測等技術領域。具體而言，在本發明的第一方面，提供了一種螢光素酶活性片段，所述活性片段的 序列是Gaussia螢光素酶缺失N端37個胺基酸殘基所形成的序列，並且所述活性片段具有 與野生型Gaussia螢光素酶一致的螢光素酶活性。在本發明的一個實施方式中，所述活性片段適於在原核或真核細胞內表達。在本發明的另一個實施方式中，所述活性片段具有SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列。在一個優選例中，所述螢光素酶活性片段的分子量為16kDa。在另一個優選例中，所述螢光素酶活性片段為非分泌型表達。在本發明的第二方面中，提供了本發明螢光素酶活性片段的編碼序列。在本發明的一個實施方式中，所述編碼序列選自⑴如SEQ ID NO 1所示的序列；和(ii)在嚴格條件下能與SEQ ID NO 1的序列雜交的分子。在本發明的另一個實施方式中，所述編碼序列經密碼子偏愛優化。在本發明的第三方面中，提供了本發明的螢光素酶活性片段或其編碼序列在作為 報告因子、螢光能量供體中的用途。在本發明的第四方面中，提供了本發明的螢光素酶活性片段或其編碼序列在細胞 或活體成像、藥物的高通量篩選、微生物檢測或蛋白質拓樸結構鑑定中的用途。在本發明的第五方面中，提供了一種試劑盒，其包含本發明的螢光素酶活性片段 或其編碼序列。在一個優選例中，所述試劑盒還任選包含用於測試的容器、緩衝液、底物、稀釋劑 和/或使用說明書。在本發明的第六方面中，提供了一種製備螢光素酶活性片段的方法，所述方法包 括步驟使得Gaussia螢光素酶缺失N端37個胺基酸殘基。在一個優選例中，所述缺失是通過化學合成、或使用重組技術從原核或真核宿主 中產生相關序列而完成的，優選所述宿主選自細菌、酵母、高等植物、昆蟲或哺乳動物細 胞。在本發明的另一實施方式中，提供了一種鑑定蛋白質拓樸結構的方法，所述方法 包括將螢光素酶活性片段插入待確定其拓樸結構的蛋白質的不同位點，從而獲得融合 蛋白；以及檢測融合蛋白所產生的螢光強度；若螢光強度低，則表明融合位點位於細胞質中；若螢光強度高，則表明融合位點位於周質空間中。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。附圖簡述

圖1 =Gaussia螢光素酶(GLuc)的一級序列分析和二硫鍵的質譜鑑定及GLucl48 的DNA序列。圖IA為Gluc的一級結構，其中示出了經質譜法鑑定所確認的三對二硫鍵C2-C3、 C4-C5和 C9-C10 ；圖IB為根據原核生物和真核哺乳動物偏愛密碼子合成的Gluc 185和GLuc 148 的 DNA 序歹Ij (SEQ ID NO 1)；圖IC為人工合成GLuc 148的DNA序列與天然序列的比較。圖2 活性片段GLuc 148的克隆、純化和鑑定。
圖2A為通過實施例2所述方法分離得到蛋白質的凝膠過濾層析圖；圖2B為目的蛋白的SDS-PAGE電泳鑑定。圖3 活性片段GLuc 148的螢光發光光譜。圖3A為野生型Gaussia螢光素酶的作用底物腔腸素(Coelenterazine)的結構示 意圖；圖;3B為由Gluc催化底物的氧化反應，該反應生成CO2並同時發出波長為480nm的
.監.J (λ ；圖3C為純化得到的活性片段GLuc 148催化腔腸素的氧化反應時的發光光譜。圖4:活性片段GLuc 148與野生型GLuc、以及Gluc 169和Gluc 142的發光活性 比較，以螢光素酶濃度為橫坐標，發光強度為縱坐標，取對數作圖。圖4A為活性片段GLuc 148與野生型GLuc的發光活性比較；圖4B為活性片段GLuc 148與Gluc 169和Gluc 142的發光活性比較。圖5 不同CcmH片段融合GLuc 148在活體大腸桿菌中表達的發旋光性質。圖5A為不同CcmH片段融合GLuc 148在活體大腸桿菌中表達的相對發光強 度，CcmH123-GLuc 148， CcmH138_GLuc 148， CcmH196_GLuc 148， CcmH256_GLuc 148， CcmH288-GLuc 148和CcmH;345-GLuc 148分別表示將GLuc 148融合在大腸桿菌內膜蛋白 CcmH的不同位點所形成的融合片段；圖5B為通過免疫印跡法檢測融合蛋白的表達量(抗His-tag抗體)。圖6 =GLuc 148和GL uc在真核細胞中表達的發光活性比較。圖 6A 為 GLuc 148 和 GLuc 在 HEK 293T 表達量(抗 myc 抗體)；圖6B和圖6C分別為GLuc和GLuc 148在真核細胞中表達後，在細胞裂解液和培 養液中的螢光素酶活性。圖7 免疫印跡法檢測活性片段GLuc 148和N端缺失43個AA的Glucl42在真核 細胞中表達的表達穩定性。其中，以ρ⑶NA3. 1為空質粒陰性對照。
具體實施例方式本發明人通過長期而深入的研究發現，通過使得Gaussia螢光素酶(Gluc)N端37 個胺基酸缺失的方法，可獲得一種Gluc的活性片段(命名為GLuc 148)。經研究表明，該活 性片段Gluc 148具有與野生型GLuc相似的生化性質，發光活性高、不需要輔因子、穩定性 好，並且與全長的GLuc相比，Gluc 148具有分子量更小、在真核細胞中非分泌型表達的優 點，更適合作為報告基因和應用於活體成像、高通量篩選、微生物檢測等技術領域。並且，與N端缺失更多個胺基酸殘基(例如，N端缺失43個胺基酸殘基的Glucl42) 的螢光素酶相比，雖然缺失更多胺基酸殘基的螢光素酶具有更小的分子量，但其在真核系 統(如pcDNA 3. 1/HEK 系統)中不表達或很快被降解，而Glucl48能夠很好的真核表 達。在此基礎上，本發明人完成了本發明。Gaussia螢光素酶的活性片段如本文所用，術語「Gaussia螢光素酶的活性片段」、「Glue的活性片段」、「Glue148」或「本發明的活性片段/蛋白質或多肽」可互換使用，均表示使得Gaussia螢光素酶 的N端37個胺基酸缺失後得到的仍然具有與野生型Gluc相似的發光活性的蛋白質或多肽 (Gluc 38-185)，且可在真核或原核細胞中穩定表達。本發明的蛋白質或多肽可以是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿 主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。該定義中也包括具有螢光素酶活性的上述蛋白質或多肽的變異形式。所述蛋白質 或多肽的序列包括但不限於(a) SEQ ID NO 2所示的序列；或(b)在(a)限定的胺基酸序 列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有螢光素酶活性的由(a)衍生的蛋白質 或多肽。優選，所示蛋白質或多肽具有SEQ ID NO :2所示的序列。本發明蛋白質或多肽的變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-30 個，較佳地1-20個，更佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)胺基酸的缺失、插入 和/或取代，例如，在本領域中，用性能相近或相似的胺基酸進行保守取代時，通常不會改 變蛋白質或多肽的功能；同源序列；保守性變異體；等位變異體；天然突變體；誘導突變體； 在高或低的嚴緊度條件下能與Gluc 148蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白。可採用輻射或暴露於誘變劑下來產生隨機誘變，也可通過定點誘變法或其它已知 的分子生物學技術來獲得上述(b)中的蛋白質或多肽。根據重組生產方案所用的宿主，本 發明的蛋白質或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明活件片段的編碼序列如本文所用，術語「Gaussia螢光素酶活性片段的編碼序列」、「Glue 148編碼序 列」或「Glue 148的DNA序列」可互換使用，均是指編碼並可在原核生物和/或真核生物載 體中表達出本發明的活性蛋白質或多肽的核苷酸序列。優選根據原核生物和真核生物(如哺乳動物)的密碼子偏愛，對所述編碼序列進 行優化，以使其能在原核細胞和真核細胞中高效表達。在本發明中，所述編碼序列包括但不 限於(i)如SEQ ID NO 1所示的序列；(ii)在嚴格條件下能與SEQ ID NO 1的序列雜交 的分子。如本文所用，術語「嚴格條件」是指⑴在較低離子強度和較高溫度下的雜交和 洗脫，如0. 2XSSC，0. SDS，60°C;或⑵雜交時加有變性劑，如50% (ν/ν)甲醯胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優 選是95%以上時才發生雜交。例如，所述序列可為SEQ ID NO :1序列的互補序列。本發明的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的 方法獲得。本發明活件片段的特點及用塗本發明的Gluc 148活性片段的長度為148Aa，其分子量僅為16kDa，與野生型 GLuc(185Aa, 19. 9kDa)相比，具有長度更短、分子量更小的特點，由此可具有更高的穩定性。 並且，本領域技術人員更容易通過例如化學合成等方法獲得Gluc 148、對其進行進一步的 性質改造和優化、或使該小片段與其它多肽或蛋白質融合以用於報告或檢測等用途。本發明的Gluc 148活性片段具有與野生型Gluc螢光素酶相似的生化性質和發光 活性，且其與底物的螢光反應無需輔因子的存在，具有反應便捷、易於檢測等特點。
並且，本發明的Gluc 148活性片段在原核或真核細胞中非分泌型表達，基本上不 分泌到細胞培養物中。而現有技術中的Gluc為分泌型表達，無法用於活體成像，並且Gluc 在細胞培養物和細胞裂解物中均會產生螢光，從而在檢測時造成較高背景螢光，影響測定 的準確性。因此，本發明的Gluc 148活性片段更適於作為報告基因應用於活體成像、高通 量篩選及微生物檢測等技術領域。並且，與N端缺失更多個胺基酸殘基(例如缺失43個胺基酸殘基的Gluc 142)的 螢光素酶相比，雖然缺失更多胺基酸殘基的螢光素酶具有更小的分子量，但其在真核系統 GnpcDNA 3. 1/HEK 系統)中不表達或很快被降解，而本發明的Gluc 148則能進行穩 定的真核表達。本發明的活性螢光素酶片段或其編碼序列可用作報告因子、螢光能量供體，並可 用於細胞或活體成像、藥物的高通量篩選、微生物檢測或蛋白質拓樸結構鑑定中。例如在鑑定蛋白質拓樸結構中，可將螢光素酶活性片段插入待確定其拓樸結構的 蛋白質的不同位點，從而獲得融合蛋白；然後檢測融合蛋白所產生的螢光強度；若螢光強 度低，則表明融合位點位於細胞質中，若螢光強度高，則表明融合位點位於周質空間中(熒 光素酶活性片段的正確摺疊而產生較高的活性有賴於周質空間中的摺疊酶)。該方法與本 領域中常用於鑑定蛋白質拓樸結構的方法(例如磷脂酶活性法，化學修飾法)相比，具有更 高的靈敏度，且操作更為簡便。鋪絲日腕牛艦雕··歹丨·■唸本發明活性片段或其編碼序列可用於製備試劑盒，所述試劑盒中除了包括所述活 性片段或其編碼序列以外，還可任選包含(包括但不限於)容器、底物、緩衝液、稀釋劑和/ 或使用說明書。本發明的試劑盒可用於細胞或生物的活體成像、高通量篩選(例如藥物篩選)、微 生物檢測或蛋白質拓樸結構鑑定等技術領域。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用 於限制本發明的範圍。下面實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如 〈〈分子克隆實驗手冊〉〉(Molecular cloning :A laboratory manual, 3rd ed. , Sambrook 等， Cold Spring Harbor Laboratory, 2001)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有 專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均 等的方法及材料皆可應用於本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。實施例1. Gaussia螢光素酶(GLuc)的一級序列分析和二硫鍵的質譜鑑定對已知的GLuc —級序列進行分析，並採用質譜法對其中二硫鍵所在位置進行確 認。試驗結果顯示GLuc的一級序列(圖1A)共含有185個胺基酸殘基；其N端為一 段17Aa的信號肽序列，指導分泌型表達；核心酶(其在序列中的範圍為44 185Aa)具有 兩個同源性很高的亞結構域，各含有五個半胱氨酸殘基；經Ellman法測定，GLuc不含游離 的半胱氨酸巰基，形成五對二硫鍵。用質譜法進一步鑑定，確認了其中三對二硫鍵C2-C3、 C4-C5和C9-C10，另有兩對二硫鍵尚未確定。
實施例2. Gluc全基因和Gluc 148DNA序列的人工合成、其克降、表汰及目的對比 的純化根據原核生物和真核哺乳動物的密碼子偏愛，優化Gluc全基因的部分密碼子和 Gluc 148 (Glue 38-185)DNA序列的部分密碼子，使其能在原核細胞和哺乳動物細胞中高效 表達。經密碼子優化的Gluc 185和Gluc 148的DNA序列示於圖IB中，Gluc 148的DNA序 列與原基因序列的比較示於圖IC中。將所得優化的GLuc、GLuc 148基因分別克隆到pET_2^ (+)質粒(購自Novagen) 中，並用該質粒轉化大腸桿菌Origami B菌株(購自Novagen)，37°C條件下過夜培養。將 培養物接種到培養基(LB培養基)，37°C培養3小時，加入IPTG(終濃度50 μ M)，22°C誘導 8小時。離心菌體，破碎再離心，取上清結合於Ni-NTA柱(購自Qiagen)，用20mM咪唑洗去 雜蛋白後，再用250mM咪唑洗脫目的蛋白。離心濃縮初級分離的蛋白質，採用凝膠過濾層析 進一步純化得到目的蛋白(圖2A)，並用SDS-PAGE電泳鑑定所得目的蛋白(圖2B)。凝膠過濾層析和SDS-PAGE電泳結果分別如圖2A和2B所示。圖2A顯示凝膠過 濾層析能夠將Gluc 148與雜蛋白很好地分離開來。圖2B顯示GLuc 148性質穩定，且分 子量小於GLuc。實施例3.活件片段GLuc 148的螢光發光光譜採用螢光光度計(購自Varian，型號Cary Eclipse)對Gluc 148的螢光發光光 譜進行研究，用於測試的溶液是50mM PBS，pH7. 8,500mM NaCl，濃度的GLuc 148，在反應體系 中，於室溫下催化腔腸素(終濃度1 μ Μ)氧化發光(反應時間為10秒)。在400-580nm間 獲取螢光發光光譜。野生型Gaussia螢光素酶是以腔腸素(Coelenterazine)(結構參見圖3A)為底物 的螢光素酶，催化底物的氧化反應(如圖3B所示)，該反應中生成CO2，並同時發出波長為 480nm的藍光。圖3C為純化得到的活性片段GLuc 148催化腔腸素的氧化反應時的發光光 譜，可見GLuc 148的最大發射波長位於480nm，與野生型GLuc —致。實施例4活性片段GLucl48與野生型GLuc、及與N端缺失17個Aa的Gluc 169和 N端缺失43個Aa的Gluc 142的發光活性的比較在六個數量級(10_12 10_7)上分別取相同濃度的GLuc 148、Gluc 169 (N端缺失 17 個 Aa)、Gluc 142 (Glue 的 N 端缺失 43 個 Aa)和 GLuc，在 50mM PBS，pH 7. 8,500mM NaCl 反應體系中，催化腔腸素(終濃度ΙμΜ)氧化發光，反應時間為10秒，測量波長480nm處的 相對發光值(Promega GloMax 20/20 Luminometer)。以螢光素酶濃度為橫坐標，以生物發 光強度為縱坐標，均取對數作圖，結果如圖4所示。結果顯示GLuc 148,Gluc 169,Gluc 142和GLuc在六個數量級上，發光強度和酶 濃度具有基本相同的線性關係。該結果表明活性片段Gluc 148、Glucl69、Gluc 142和野 生型GLuc的酶活性一致。實施例5.活件片段GLuc 148用於分析膜蛋白的拓撲結構採用常規方法構建表達融合蛋白的載體，將活性片段GLuc 148融合在大腸桿菌 內膜蛋白CcmH的不同位點，從而獲得如下融合產物CcmH 123-GLuc 148、CcmH 138-GLuc 148、CcmH 196-GLuc 148、CcmH 256-GLuc 148、CcmH288_GLuc 148 和 CcmH 345-GLuc 148。將含有融合基因表達質粒的大腸桿菌在22°C誘導8小時後，置於冰上30分鐘，取10 μ 1菌液，用加入485 μ L新鮮的LB培養基稀釋，再加入5 μ L底物CTZ (100 μ Μ)，立即檢 測發光強度。大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，在外膜和內膜之間形成一個被稱為「周質空間」的類似 內質網的空腔。不同於細胞內的還原環境(GLuc 148在細胞內不能正確摺疊成有活性的形 式)，周質空間內提供氧化環境並含有很多二硫鍵異構酶，從而有利於含有二硫鍵蛋白的正
確摺疊。實驗結果顯示雖然融合蛋白的表達量並沒有很大的差異(圖5Β)，但融合的GLuc 148活性有很大的不同(圖5Α)。融合蛋白CcmH 123-GLuc 148和CcmH138_GLuc 148所產 生的螢光強度較弱，反映了螢光素酶活性很低，這表明CcmH的123位和138位的胺基酸殘 基位於細胞質中；而 CcmH 196-GLuc 148、CcmH256_GLuc 148、CcmH 288-GLuc 148 和 CcmH 345-GLuc 148所產生的螢光強度較高，反映了螢光素酶活性很高，從而證明這些融合位點 在周質空間(周質空間的氧化環境有利於GLuc 148的摺疊形成正確的構象)中。該結果與採用化學修飾法獲得的CcmH拓樸結構的結果相吻合，但比化學修飾法 更方便。上述結果提示通過在膜蛋白的不同位點融合GLuc 148，再原位檢測螢光素酶活 性的方法，可用於研究大腸桿菌內膜蛋白的拓撲結構。^MM 6.活t牛片段GLuc 148和GLuc在直核細胞,中表汰的發光活t牛比較首先，實現GLuc 148和GLuc在真核細胞中的表達。將GLuc和GLuc 148基因克隆 到真核載體PcDNA 3. 1/myc-His (購自hvitrogen)，轉化HEK 293T細胞(購自ATCC)，表 達48小時後，採用免疫印跡法檢測表達，檢測結果如圖6A所示。由圖可見，活性片段GLuc 148和野生型GLuc均可在真核體系中表達。取細胞裂解液上清和細胞培養液，將兩者稀釋到同一比例(具體為細胞培養液為 Iml，細胞裂解液上清為100 μ 1，將其稀釋10倍至與細胞培養液為同一比例)，酶活測定體 係為50mM PBS,pH7. 8,500mM NaCl，[CTZ] = 1 μ M，反應時間為10秒，測量波長480nm處的 相對發光值(Promega GloMax 20/20Luminometer)。測定結果分別如圖6B和圖6C所示。由結果可見相對於GLuc 148和GLuc的表達量，活性片段GLuc 148在細胞裂解 液中表達的發光活性與GLuc相近；但野生型的GLuc的表達活性85%分泌至培養液中，而 活性片段GLuc 148則有99. 8%的活性為非分泌型表達。上述結果表明GLuc 148可在細胞內以高穩定性表達，由此可用於蛋白質在真核 細胞中的定位，區分分泌型(細胞外培養液)，在內質網(氧化環境)或細胞液(還原環境) 中的定位；更適合作為報告因子和螢光能量供體，應用於細胞和活體成像、高通量篩選、微 生物檢測等技術領域。實施例7.活性片段GLuc 148和N端缺失43個AA的Gluc 142在真核細胞中表 汰的表汰穩定件比較將Gluc、Gluc 148和編碼N端缺失43個Aa的螢光素酶的Gluc 142基因克隆到真 核載體pcDNA 3. 1/myc-His(購自Invitrogen)中，以空質粒作為陰性對照，轉化HEK 293T 細胞(購自ATCC)，表達48小時後，採用免疫印跡法檢測表達，檢測結果如圖7所示。結果表明Gluc 142在pcDNA 3. 1/HEK 系統中不表達或很快被降解，而Gluc 148能夠很好的真核表達，具有較高的表達穩定性。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範
圍。
序列表
中國科學院上海生命科學研究院
螢光素酶活性片段及其應用
<130)095375
2
PatentIn version 3.3
1
444
DNA
人工序列

CDS
⑴· · (444)
1
acc gat ctg gacgccgaceggggcctcccaggaaagaagctccct48
Thr Asp Leu AspAlaAspArgGlyLysLeuProGlyLysLysLeuPro
151015
ctg gaa gtc ctcgaaatggaggetaacgeteggaaggcaggatgc96
Leu Glu Val LeuLysGluMetGluAlaAsnAlaArgLysAlaGlyCys
202530
acc aga gga tgtctgatetgtctgagecacattSlSlSltgcactCCCaag144
Thr Arg Gly CysLeulieCysLeuSerHislieLysCysThrProLys
354045
atg aag aag ttcattCCCggcaggtgtcatacatacgagggcgac192
Met Lys Lys PhelieProGlyArgCysHisThrTyrGluGlyAspLys
505560
gag tcc gcc caagggggaateggggaggccategtggacateCCCgag240
Glu Ser Ala GlnGlyGlylieGlyGluAlalieValAsplieProGlu
65707580
att cct gga ttcaaggacctcgaaccaatggaacagttcattgetcaa288
lie Pro Gly PheLysAspLeuGluProMetGluGlnPhelieAlaGln
859095
gtg gac ctc tgcgtggactgcaccactgggtgcctggggctggca336
Val Asp Leu CysValAspCysThrThrGlyCysLeuLysGlyLeuAla
1001051100147]aatgtccaatgctccgatCtgCtgaagaagtggctcccacaaaggtgc0148]AsnValGlnCysSerAspLeuLeuLys Lys Trp Leu Pro Gln Arg Cys0149]1151201250150]getacattcgcctccatecaaggacaggtcgataagateggc0151]AlaThrPheAlaSerLyslieGlnGlyGlnValAspLyslieLysGly0152]1301351400153]getggcggagat0154]AlaGlyGlyAsp0155]1450156]20157]1480158]PRT0159]人工序列0160]20161]ThrAspLeuAspAlaAspArgGlyLysLeuProGlyLysLysLeuPro0162]1510150163]LeuGluValLeuLysGluMetGluAlaAsnAlaArgLysAlaGlyCys0164]2025300165]ThrArgGlyCysLeulieCysLeuSerHislieLysCysThrProLys0166]3540450167]MetLysLysPhelieProGlyArgCysHisThrTyrGluGlyAspLys0168]5055600169]GluSerAlaGlnGlyGlylieGlyGluAlalieValAsplieProGlu0170]657075800171]IleProGlyPheLysAspLeuGluProMetGluGlnPhelieAlaGln0172]8590950173]ValAspLeuCysValAspCysThrThrGlyCysLeuLysGlyLeuAla0174]1001051100175]AsnValGlnCysSerAspLeuLeuLysLysTrpLeuProGlnArgCys0176]1151201250177]AlaThrPheAlaSerLyslieGlnGlyGlnValAspLyslieLysGly0178]1301351400179]AlaGlyGlyAsp0180]145
384
432
44權利要求
1.一種螢光素酶活性片段，其特徵在於，所述活性片段的序列是Gaussia螢光素酶缺 失N端37個胺基酸殘基所形成的序列，並且所述活性片段具有與野生型Gaussia螢光素酶 一致的螢光素酶活性。
2.如權利要求1所述的螢光素酶活性片段，其特徵在於，所述活性片段適於在原核或 真核細胞內表達。
3.如權利要求1所述的螢光素酶活性片段，其特徵在於，所述活性片段具有SEQID NO: 2所示的胺基酸序列。
4.權利要求1-3中任一項所述的螢光素酶活性片段的編碼序列。
5.如權利要求4所述的編碼序列，其特徵在於，所述編碼序列選自⑴如SEQ ID NO 1所示的序列；和( )在嚴格條件下能與SEQ ID NO 1的序列雜交的分子。
6.如權利要求4所述的編碼序列，其特徵在於，所述編碼序列經密碼子偏愛優化。
7.權利要求1-3中任一項所述的螢光素酶活性片段或權利要求4-6任一項所述的編碼 序列在作為報告因子、螢光能量供體中的用途。
8.權利要求1-3中任一項所述的螢光素酶活性片段或權利要求4-6任一項所述的編碼 序列在細胞或活體成像、藥物的高通量篩選、微生物檢測或蛋白質拓樸結構鑑定中的用途。
9.一種試劑盒，其包含權利要求1-3中任一項所述的螢光素酶活性片段或權利要求 4-6任一項所述的編碼序列。
10.一種鑑定蛋白質拓樸結構的方法，所述方法包括將螢光素酶活性片段插入待確定其拓樸結構的蛋白質的不同位點，從而獲得融合蛋 白；以及檢測融合蛋白所產生的螢光強度；若螢光強度低，則表明融合位點位於細胞質中；若螢光強度高，則表明融合位點位於周質空間中。
全文摘要
本發明通過將Gaussia螢光素酶(Gaussia Luciferase，GLuc)的N端37個胺基酸缺失的方法，獲得了一種GLuc的活性片段，命名為GLuc 148。與野生型Gluc一樣，GLuc 148發光活性高、不需要輔因子、生化性質穩定，但GLuc 148分子量更小、在真核細胞中非分泌型表達，更適合作為報告因子和螢光能量供體，應用於細胞和活體成像、高通量篩選、微生物檢測等技術領域。
文檔編號G01N33/68GK102080068SQ200910199479
公開日2011年6月1日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者李海音, 胡紅雨, 鄭學明 申請人:中國科學院上海生命科學研究院