作為基質金屬蛋白酶抑制劑的取代4－聯苯基－4－羥基丁酸衍生物的製作方法

2023-07-08 23:50:56

專利名稱：作為基質金屬蛋白酶抑制劑的取代4－聯苯基－4－羥基丁酸衍生物的製作方法
相互參考的有關申請本申請涉及美國專利申請序號08/399846，1994年11月15日申請；以及涉及美國專利申請序號08/539409，1995年11月6日申請和相關的PCT申請號WO9615096。
美國專利申請序號08/399846和08/539409的公開在此結合本發明作為參考。
範圍本發明涉及酶抑制劑，更確切地說，涉及用於抑制基質金屬蛋白酶的新4-聯苯基-4-羥基丁酸衍生物。
背景基質金屬蛋白酶(也稱為基質金屬內切蛋白酶或MMPs)屬於鋅內切蛋白水解酶家族，其包括(但不限於)間質膠原酶(也稱為MMP-1)，基質(stromelysin)(也稱為proteogly canase，transin或MMP-3)、明膠酶A(也稱為72kDa-明膠酶或MMP-2)和明膠酶B(也稱為95kDa-明膠酶或MMP-9)。通過包括成纖維細胞和軟骨細胞等各種細胞，與稱為TIMPs(Tissue Inhitior of Metallo Proteinase)的天然蛋白抑制劑一起分泌出這些MMPs。
所有這些MMPs能夠破壞關節軟骨或基質生物膜的各種結締組織成份。每種MMP分泌時為無活性的酶原，但在隨後的步驟中必須經分解才能具有其蛋白水解活性。除了基質破壞作用外，某些MMPs如MMP-3對其它MMPs如MMP-1和MMP-9而言具有體內激活劑的作用[Ito，A，and Nagase，H.，Arch，Biothem，Biophys.，267，211-6(1988)；Ogata，Y.；Enghild，J.and Nagase，H.，J.Biol，chem.267，3581-4(1992)]。這樣，通過過量的MMP-3可以引發串聯的蛋白水解活性。接著特異的MMP-3抑制劑將限制這樣的抑制劑不能直接抑制的其它MMPs的活性。
也有報導MMP-3可以分解並使其它蛋白酶如彈性蛋白酶的內源性抑制劑失活[Winyard，P.G.；Zhang，Z.；Childwick，K.；Blake，D.R.；Carrell，R.W.；Murphy，G.，FEBS Letl，279，91-4(1991)]。通過改變它們內源性抑制劑的水平，MMP-3的抑制劑可以影響其它分解性蛋白酶的活性。
許多疾病可認為是由過量的或不需要的基質破壞性(matrix-destroying)金屬蛋白酶活性或MMPs對TIMPs比率失衡介導的。這些包括a)骨關節炎[Woessner，J.F.，Tr.；Selzer，M.G.，J.Biol.Chem.259，3633-8(1984)和Phadke，K.，J.Rheumatal.10，852-60(1983)]，b)類風溼性關節炎[Mullins，D.E.；Rohrlich，S.T.，Biochim，Biophys，Acta695，117-214(1983)；Woolley，D，E.；Crossley，M.J.；Evanson，M.J.，Arthritis Rheum.20，1231-9(1977)；and Gravallese，E.M.；Darling，J.M.；Ladd，A.L.；Katz，J.N.；Glimcher，L.H.，Arthritis Rheum.34，1076-84(1991)]，c)膿毒性關節炎[Williams，R.J.，III；Smith，R.L.；Schurman，D.J.，Arthritis Rheum，33，533-41(1990)]，d)腫瘤轉移[Reich，R.；Thompson，E.W.；Iwamoto，Y.；Martin，G.R.；Deason，J.R.；Faller，G.C.；Miskin，R.，Cancer Res.48 3307-12(1988)and Matrisian，L，M.；Bawden，G.T.；Krieg，P.；Fuerstenberger，G.；Briand，J.P.；Leroy，P.；Breathnach，R.，Proc，Natl，Acad.Sci.U.S.A.83 9413-7(1986)]，e)牙周疾病[Overall，C，M.；Widbkin.O.W.；Thonard，T.C.J.Peridontal.Res.22，81-8(1987)]，f)角膜潰瘍(Burns，F，R.；Stack，M.S.；Gray，R.D.；Paterson，C.A.，Invest、Ophthalmol，Vis，Sci.30，1569-75(1989)]，g)蛋白尿症[Baricos，W，H.；Murphy，G.；Zhou，Y.；Nguyen，H，H.；Shah，S.V.，Biochem，J.254，609-12(1988)]，h)由動脈粥樣硬化蝕斑破裂引起冠狀血栓形成(Davies，M.J.；Foster，K.；Hembry，R.；Murphy，G.；Humphries，S.，Proc，Natl，Acad，Sci，U.S.A.88，8154-8)(1991)]，i)主動脈瘤病[Vine，N.；Powell，J.T.，Clin.Sci.81，233-9(1991)]，j)分娩控制(birthcontrol)[Woessner，J.F.，Jr.；Morioka，N.；Zhu，C.；Mukaida，T.；Butler，T.；LeMaire，W.J.，Steroids 54，491-9(1989)]，k)營養不良性(dystrophobic)大皰性表皮鬆解[Kronberger，A.；Valle，K.J.；Eisen，A.Z.；Bauer，E，A.，J.Invest，Dermatol，79，208-11(1982)]和1)創傷性關節損傷後的退行性軟骨丟失，引起炎症反應的疾病，由MMP活性介導的骨質減少，tempero下頷骨關節病，中樞系統的脫髓鞘疾病(demyelating)等等[Chantry，A.；Earl，C.；Groome，N.；Glynn，P.，J，Neurochem.50，688-94(1988)]。
在關節炎疾病的情況中，需要新的治療方法尤其重要。骨關節炎(OA)、類風溼性關節炎(AR)和膿毒性關節炎的主要的病殘作用是關節軟骨的進行性丟失並由此而影響正常關節功能。雖然非甾體抗炎藥物(NSAIDs)可以控制疼痛和腫脹，但市場上還沒有藥物能夠防止或減緩軟骨損失。這些疾病的最終結果是關節功能完全喪失，並僅能通過關節替代治療。預期MMP抑制劑可以阻止或逆轉進行性軟骨丟失並預防或延緩外科手術。
蛋白酶在腫瘤轉移進行的幾個階段中為非常重要的成分。在該過程中，基底膜上的結構蛋白的水解降解使初始部位的腫瘤擴大，並從該部位選出，在遠離的第二個部位定居並侵入。腫瘤誘導的血管生成是腫瘤生長所需要的並取決於蛋白水解組織的變化。用各種類型蛋白酶的轉染實驗表明基質金屬蛋白酶，特別是明膠酶A和B(分別為MMP-2和MMP-9)在這些過程中起決定性作用。該領域的的總的看法可參見Mullins，D.E.；Rohrlich，S.T.，Biochim Biophys.Acta 695，177-214(1983)；Ray，J.M.；Stetler-Stevenson，W.G.，Eur，Respir.J.7，2062-72(1994)和Birkedal-Hansen，B.；De Carlo，A.；Englar，J.A.，Crit，Rev，Oral，Biol，Med，4，197-250(1993)。
而且，已顯示通過天然基質金屬蛋白酶抑制劑TIMP-2(一種蛋白質)抑制細胞外基質降解可阻止腫瘤生長[De Clerck，Y，A.；Perez，N.；Shimada，H.；Boone，T.C.；Langley，K.E.；Taylor，S.M.，Cancer Res.52，701-8(1992)]以及在實驗系統中，TIMP-2抑制腫瘤誘導的血管生成[Moses，M.A.；Sudhalter，J.；Langer，K.，Science 248，1408-10(1990)]。該觀點可參見De Clerck，Y.；Shimada，H.；Taylor，S.M.；Langley，K，E.，Ann，N.Y.Acad，Sci.732，222-32(1994)。也表明當腹膜內給藥時合成的基質金屬蛋白酶抑制劑司馬替丁抑制人結腸腫瘤的生長並在裸鼠中以正位擴散[Wang，X.；Fu.X.；Brown，P.D；Crimmin，M.J.；Hoffman，R.M.Cancer Res.54 4726-8(1994)]和延長用人卵巢癌異種移植小鼠的存活期[Davies，B.；Brown，P.D.；East，N；Crimmin.M.J.；Balkwill，F.R.，Cancer Res，53，2087-91(1993)]。在WO-A-9321942中已介紹這些化合物及有關化合物的用途。
有幾個專利和專利申請公開了使用金屬蛋白酶抑制劑阻滯腫瘤轉移，促使腫瘤退化，抑制癌細胞增生，減緩或防止與骨關節炎有關的軟骨丟失或治療上述介紹的其它疾病(例如WO-A-9519965；WO-A-9519956；WO-A-9519957；WO-A-9519961；WO-A-9321942；WO-A-9321942；WO-9421625；美國專利4599361；美國專利5190937；EP0574758A1，(1993年12月22日公布)；EP026436A1(1988年8月3日公布)和EP0520573A1(1992年12月30日公布)。這些專利優選的化合物是在一個末端和各種側鏈(發現於天然胺基酸上末端和側鏈並具有較新的官能團)上具有鋅配合基團(異羥肟酸、硫羥、羧酸或次膦酸)的肽主鏈。這樣小肽常常被較差的吸收，表現出低的口服生物利用度。它們也迅速經蛋白水解代謝，這樣具有較短的半衰期。作為實例，在WO-A-9321942中所述的化合物batimastat僅可以為腹膜內給藥。
WO9615096(1996年5月23日公布)介紹了取代的4-雙芳基丁酸或5-雙芳基戊酸和衍生物作為基質金屬蛋白酶抑制劑。這是美國部分繼續申請08/339846(1994年11月15日申請)號，在此結合本發明作為參考。該申請公開兩個取代的4-聯苯基-4-羥基丁酸衍生物(見下述實施例33和34)。這些化合物作為MMP-3抑制劑的有效性比相應的4-聯苯基-4-氧代丁酸衍生物低。
WO9615096實施例1 異構體AWO9615096實施例33IC50486nM(對MMP-3) IC502600nM(對MMP-3)異構體BWO9615096實施例34IC505000nM(對MMP-3)所需的有效的MMP抑制劑與先有技術的肽-基化合物比較，具有改善生物利用度和生物穩定性並更適宜用於針對特別的靶向MMPs。這些化合物是本申請的主要內容。
概述根據WO9615096中公開的取代的4-雙芳基-4-羥基丁酸作為MMP抑制劑似乎比類似相同取代的4-雙芳基-4-氧代丁酸表現出較低的活性，令人驚奇的是現已發現其它的4-雙芳基-4-羥基丁酸的活性異構體作為MMP抑制劑比相應的4-氧代化合物更有效。
本發明涉及具有基質金屬蛋白酶抑制劑活性的化合物並有通式(I)如下
其中T是藥學上可接受的取代基團；X是0，1或2；m是0或1-4的整數；n是0或1；和或者A和G兩者為CH2；或者A是化學鍵和G是CH2；或者A是CH或N；和G是CH；和A通過下式成環鍵與G連接(CH2)0-3(Q)(CH2)0-3；其中Q是化學鍵，S，或O；和C、S和O構成連接原子；導致環的形成，其包括A(所述的成環鍵)和G；條件是在所述的成環鍵中n加上連接原子的總數之和是1-4整數；和在所述環中雜原子數是0或1；R1是*6-10個碳原子的芳基，條件是假若芳基是苯基，則X是1或2；*含有4-9個碳原子的雜芳基，並至少有一個N，O或S雜原子；*芳基取代的鏈烯基，其中芳基部分含有6-10個碳原子，鏈烯基部分含有2-5個碳原子；*雜芳基取代的鏈烯基，其中雜芳基部分含有4-9個碳原子和至少一個N，O或S雜原子，以及鏈烯基部分含有2-5個碳原子；*芳基取代的炔基，其中芳基部分含有6-10個碳原子和炔基部分含有2-5個碳原子；*雜芳基取代的炔基，其中雜芳基部分含有4-9個碳原子和至少有一個N，O或S雜原子和炔基部分含有2-5個碳原子；*N-苯二甲醯亞氨基(phthalimidoyl)；*N-(1，2-萘二羰醯亞氨基(naphthalenedicarboximidoyl))；*N-(2，3-萘二羰醯亞氨基)；*N-(1，8-萘二羰醯亞氨基)；*N-吲哚基(indoloyl)；*N-(2-Pyrrolodinonyl)；*N-琥珀醯亞胺基(succinimidoyl)；*N-馬來醯亞胺基(maleimidoyl)；*3-乙內醯脲基；*1，2，4-尿唑基；*醯氨基；*尿烷；*脲*非芳族取代或未取代的雜環，含有N原子並通過N原子連接，以及含有一個另外的O或S；*氨基；和*ZR8，其中Z代表
R8是*6-10個碳原子的芳基；*雜芳基，含有4-9個碳原子和至少一個N，O或S雜原子；*芳基烷基，其中芳基部分含有6-12個碳原子和烷基部分含有1-4個碳原子；或
*雜芳基-烷基，其中芳基部分含有4-9個碳原子和至少有一個N，O或S雜原子以及烷基部分含有1-4個碳原子；和條件是當Z是O，R8也可以是亞烷氧基或末端具有H、烷基或苯基的聚亞烷氧基。
任何T或R1基團的芳基或雜芳基部分任選可含有多至兩個取代基，所述取代基選自-(CH2)yC(R11)(R12)OH，-(CH2)yOR11，-(CH2)ySR11，-(CH2)yS(O)R11，-(CH2)yS(O)2R11，-(CH2)ySO2N(R11)2，-(CH2)yN(R11)2，-(CH2)yN(R11)COR12，-OC(R11)2O-，其中兩個氧原子連接芳環，-(CH2)yCOR12，-(CH2)yCON(R11)2，-(CH2)yCO2R11，-(CH2)yOCOR11，滷素，-CHO，-CF3、-NO2、-CN和-R12，其中Y是0-4；R11代表H或1-4個碳原子的低級烷基；和R12代表1-4個碳原子的低級烷基。
對於製備，本發明化合物是非對映體的混合物。對於每個化合物而言，重要的原料是非對映體的混合物或為比非對映體構成的非對映體混合物具有較大MMP抑制活性的單一非對映體。藥學上可接受的鹽也屬於本發明範圍內。
除了上述化合物外，本發明也涉及藥用組合物，其包含上述的和下面更詳細敘述的本發明化合物，加上藥學上可接受的載體。
本發明進一步涉及治療哺乳動物中由基質金屬蛋白酶介導的疾病以得到療效的方法，該方法包括給予哺乳動物一定量上述和下面更詳細敘述的本發明化合物，以有效治療病症。詳述本發明廣泛涉及具有上述通式I的基質金屬蛋白酶抑制的化合物。
式I中符號「T」代表藥學上可接受的取代基。示範性基團「T」是如滷素；烷基；滷烷基；鏈烯基；炔基；-(CH2)pQ，其中P是0或1-4的整數，及-鏈烯基-Q其中鏈烯基部分包含2-4個碳原子的部分。後兩個基團中Q可以是芳基、雜芳基、-CN、-CHO、-NO2、-CO2R4、-OCOR4、-SOR5、-SO2R5、-CON(R4)2、-SO2N(R4)2、-COR4、-N(R4)2、-N(R4)COR4、-N(R4)CO2R5、-N(R4)CON(R4)2、-OR6和-SR6。在這些式中，R4代表H、烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基；R5代表烷基、芳基、雜芳基、芳烷基或雜芳烷基和R6代表H，烷基、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳基-烷基、鏈烯基、炔基、滷烷基、醯基或亞烷氧基或末端為H、烷基或苯基的聚亞烷氧基。Q含有或為Q的一部分的不飽和部分由至少一個碳原子與Q的任何N、O或S原子分開。(I)的末端苯環可以是未取代的或可以帶有多至2個取代基T。因此，下標x是0，1或2。
剛剛提及的「T」將在下面進一步定義「烷基」意為含有1-10個碳原子的直鏈、支鏈、環和多環烴基；「滷烷基」意為含有1-10個碳原子的部分或全部滷代的烷基；「鏈烯基」意為含有2-10個碳原子和至少一個雙鍵的直鏈、支鏈、環和多環不飽和烴基；「炔基」意為含有2-10個碳原子和至少一個叄鍵的直鏈、支鏈、環和多環烴基；「芳基」意為6-12個碳原子的芳族碳環或碳雙環基團如苯基、聯苯基或萘基；「雜芳基」意為含有選自O、N和S的1-4個雜原子的6-12個原子的芳環基團；「芳烷基」意為具有芳基末端的1-4個碳原子的烷基鏈；「雜芳烷基」意為具有雜芳基末端的1-4個碳原子的烷基鏈；「醯基」意為-CO烷基、CO芳基或CO雜芳基；「亞烷氧基」意為1-6個亞甲基和1個氧原子的二基團鏈和「多亞烷氧基」意為1-6個亞甲基和2-3氧原子的二基團鏈，但條件是每個氧原子與其他氧原子之間至少由一個碳原子隔開。
更確切地講，在第一個方面，本發明涉及式(I)化合物，其中每個A和G是CH2和n是0。這樣的化合物具有下面所示的式(II)
在式(II)中，m優選0、1或2。進一步講，當m是0時，R1優選
當m是1時，R1優選
當m是2時，R1優選
在更優選的方面，在式(II)中，T是滷素或OR6，其中R6是1-6個碳原子的烷基或苄基；X是1；m是0或2；和當m是0時，R1是
當m是2時，R1是
除了式(II)化合物，在第二方面，本發明涉及(I)化合物，其中n是0或1；A是CH或N；G是CH；和A是通過式(CH2)0-3(Q)(CH2)0-3的成環鍵與G連接，其中Q是化學鍵、S或O；C、S和O構成連接原子。這些參數選擇導致環的形成，它包括A，上述的成環鍵和G。該亞組化合物基於式I，條件是成環鍵中n加上連接原子的總數之和是1-4的整數；環中雜原子數目是0或1。T、x、m和R1為與式(I)有關的定義。這些化合物具有包括雜原子N、O或S的4-7元環並由下式(III)代表。
上述含環化合物優選的亞組為n是0；A是CH；Q是化學鍵和成環鍵是-(CH2)2-。得到的化合物具有下式(IIIa)。
最優選式(IIIa)化合物是T為滷素或OR6的物質，其中R6是1-6個碳原子的烷基或苄基；X是1，和m是0或1。當m是0時，R1最優選
當m是1時，R1最優選
本領域技術人員應理解本發明每個化合物存在一個以上的非對映體形式並理解這樣的立體異構體一般在生物系統中表現出不同的活性。本發明包含的所有可能的立體異構體均具有抗MMP的抑制活性，無論它們的立體異構形式如何，雖然在此要求保護的僅是每種混合物中更有活性的立體異構體。也包含立體異構體混合物，其中至少一種具有MMP抑制活性。
本發明也包含權利要求保護的化合物的藥學上可接受的「藥物前體」。一般講，這些是本發明含醇化合物的醯化衍生物或羧酸部分的低級烷基酯和低級烷基醯胺以及通過羧酸基(function)與羥基反應形成的內酯。然而，已知其它類型的藥物前體。這樣的藥物前體，在體內可以為生理無活性或有活性的，在接受治療者的體內中可以轉化成本發明的活性化合物。物質內酯和直鏈形式的互換圖式所示如下
這樣的衍生物的製備均屬本領域技術範圍。
本發明最優選的化合物如所示並命名列表如下4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(苯硫甲基)丁酸；[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(苯硫甲基)丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[(4-羥苯基)-硫甲基]-丁酸；更有活性的化合物[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[(4-羥苯基)-硫甲基]丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[(4-羥苯基)-硫甲基]丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸；更有活性的化合物[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)-丁酸和[2S，4S]4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)-丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[2-(3-N，N-二乙基氨基甲醯基)-苯乙基]丁酸；更有活性的化合物[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[2-(3-N，N-二乙基-氨基甲醯基)苯乙基]丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[2-(3-N，N-二乙基-氨基甲醯基)苯乙基]丁酸；4-[4-(4-戊氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸；更有活性的化合物[2S，4R]-4-[4-(4-戊氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)-丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-戊氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)-丁酸；4-[4-(4-苄氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸；更有活性的化合物[2S，4R]-4-[4-(4-苄氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)-丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-苄氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)-丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(2-苯二甲醯亞氨基乙基)丁酸；更有活性的化合物[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(2-苯二甲醯亞氨基乙基)-丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(2-苯二甲醯亞氨基乙基)-丁酸；反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)羥甲基]-反式-2-苯硫-環戊烷羧酸；更有活性的化合物(1S，2R，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)-S-羥甲基]-反式-2-苯硫環戊烷羧酸和(1 S，2R，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)-R-羥甲基]-反式-2-苯硫環戊烷羧酸；反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)羥甲基]-順式-2-(2-甲氧基-羰基-苯硫基)環戊烷羧酸；更有活性的化合物(1S，2S，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)-S-羥甲基]-順式-2-(2-甲氧羰基苯硫基)環戊烷羧酸和(1S，2S，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)-R-羥基甲基]-順式-2-(2-甲氧羰基苯硫基)環戊烷羧酸；反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)羥甲基]-反式-2-苯二甲醯亞氨基-甲基環戊烷羧酸；和更有活性的化合物(1S，2R，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)-S-羥甲基]-反式-2-苯二甲醯亞氨基甲基環戊烷羧酸和(1S，2R，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)-R-羥甲基]-反式-2-苯二甲醯亞氨基甲基環戊烷羧酸。製備通法通過使用已知的化學反應和方法，可容易地製備本發明化合物。然而，還是提供下面製備通法，用下面實驗部分中提供的更詳細的實施例，幫助讀者合成抑制劑。
若這些方法的所有各種基團沒有特別定義，則它們均如通用描述中的意義。通法A在0℃至室溫下，用選擇性氫化還原劑如硼氫化鈉或氰基硼氫鈉於溶劑如乙醇或四氫呋喃中還原取代的4-聯苯基-4-氧代丁酸衍生物來常規性地製備本發明化合物。另外，還原劑可以是本領域技術人員所使用的任何其它還原劑，以便將羰基還原為二級醇，條件是這樣的還原劑不能在T，羧基或起始原料的R1部分中產生不需要的變化。
結合使用結晶和層析可以分離出純淨形式的產物異構體。如美國專利申請序號08/539409和WO9615096中所述可以製備起始原料4-聯苯基-4-氧代丁酸衍生物。
通法B通法B-按通法A可以便利地製備純的異構體原料，但要使用手性還原劑如CBS系(Corey，E，J.；Bakshi，R.K.；Shibara，S.，J，Am，Chem，Soc，1987，109，5551-5553或Corey，E.J.；Bakshi，R.K.；Shibata，S.；Chen，C.-P.；Singh，V.K.，J.Am，Chem.Soc，1987，109，7925-7926)代替硼氫化鈉。
本發明化合物的適當的藥學上可接受的鹽包括用有機或無機鹼形成的加成鹽。衍生於這樣的鹼成鹽離子可以是金屬離子，例如鋁，鹼金屬離子，如鈉或鉀，鹼土金屬離子如鈣或鎂或氨鹽離子，其中一些為本目的熟知的離子。實例包括銨鹽，芳烷基胺如二苄胺和N，N-二苄基亞乙基二胺，低級烷基胺如甲胺，叔-丁胺，普魯長因，低級烷基哌啶如N-乙基哌啶，環烷基胺如環己胺或二環己胺，1-金鋼烷胺、benzathine或衍生於胺基酸如精氨酸、賴氨酸等的鹽。生理上可接受的鹽如鈉鹽或鉀鹽和胺基酸鹽可如下所述作為藥物應用並被優選。
為下述的目的，這些或其它的生理上不需要的鹽可用於分離或純化可接收的產物。例如，使用市售對映純的胺如(+)-辛可寧在適當溶劑中可得到本發明化合物單一對映體的結晶鹽，在溶液中留下相對的對映體，該法通常稱為「經典拆分」。由於所給的本發明化合物的一個對映體常常在生理作用方面顯著大於它的對映體，這樣可以在結晶中或在液相中純化發現此種活性異構體。通過將化合物的酸形式與能提供所需的鹼離子的等當量鹼在使鹽沉澱的介質或含水介質中反應來製備所述鹽，然後冷幹。通過常規的中和技術如用硫酸氫鉀、鹽酸等可以從鹽中得到游離的酸形式。
從羧酸與低級烷基胺或天然胺基酸可以製備本發明化合物適合的酯和醯胺衍生物，例如，4-羥基的烷基和芳基羧酸酯或羧酸的烷基或芳基酯或醯胺。
已發現本發明化合物抑制基質金屬蛋白酶MMP-3、MMP-9和MMP-2，並用於治療或預防上述的疾病。由於上述未列出的其它MMPs與上述列出的具有高度的同源性(homology)，尤其在催化部位上，這可認為本發明化合物也能不同程度地抑制這樣的其它MMPs。改變分子芳基部分的取代基，以及權利要求保護的化合物的丁酸鏈的取代基將影響對所列出的MMPs的相對抑制作用。通過選擇特定取代基可以「調節(tuned)」這類的化合物以使增強與特定病理症狀有關的特定MMPs的抑制作用，同時對未涉及的MMPs只產生較少的作用。
可設計本發明抑制劑以便用於人類和獸醫領域。因此，本發明涉及治療哺乳動物(包括人和/或牛奶場、肉廠或皮毛工業飼養的動物，或如寵物如、小鼠、大鼠、馬、牛、羊、狗、貓等)的方法，就是對這些患有如上所述基質金屬蛋白酶介導疾病的動物給予有效量的本發明化合物。在這種治療方法中，優選的哺乳動物是人。可以獲得的療效是緩解骨關節炎，類風溼性關節炎、膿毒性性關節炎、牙周病、角膜潰瘍、蛋白脲、主動脈瘤病、營養不良性大泡性表皮鬆解、引起炎症反應的疾病、由MMP活性介導的骨質減少，tempero下頷骨關節病或中摳系統的脫髓鞘病；阻滯腫瘤轉移或創傷性關節損傷後的退行性軟骨丟失；減少由動脈粥樣硬化蝕斑破裂引起冠狀血栓形成或改善分娩控制。在該治療方法中抑制劑化合物的用量是能有效抑制至少一種基質金屬蛋白酶的活性，導致獲取所需療效。
在藥用組合物中應用本發明化合物，所述藥用組合物含有活性成分加上一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、填充劑、粘合劑和其它賦形劑，這將取決於給藥模式和設計的劑型。
抑制劑的給藥可以是本領域技術人員熟知的任何適當形式。適合胃腸外給藥的實例包括靜脈、關節內，皮下和肌肉給藥途徑。
應用靜脈給藥可以獲得藥物的峰血漿濃度的快速調節。通過將藥物包在脂質體中可有助於改善半衰期及藥物對關節腔的靶向給予。通過將配體摻入脂質體外周結合成滑液特殊大分子有可能改善脂質體對關節腔靶向的選擇性。另外，用或不用膠囊包裹將藥物轉成可降解微球如包含聚(DL-乳糖-共-葡萄糖苷)，可以用於肌肉、關節內或皮下貯存注射，以獲得延長持續的藥物釋放。為了改善劑型的用藥便利，可以使用i.p.植入貯藥庫和隔膜(如購於Pharmacia的Percuseal系統)。通過使用注射筆(如Novo Pin或Q-pen)或無針噴氣注射器(如購自Bioject，Mediject或Becton Dickinson)也可以使用藥便利和改善患者耐受力。若需要，使用植入泵通過套管釋放藥物到滑膜空間的方法也可以獲取延長零級(zero-order)或其它精確控制的釋放如搏動釋放。實例包括購於ALZA的皮下植入等滲泵，如ALZET等滲泵。
通過將藥物摻入生物粘附微粒載體(＜200μm)如包括纖維素、聚丙烯酸酯或聚親有機物，與適當的吸收增強劑如磷脂或醯基肉鹼一起可以獲得鼻內釋放藥物。可獲得的系統包括DanBiosys和SciosNova開發的系統。
通過將藥物摻入片劑、包衣片劑、糖錠劑(dragee)、硬和軟明膠膠束，溶液劑、乳劑或混懸劑中可以達到口服給藥。通過將藥物摻入腸溶包衣膠囊以便釋放藥物到消化蛋白酶活性較低的結腸中來獲得口服給藥。實例包括OROS-CT/OsmetTM和PULSINCAPTM系統(分別購於ALZL和Schere Drug Delivery Systems)。其它系統使用偶氮-交聯聚合物，該物質經直腸特異細菌的偶氮還原酶降解或使用通過在結腸處pH升高活化pH敏感的聚丙烯酸酯。使用上述系統產生寬範圍的吸收增強。
通過將藥物摻入栓劑中可以獲取直腸給藥。
通過加入本領域技術人員熟知的各種治療學上惰性的，無機或有機載體來將本發明化合物製成上述所列的製劑。這些實例包括(但不限於)乳糖、玉米澱粉或其衍生物，滑石粉，植物油、蠟、脂肪、多元醇如聚乙二醇、水、蔗糖、醇、甘油等。也可以加入各種防腐劑、乳化劑、分散劑、矯味劑、潤溼劑、抗氧劑、甜味劑、著色劑、穩定劑、鹽、緩衝液等，如果需要，協助製劑的穩定性或協助增加活性成分的生物利用度或獲得口服劑中可接受的味覺或氣味的製劑。
使用藥用組合物的用量將取決於接受者和治療的病症。通過本領域技術人員熟知的處方(protocols)不需過度的實驗即可測定所需的用量。另外，根據測定為治療症狀必須抑制的靶向酶的量，可以計算出所需的用量。一般講，劑量水平為約0.05mg-約150mg/kg(體重)/天(每成人每日約4mg-約12g)可用於治療上述提及的病症。然而，可理解的是對任何具體的接受者的特定劑量將取於各種因素，包括患者的年齡、體重，一般健康情況、性別和飲食、所使用具體化合物的活性及預期副作用的程度、給藥時間和途徑、排洩率以及藥物組合和被治療病症的嚴重程度。
本發明基質金屬蛋白酶抑制劑不僅用於治療上述的生理症狀，而且也可使用此種活性以純化金屬蛋白酶，並用於測定基質金屬蛋白酶的活性。這樣的活性實驗可在體外使用天然或合成的酶製劑進行或在體內進行例如使用動物模型，其中非正常破壞酶水平被自發發現(使用遺傳變異或突變動物)或通過給予外源性試劑或通過手術破壞關節的穩定以誘導非正常破壞酶產生。
實施例一般操作除另有說明外，所有反應均在火焰乾燥或玻璃乾燥箱中，在氬氣正氣壓下完成。經注射器或套管轉移敏感液體和溶液並通過橡膠隔膜導入反應容器中。除另有說明，使用Buchi蒸發器濃縮反應產物溶液。原料除了在氬氣下，從二苯酮羰游離基(ketyl)蒸餾乙醚和四氫呋喃及在氬氣下從氫化鈣蒸餾二氯甲烷外，不需進一步純化可以使用市售級試劑和溶劑。從Aldrich、1001 West Saint Paul Arenue，Milwaukee，WI53233可得到許多特殊的有機或有機金屬起始原料和試劑。從EMScience如VWR Scientific配給的常可獲得溶劑。層析在Whatman預包被玻璃底基(glass-backed)矽膠60A F-254250μm平板上進行分析薄層層析(TLC)。通過下列技術之一進行斑點檢視(a)紫外光照射，(b)暴露於碘蒸汽，(c)將平板浸入10％磷鉬酸的乙醇溶液中，隨後加熱和(d)將平板浸入3％的含0.5％濃硫酸的對-甲氧基苯甲醛的乙醇溶液中，隨後加熱。
使用230-400目EM Science矽膠進行柱層析。
以1ml min-1，在4.6×250mm Microsorb柱中，於288nm檢測進行分析高效液相層析(HPLC)，和在24ml min-1，在21.4×250nmMicrosorb柱上，於288nm檢測進行半製備HPLC。儀器用Thomas-Hoover熔點儀測定熔點(mp)，並未校正。
使用General Electric GN-OMEGA 300(300MHz)分光計測定質子(1H)核磁共振(NMR)譜(除NOESY實驗外)以及使用Genneral ElectricGN-OMEGA 300(75MHz)分光計測定碳13(13C)NMR譜。用nmr分析下列實施例中大多數合成的化合物，其圖譜與每個推斷的結構相一致。
在Bruker DMX-500(1H＝500.15MHz，13C＝125.78MHz)NMR光度計，室內(in-house)收集1HNMR NOESY(核極化效應光譜)圖譜。使用Bruker XWINNMR軟體在Silicon Graphics Indy計算機上進行數據處理。
在Kratos Concept 1-H光度儀上通過液銫二級離子(LCIMS)，快速原子轟擊(FAB)的修正版得到質譜(MS)數據。通過質譜分析下列實施例中所合成的大多數化合物，其圖譜與每個推斷的結構相一致。一般說明用編號標明多步驟方法，順序步驟。用字母標明步驟中的變化。表格數據中的點劃線標明附著(attachment)點。實驗方法實施例1和2製備[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4R-羥基-2-(苯硫甲基)丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(苯硫甲基)丁酸
按WO-09615096(實施例197)所述製備[S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-氧代-2-(苯硫甲基)-丁酸(參考化合物A)。在氬氣下，用冰浴(0℃)冷卻下攪拌該原料(6.52g，15.9mmol)的絕對乙醇溶液，同時分次加入硼氫化鈉(4.12g，109mmol)。在冰浴上攪拌反應混合物，然後在室溫攪拌過夜。將含有足夠的白色固體得到的混合物通過加水(100ml)驟停，然後真空蒸發至約1/3體積。用約100ml乙酸乙酯混合縮合的混合物，然後劇烈混合的同時小心地用1N鹽酸驟停，直到水相為強酸性為止(從過量的硼化氫中逸出氫氣)。移出水相併用水、然後用鹽水洗滌有機相幾次，然後用硫酸鈉乾燥並真空蒸發。將殘留物儘可能多地溶解於100ml的二氯甲烷/甲醇混合物(99∶1)中，然後過濾除去白色固體，通過分析HPLC(矽膠柱，1ml/min，99∶1二氯甲烷/甲醇加0.05％乙酸，在254nM檢測峰位，該4-S異構體被第二洗脫出)顯示得到純單一異構體[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(苯硫甲基)-丁酸。使用相同溶劑，在80ml/min，在製備(46mm ID)矽膠HPLC柱上層析濾液得到444mg純淨4R異構體，通過真空濃縮最合適流出物成小體積，冷卻並經過濾收集結晶。
已發現最先洗脫的主要物質是4-羥基酸的內酯異構體混合物並參考化合物B和C方法中所示進行分離。NMR解析內酯和與實施例1和2產物相關的那些異構體導致羥基酸在碳-4位的立體化學的一致性(參見化合物B和C方法)。
實施例1(2S，4R)MP 122-123℃；HPLC(1ml/min 1％甲醇在二氯甲烷中加0.05％乙酸，Rainin 4.6mm×25cm矽膠柱)tR＝10.02分；[α]D+64.4°(C0.55，丙酮)；1H NMR(丙酮-d6)δ7.1 2-7.7(m，13H)，4.82(dd，J＝4.04，8.45Hz，1H)，3.2(m，2H)，2.98(m，1H)，其它丙酮下的峰。
實施例2(2S，4S)MP137-138℃；HPLC(條件同上)tR＝13.11分鐘；[α]D+28.8°(C0.93，丙酮)；1H NMR(丙酮-d6)δ7.15-7.7(m，13H)，4.83(dd，J＝5.88，8.46Hz，1H)，3.25(d，J＝6.61Hz，2H)，2.79(m，1H)，1.95-2.25(m，2H)。參考化合物B和C分離[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-2-(苯硫甲基)-γ-丁內酯和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-2-(苯硫基甲基)-γ-丁內酯
在矽膠柱上使用5％乙酸乙酯的己烷液或0-1％甲醇的二氯甲烷的緩慢梯度洗脫，經製備HPLC，濃縮先流出物，純化[2S，4S和R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(苯硫甲基)-丁酸，導致每種γ-丁內酯異構體純樣品的分離(參考化合物B和C)。
通過鑑定連接這些碳原子的質子的相對位置，即成對質子在環平面的相同或相對一側，可以獲取繞圍手性環碳原子相對立體化學的測定。NMP圖譜，特別是一或二維核極化效應圖譜(NOESY)是解決該問題的理想技術，根據質子相對空間距離，採用了不同的核極化效應增強(NOEs)優點。參見Macura，S，和Ernst，R，R.，J.Mol，Biol.，1980，206，397。已證實兩個γ-丁內酯異構體在H-1和H-4的異構體之間具有這些質子順式(2S，4S)比具有這些質子反式(2S，4R)的異構體顯示出更大的NOE。在內酯環的其它質子和連接兩異構體的CH2之間觀察到所有其它NOEs均與該分析一致。
當純化的結晶羥基酸(實施例1和2)是如固體樣相對穩定時，這些化合物的穩定溶液緩慢顯示出一種或其它內酯，其為自發內酯化發生的結果。通過4S內酯在δ5.40ppm和4R內酯在5.65ppm的化學位移可以得到證實。轉化成2S，4R內酯的羥基酸可以鑑定為2S，4R羥基酸(實施例1)和轉化成2S，4S內酸的羥基酸可以鑑定為2S，4R羥基酸(實施例2)。
化合物B(2S，4R)MP 122-123℃；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.21-7.60(連續m，13H，芳族H)，5.65(dd，J＝4.59，7.98Hz，1H，H-4)，3.55(dd，J＝3.74，13.29Hz，1H，SCH)，3.04(dd，J＝9.97，13.28Hz，1H，SCH)，2.94-2.98(m，1H，H-2)，2.64-2.70(m，1H，H-3A)，2.46-2.51(m，1H，H-3B)。
化合物C(2S，4S)MP142-143℃；1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.21-7.60(連續m，13H，芳族H)，5.40(dd，J＝5.79，10.58Hz，1H，H-4)，3.65(dd，J＝3.50，13.40Hz，1H，SCH)，2.96(dd，J＝9.90，13.37Hz，1H，SCH)，3.02-3.07(m，1H，H-2)，2.87-2.92(m，1H，H-3A)，2.07(dd，J＝12.26，23.08Hz，1H，H-3B)。實施例3和4製備[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4R-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)-苯基]-4-羥基-2-(苯丙基)丁酸
按WO-09615096(實施例116)所述製備[S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-氧代-2-(苯丙基)丁酸(參考化合物D)。用冰浴(0℃)冷卻，在氬氣下攪拌該原料(1.00g，2.46mmol)的絕對乙醇(30ml)溶液，同時分次加入硼氫化鈉(0.743g，19.6mmol)。在冰浴下攪拌反應混合物，然後在室溫攪拌幾天。通過加入水(150ml)和乙酸乙酯驟冷含有足夠白色固體所得到的混合物，在劇烈攪拌產生的混合物的同時滴加濃硫酸，使水相成強酸性。移出水相併用水洗滌有機相數次，硫酸鈉乾燥並真空下蒸發。在製備HPLC柱(用13-23μm角矽膠填裝的Prochrom)使用1％甲醇的二氯甲烷液洗脫，層析白色殘留物，得到292mg的純的第一個洗脫的異構體和267mg純的第二個洗脫出的異構體。
使用Dean Stark trap，用微量甲苯磺酸在苯中回流除水進行分離處理，從4-羥基羧酸異構體形成γ-內酯。然後使用內酯的核極化光譜(NOESY)實驗確定這些內酯異構體具有4S和4R的立體化學特性而由此得知羥基羧酸具有的各自立體化學特性轉化成內酯時並未導致立體化學特性的改變。
實施例3(或4)(第一洗脫物)MP103-104℃；HPLC(2ml/min1％甲醇的二氯甲烷液，Rainin 4.6mm×15cm矽膠柱)tR＝6.55分鐘；1H NMR(DMSO-d6)δ12.10(s，1H)，7.65(d，J＝8.46Hz，2H)，7.59(d，J＝8.46Hz，2H)，7.48(d，J＝8.46Hz，2H)，7.34(d，J＝8.09Hz，2H)，7.24(t，J＝7.36Hz，2H)，7.11-7.15(m，3H)，5.28(d，J＝4.78Hz，1H，OH)，4.46-4.52(m，1H)，2.46-2.61(m，3H，部分在DMSO下)，1.76-1.89(m，1H)，1.36-1.65(m，5H)。
實施例4(或3)(第二洗脫物)MP155-157℃；HPLC(條件同上)tR＝9.75分鐘；1H NMR(DMSO-d6)δ12.04(s，1H)，7.66(d，J＝8.82Hz，2H)，7.60(d，J＝8.46Hz，2H)，7.48(d，J＝8.46Hz，2H)，7.36(d，J＝8.09Hz，2H)，7.22(t，J＝6.99Hz，2H)，7.10-7.15(m，3H)，5.28(bs，1H，OH)，4.49(bm，1H)，2.3-2.7(m，2H在DMSO下)，2.21-2.28(m，1H)，1.88-1.97(m，1H)，1.4-1.65(m，5H)。參考化合物F和G分離[2S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-氧代-2-[(4-羥基苯基)硫甲基]丁酸和[2R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-氧代-2-[(4-羥基苯基)硫甲基]丁酸
按WO-09615096(實施例204)所述製備外消旋的4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-氧代-2-[(4-羥基苯基)硫甲基]丁酸(5.6g)。根據一般方法D.Arlt，B.Boemer，R，Grosser和W.Lange，Angew.Chem.Int.Ed Engl.30(1991)12期，1662-1664頁在專用手性固定相上層析該原料，使外消旋體分離成對映體。第一個洗脫出的異構體是有右旋的2S異構體(1.60g)和第二個洗脫出的異構體是有左旋的2R異構體(1.43g)。
化合物F(2S)MP130-132℃；HPLC(1ml/min，1％乙醇的己烷液，專用4.6mm×25cm手性柱)tR＝7.72分鐘，99.6％純度；[α]D+102.6°(C0.88，丙酮)；1H NMR(CD3OD)δ7.97(d，J＝8.46Hz，2H)，7.69(d，J＝8.46Hz，2H)，7.64(d，J＝8.45Hz，2H)，7.44(d，J＝8.82Hz，2H)，7.28(d，J＝8.46Hz，2H)，6.70(d，J＝8.82Hz，2H)，4.86(6s，2H)，2.98-3.54(連續m，5H)。
化合物G(2R)HPLC(1ml/min，1％乙醇的己烷液，專用4.6mm×25cm手性柱)tR＝10.80分鐘，99.8％純度；[α]D-103.8°(c1.0丙酮)；1HNMR(CD3OD)與化合物C相同。實施例5和6製備[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[(4-羥基苯基)硫甲基]丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)-苯基]-4-羥基-2-[(4-羥基苯基)硫甲基]丁酸
使用實施例1和2的通用方法可以製備這些化合物，但使用上述參考化合物F而不用[S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-氧代-2-(苯硫甲基)丁酸。實施例7-16名稱和結構如下所示。使用實施例5和6的通用方法製備實施例9-20的化合物，但用根據WO-09615096方法製備的適當的4-氧代化合物，而不用[S]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-氧代-2-(苯二甲醯亞氨乙基)丁酸。
實施例7-8製備[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[2-(3-N，N-二乙基氨基甲醯基)苯乙基]丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-氯苯基)-苯基]-4-羥基-2-[2-(3-N，N-二乙基氨基甲醯基)-苯乙基]-丁酸
實施例9-10製備[2S，4R]-4-[4-(4-戊氧基苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸；[2S，4S]-4-[4-(4-戊氧基苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯基丙基)丁酸
實施例11-12製備[2S，4R]-4-[4-(4-苄氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸和[2S，4S]-4-[4-(4-苄氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯基丙基)丁酸
實施例13-14
製備(1S，2R，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)-苯基)-S-羥甲基]-反式-2-苯硫環戊烷羧酸和(1S，2R，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)-苯基)-R-羥甲基]-反式-2-苯硫環戊烷羧酸
實施例15-16製備(1S，2S，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)-苯基)-S-羥甲基]-順式-2-(2-甲氧基羰基苯硫基)-環戊烷羧酸和(1S，2S，5S)-反式-5-[(4-(4-氯苯基)-苯基)-R-羥甲基]-順式-2-(2-甲氧基羰基苯硫基)環戊烷羧酸
生物學方案和體外試驗數據P218驟冷螢光分析MMP抑制作用P218驟冷螢光分析(Microfluorometric Profiling Assay)是由C.G.Knight等[FEBS Letters，296，263-266(1992)]初次介紹的修改方法，涉及底物和小杯中各種基質金屬蛋白酶(MMPs)。用本發明每個代表性化合物和三種MMPs、MMP-3、MMP-9和MMP-2以平行分析方法，採用96孔微滴定平板和Hamilton AT工作檯進行分析。P218螢光底物P218是在N-端位置含有4-乙醯基-7-甲氧基香豆素(MCA)基團和內在有3-(2，4-二硝基苯基)-(L)-2，3-二氨基丙醯基(DPA)基團的合成底物。這是由Knight(1992)報導的肽的修飾，被用於基質金屬蛋白酶的底物。一旦分解P218肽(putative clip site at the Ala-Leu bond)，在螢光計上(在328nm激發，在393nm發射)可測定MCA基團的螢光。目前正由BACHEM Bioscience，Inc，僅僅為Bayer Corp.生產P218。P218具有結構H-MCA-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2(MW 1332.2)重組人CHO溶基質素(MMP-3)重組人CHO Pro-MMP-3按T.J.Housley等[J.Biol.Chem.，268，4481-4487(1993)]所述方法，表達與純化人CHO pro-溶基質素-257(pro-MMP-3)。
Pro-MMP-3的活化將1.72μM(100μg/ml)的Pro-MMP-3置於MMP-3活化緩衝液中(含有pH7.5的5mM Tris、5mM CaCl2、25mMNaCl和0.005％Brij-35)，用TPCK(N-對甲苯磺醯基-(L)-苯丙氨酸氯甲基酮)胰蛋白酶(1∶100w/w對Pro-MMP-3)，在25℃孵化30分鐘進行活化。通過加入大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI；5∶1w/w對胰蛋白酶濃度)來停止反應。該活化方案導致形成45KDa活化MMP-3，它仍含有C端酶部分。製備人重組Pro-明膠酶A(MMP-2)人重組Pro-MMP-2根據R.Fridman等人的方法[J.Bial.Chem.267 15398-405(1992)]，使用牛痘表達系統，製備人Pro-明膠酶A(Pro-MMP-2)。
Pro-MMP-2活化將252mg/ml Pro-MMP-2以1∶5稀釋至最終濃度為50mg/ml的MMP-2活化緩衝液，該緩衝液含有pH7.5的25mMTris、5mM CaCl2，150mM NaCl和0.005％Brij-35。製備10mM(3.5mg/ml)的對-氨基苯基醋酸汞(APMA)為0.05N NaOH。以1/20的反應體積加入所述的APMA，使最終APMA濃度為0.5mM，在37℃孵化該酶30分鐘。對2L的MMP-2活化緩衝液透析已活化的MMP-2(15ml)二次(用含有0.1％BSA的MMP-2活化緩衝液預處理透析1分鐘，隨後充分水洗)。在Centricon濃縮器上濃縮酶(也用含有0.1％BSA的MMP-2活化緩衝液預處理透析1分鐘，隨後用H2O水滌，然後用MMP-2活化緩衝液洗滌)，再稀釋，再濃縮，重複兩次。用MMP-2活化緩衝液稀釋酶至7.5ml(原體積的0.5倍)。製備人重組Pro-明膠酶B(MMP-9)人重組Pro-MMP-9按S.M.Wihelm等人所述[J.Biol.Chem.26417213-17221(1989)]，衍生於U937cDNA的人重組Pro-明膠酶B(Pro-MMP-)是使用杆狀病毒蛋白表達系統作為全長形式表達的。使用上述方法[M.S.Hibbs et al.，J.Biol.Chem.，260 2493-500(1984)]純化Pro-酶。
Pro-MMP-9的活化將Pro-MMP-9(20μg/ml)於MMP-9活化緩衝液中(該緩衝液含有pH7.4 50mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2和0.005％Brij-35)，用0.5mM對-氨基苯基醋酸汞(APMA)在37℃孵化3.5h進行活化。以相同的緩衝液透析酶以除去APMA。測試設備Hamilton Microlab AT Plus 使用Hamilton Microlab AT Plus自動地進行MMP-分布(profiling)分析。Hamilton操作程序是(1)使用2.5mM抑制劑的100％DMSO的原溶液自動地進行系列稀釋至11份有效抑制劑；(2)將底物，隨後為抑制劑分配於96-孔Cytofluor平板中；和(3)加入單一酶至平板中，並混和，使之開始反應。隨後在底物加入點開始程序，重新混合稀釋的抑制劑並通過加入酶開始反應來自動製備每一加成酶的平板。以這種方法，使用相同抑制劑的稀釋進行所有MMP分析。
Millipore Cytofluor II孵育後，在Cytoflor II螢光測定平板讀出儀上用340nM激發和在395發射，得到86的設定，閱讀平板。緩衝液微量螢光測定反應緩衝液(MRB)在含有pH6.5的50mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)與10mM CaCl2、150mM NaCl、0.005％Brij-35和1％DMSO的微螢光測定反應緩衝液(MRB)中為微螢光分析製備試驗化合物稀釋液、酶和P218底物。方法MMP微螢光測定掃描分析。用6μM的最終P218濃度，約0.5-0.8nM活化的MMP(每96孔平板一種酶)，和各種變量抑制劑濃度進行分析。在分析中用Hamilton Microlab AT Plus進行系列稀釋多至11個化合物，從2.5mM原液(100％DMSO)至10倍的最終化合物濃度。開始，儀器將各種用量的微螢光測定反應緩衝液(MRB)傳送至96管架的1ml Marsh稀釋管中。儀器取20μl抑制劑(2.5mM)並將它與緩衝液在Marsh管架A排管中混合，得到50μM抑制劑濃度。然後將抑制劑系列稀釋至10、5、1、0.2、0.05和0.01μM。對分析中「僅有酶」孔而言，樣品架位置1僅含有DMSO，使列1，排A至H，無抑制劑。然後用儀器分配107μl的P218至單一96孔Cytofluor微滴定平板上。儀器再混合併從Marsh架的排A至G裝入14.5μl稀釋化合物至微滴定平板的相應排內。(排H代表「基底排」。向該處加入39.5μl的微螢光測定反應緩衝，以代替藥物或酶)。從BSA-處理試劑儲存器至每孔加入25μl的適當酶(5.86倍的最終酶濃度)開始反應，而排H，「背景」排除外。(在室溫用含有150mM NaCl的1％BSA的50mM pH7.5 Tris預處理酶儲存器1小時，隨後充分水洗並於室溫乾燥)。
加入及混合酶後，復蓋平板並在37℃孵育25分鐘。將P218底物分配微滴定平板，隨後再混合併從相同Marsh架將藥物分配於微滴定平板來開始Hamilton程序以相同方法測試另外的酶。然後將待測的第二(或第三，等)MMP從試劑架分布於微滴定平板上並且混合，預先進得復蓋和孵化來試驗第二(或第三，等等)MMP。
微螢光測定分析的IC50測定從出口「CSV」文件至操縱Excel擴展頁複製Cytofluor II產生的數據。同時計算來自幾個不同的MMPs數據(每種MMP一個96孔平板)數據。通過將含化合物孔的水解量(25分鐘水解產生的螢光單位)與列1中「僅有酶」孔進行對比，對每種藥物濃度測定百分抑制作用。減去基底值後，百分抑制率為按下式計算((對照值-處理值)/對照值)×100對抑制劑濃度5，1，0.5，0.1，0.02，0.005和0.0001μM測定百分抑制率。使用百分抑制率對抑制劑濃度對數的線性回歸分析得到IC50值部分本發明化合物分布分析數據表5MMP-分布數據。所有IC50值以nM表示
*由於碳原子上羥基的立體化學未測定，非對映體3和4的實施例號可以互換。
從在此公開的本發明說明書或實施，本發明的其它實施例對本領域技術人員而言是明顯的。可以將說明書和實施例僅認為是示例性的，本發明的真正範圍和精神將在權利要求書中指明。
權利要求
1.具有基質金屬蛋白酶抑制劑活性和通式的化合物或其藥學上可接受的鹽
其中T是藥學上可接受的取代基；X是0、1或2；m是0或1-4的整數；n是0或1；和或者A和G兩者為CH2；或者A是化學鍵和G是CH2；或者A是CH或N；和G是CH；和A通過下式成環鍵與G連接(CH2)0-3(Q)(CH2)0-3；其中Q是化學鍵，S，或O；和C、S和O構成連接原子；導致環的形成，該環包括A(所述的成環鍵)和G；條件是在所述的成環鍵中n加上連接原子的總數之和是1-4整數；和在所述環中雜原子數是0或1；R1是*6-10個碳原子的芳基，條件是假若芳基是苯基，則X是1或2；*含有4-9個碳原子的雜芳基，並至少有一個N，O或S雜原子；*芳基取代的鏈烯基，其中芳基部分含有6-10個碳原子，鏈烯基部分含有2-5個碳原子；*雜芳基取代的鏈烯基，其中雜芳基部分含有4-9個碳原子和至少一個N，O或S雜原子，以及鏈烯基部分含有2-5個碳原子；*芳基取代的炔基，其中芳基部分含有6-10個碳原子和炔基部分含有2-5個碳原子；*雜芳基取代的炔基，其中雜芳基部分含有4-9個碳原子和至少有一個N，O或S雜原子和炔基部分含有2-5個碳原子；*N-苯二甲醯亞氨基(phthalimidoyl)；*N-(1，2-萘二羰醯亞氨基(naphthalenedicarboximidoyl))；*N-(2，3-萘二羰醯亞氨基)；*N-(1，8-萘二羰醯亞氨基)；*N-吲哚基(indoloyl)；*N-(2-Pyrrolodinonyl)；*N-琥珀醯亞胺基(succinimidoyl)；*N-馬來醯亞胺基(maleimidoyl)；*3-乙內醯脲基；*1，2，4-尿唑基；*醯氨基；*尿烷；*脲*非芳族取代或未取代的雜環，含有N原子並通過N原子連接，以及含有一個另外的O或S；*氨基；和*ZR8，其中Z代表
R8是*6-10個碳原子的芳基；*雜芳基，含有4-9個碳原子和至少一個N，O或S雜原子；*芳基烷基，其中芳基部分含有6-12個碳原子和烷基部分含有1-4個碳原子；或*雜芳基-烷基，其中芳基部分含有4-9個碳原子和至少有一個N，O或S雜原子以及烷基部分含有1-4個碳原子；和條件是當Z是O，R8也可以是末端具有H、烷基或苯基的亞烷氧基或聚亞烷氧基。任何T或R1基團的芳基或雜芳基部分任選含有多至兩個取代基，所述取代基選自-(CH2)yC(R11)(R12)OH，-(CH2)yOR11，-(CH2)ySR11，-(CH2)yS(O)R11，-(CH2)yS(O)2R11，-(CH2)ySO2N(R11)2，-(CH2)yN(R11)2，-(CH2)yN(R11)COR12，-OC(R11)2O-，其中兩個氧原子連接芳環，-(CH2)yCOR12，-(CH2)yCON(R11)2，-(CH2)yCO2R11，-(CH2)yOCOR11，滷素，-CHO，-CF3、-NO2、-CN和-R12，其中Y是0-4；R11代表H或1-4個碳原子的低級烷基；和R12代表1-4個碳原子的低級烷基。所述的化合物是非對映體的混合物或單一的非對映體，它比非對映體組成的所述的非對映體混合物具有更大的MMP抑制活性。
2.權利要求1的化合物，其中A是CH2；G是CH2；和n是0；所述的化合物具有下式
其中T、x、m和R1均如權利要求1定義。
3.權利要求2的化合物，其中m是0、1或2；和當m是0時，R1是
當m是1時，R1是
當m是2時，R1是
4.權利要求3的化合物，其中T是滷素或OR6，其中R6是1-6個碳原子的烷基或苄基；X是1；m是0或2；當m是0時，R1是
當m是2時，R1是
5.權利要求2的化合物，具有名稱為4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(苯硫甲基)丁酸；[2S，4R]-4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(苯硫甲基)-丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[(4-羥苯基)-硫甲基]-丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-[2-(3-N，N-二乙基氨基甲醯基)-苯乙基]丁酸；4-[4-(4-戊氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸；4-[4-(4-苄氧苯基)苯基]-4-羥基-2-(3-苯丙基)丁酸；4-[4-(4-氯苯基)苯基]-4-羥基-2-(2-苯二甲醯亞氨基乙基)丁酸；
6.權利要求1的化合物，其中n是0或1；和A是CH或N；和G是CH；和A通過下式成環鍵與G連接(CH2)0-3(Q)(CH2)0-3；其中Q是化學鍵、S或O；和C、S和O組成連接原子；導致包括A，所述的成環鍵和G的環的形成。所述的化合物具有下式
條件是在所述的成環鍵中n加連接原子的總數之和是1-4的整數；和在所述環中雜原子數是0或1；T、x、m和R1均如權利要求1所定義。
7.權利要求6的化合物，其中n是0；A是CH；α是化學鍵；和所述成環鍵是-(CH2)2-；和所述化合物具有下式
8.權利要求7的化合物，其中T是滷素或OR6，其中R6是1-6個碳原子的烷基或苄基；X是1；m是0或1；和當m是0時，R1是
當m是1時，R1是
9.權利要求6的化合物；具有名稱為反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)羥甲基]-反式-2-苯二甲醯亞氨基環戊烷羧酸；反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)羥甲基]-順式-2-(2-甲氧基羰基苯硫基)環戊烷羧酸；和反式-5-[(4-(4-氯苯基)苯基)羥甲基]-反式-2-苯二甲醯亞氨基甲基環戊烷羧酸。
10.包含權利要求1的化合物和藥學上可接受的載體的藥用組合物。
11.包含權利要求2的化合物和藥學上可接受的載體的藥用組合物。
12.包含權利要求6的化合物和藥學上可接受的載體的藥用組合物。
13.治療哺乳動物由基質金屬蛋白酶介導的疾病的方法，包括對所述的哺乳動物給予可以有效的治療所述疾病的用量的權利要求1的化合物。
14.權利要求13的方法，其中所述的哺乳動物是人。
15.權利要求13的方法，其中所述的療效是緩解骨關節炎，類風溼性關節炎、膿毒性關節炎、牙周病、角膜潰瘍、蛋白脲、主動脈瘤病、營養不良性大泡性表皮鬆解、引起炎症反應的疾病、由MMP活性介導的骨質減少，tempero下頷骨關節病或中摳系統脫髓鞘病；阻滯腫瘤轉移或創傷性關節損傷後的退行性軟骨丟失；減少由動脈粥樣硬化蝕斑破裂引起冠狀血栓形成或改善分娩控制(birth control)；和所述的權利要求1的化合物用量是可以有效抑制所述哺乳動物中的至少一種基質金屬蛋白酶的活性，從而獲得所述的療效。
16.製備下式化合物的方法
包括使下式化合物酮羰基還原成羥基
其中T、x、G、n、A、m和R1均如權利要求1所定義。
全文摘要
本發明涉及基質金屬蛋白酶抑制劑、含有它們的藥用組合物及使用它們治療各種生理病症的方法。本發明化合物具有通式Ⅰ結構,其中T是藥學上可接受的取代基;A是CH
文檔編號C07C235/84GK1241177SQ97180910
公開日2000年1月12日 申請日期1997年10月30日 優先權日1996年10月31日
發明者H·C·E·克魯恩德爾, S·M·比約格, L·M·扎德朱拉, W·F·布魯巴克 申請人:美國拜爾公司