陽離子脂質體和多脫氧核糖核苷酸的複合物作為藥劑的用途的製作方法

2023-07-08 10:36:46

專利名稱：陽離子脂質體和多脫氧核糖核苷酸的複合物作為藥劑的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及由陽離子脂質體和多脫氧核糖核苷酸形成的複合物作為藥劑的用途。 更具體地說，本發明涉及上述具有顯著的時間上的穩定性可作為具有抗炎活性藥劑的複合 物的用途。
背景技術：
眾所周知，脂質體能夠用作全身給藥的藥物載體。它們是通過靜脈內、皮下、肌肉 內注射或者通過輸注給藥的。
至於涉及脂質體和DNAs之間複合物的結構，人們已知寡脫氧核苷酸和質粒DNAs 能夠通過離子鍵與陽離子型的脂質體的外表面結合(C. F. Bennet等，Mol. Pharmacol. 41， 1023-1033，1992 ；Xiang Gao 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 179，280-285，1991)。但是， 在該複合物和它們用作抗炎劑藥物時沒有給出任何有關時間上的穩定性的暗示。從專利申 請WO 97/04787中人們也已知當寡核苷酸具有8至50個核苷酸的鏈長時，它們能夠被包載 在脂質體中。在這些文獻中也沒有給出有關這類複合物在時間上穩定性的任何信息。
現已描述過含有脂質體和分子量為16000Da的多脫氧核糖核苷酸的複合物可以 通過解聚核酸得到，其中可以把這些聚合物包含在脂質囊中(Gursoy等，Wmrmazie 48， (1993)H. 7,559-560) WO 97/04787 重複了上述相同的描述。
人們也已知含有寡核苷酸和多脫氧核糖核苷酸的脂質體複合物具有顯著增加後 一物質的藥理活性的特性(Bennet 等，Gursoy 等，見上；A. Colige,Biochemistry 1993,32, 7-11)。儘管如此，申請人進行的試驗已經表明現有技術中的這些複合物不能用作藥劑，因 為當把它們懸浮於給藥所需的含水介質中時，它們就會迅速喪失其活性。除此之外，在該復 合物中脂質體的陽離子成分、如硬脂醯胺和季銨型表面活性劑是潛在的毒性劑並且能夠引 起毒副作用。因為含水相的物理外形的變化，即從有乳光(初乳)轉化成最終的清澈，伴隨 著沉澱物的形成，複合物的降解也是明顯的。
眾所周知，多脫氧核糖核苷酸類，特別是稱作去纖苷酸的多脫氧核糖核苷酸可 以作為具有纖維蛋白溶酶(prof ibrinolytic)活性(R. Pescador 等，Thromb. Res. 30 1-11，1983)、抗血栓形成的-血栓溶解的(thrombolytic) (R. Niada 等，Pharmacol. Res. Commun. 14(10)，949-957，1982)、抗高血壓的(F. Trento 等，XXVII Congr. Naz. Soc. It. Farmaco 1. Torino 25-29，1994 年 9 月，Abstract Book 第 703 頁)、抗局部缺血、細 胞保護性(G. Rossoni 等，J. Cardiovasc. Pharmacol. 27，680-685 1986)以及抗炎活性 (R. Scalia, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 18(10)669-679,1996)的藥劑。每日劑量 範圍從600到1200mg。所有這些物質的藥理活性都主要指的是從它們血管內皮局部釋放治療有效量的內生前列腺環素的特性(參見R. Niada等，上述，C. Thiemermarm等， Am. J. Cardiol. 56 987-9821985)。發明內容
現在申請人已經出人意料地和令人驚奇地發現從脂質體和多脫氧核糖核苷酸能 夠製備具有時間上持續的高活性並去除毒副作用的複合物。
這將使得使用含有本發明的複合物的含水乳劑用來連續治療一天或多天得以實 現並且也使得長期持續給藥諸如輸注得以實現。
所以本發明的目的是把由陽離子型脂質體和通過解聚核酸得到的具有 7，000-60, 000道爾頓、優選10，000-60, 000道爾頓、最優選為15，000-60, 000道爾頓分子量的多脫氧核糖核苷酸形成的複合物用作藥劑，尤其是抗炎劑，其中多脫氧核糖核苷酸位於 脂質體的外表面。
該脂質體複合物的特徵在於通過加入等份的氯化十六烷基吡啶錫溶液，它們的 溶液與該季銨離子形成的定量沉澱物是不同於在相同條件下通過處理由相同的多脫氧核 糖核苷酸和陽離子型脂質體組成的脂質體複合物、其中的多脫氧核糖核苷酸位於脂質體內 部所得到的。
在本發明優選的實施方案中，多脫氧核糖核苷酸是去纖苷酸。
所以按照本發明，在不影響治療有效性的條件下，減少給患者給藥的每日劑量也 是可能的。
脂質體是脂囊泡，它是在含水相中形成的，且一般由磷脂類組成。在水和一種不溶 性有機溶劑存在下，所述的化合物能夠形成一種球形殼，其殼壁是雙層的，其中分子的極性 部分(親水性的)在脂質體的外側而脂質部分(疏水性的)在雙層內。在這種情況下，把 該囊泡稱之為單層狀。也有多層狀脂質體，它們由多種脂質層組成。
用於本發明含脂質體的複合物中的分子量為15，000-60，000道爾頓的多脫氧核 糖核苷酸可以通過提取並接著解聚高分子量的核酸獲得。
如USP 3，770，720中所述進行高分子量核酸的提取，本文將該文獻引用為參考 文獻。如USP 4，985，552所述通過進行核酸的解聚能夠獲得分子量為15，000-30，000道 爾頓的多脫氧核糖核苷酸，本文將USP 4，985，552引用為參考文獻。申請人已經證實當如 Methods in Enzymo 1.第3卷第708-712頁中所定義的可逆性深色在20和40%之間(就 未變性的樣品可逆增色性的吸收值而言)時使用USP 4，985，552工藝的相同條件終止解聚 也能夠獲得分子量在30，000-60，000的聚合物，或者當可逆增色性的值等於或大於3時，終 止解聚能夠獲得分子量等於或大於7，000的多脫氧核糖核苷酸。可逆增色性是伴隨解聚過 程的一個參數。
優選的與陽離子型脂質體形成複合物的多脫氧核糖核苷酸是大家已知的分子量 為 15，000-30，000 的去纖苷酸類(D. C. I.) (Information Pharmaceutiques 0. Μ. S. η. 4，第 1 卷/1987，第 272 頁)。
本發明脂質體的主要脂質成分是卵磷脂或磷脂醯乙醇胺，它們能夠與R. R. C. New Volume 「脂質體，一種實際途徑」IRL出版社，1994中公開的其它脂質結合在脂質體中，本文 將該文獻引用為參考文獻。優選相關的脂質是麥角留醇和膽甾醇。
該組合物中能夠加入選自於公知的並且列在上述相同文獻中的一種或多種抗氧 化劑。優選的抗氧化劑是α-生育酚。
向本發明的脂質體中加入陽離子型表面活性劑，該表面活性劑含有一個或多個單 一或雙取代的氨基或季銨基團。該季銨基團包括碳原子數在8至22之間的一條或多條脂 族鏈。
優選具有18個碳原子脂族鏈的季銨型表面活性劑。
脂質體的脂質/脂質類總量和陽離子型表面活性劑之間的摩爾比在10 0.05到 10 3之間的範圍，優選為10 1。當與卵磷脂(或磷脂醯乙醇胺)一起使用時，還有第二 種不同的脂質，兩種脂質和表面活性劑之間的內部摩爾比(卵磷脂(或磷脂醯乙醇胺) 第二種脂質表面活性劑)在9 1 0.05到7 3 3之間的範圍內，優選8 2 1。
脂質體用來和活性組分(多脫氧核糖核苷酸)的重量比在10 2到10 0. 1的 範圍內，優選10 1。
按照D. C. Litzinger, Biochim. Biophys. Actal281,139-149，1996 或者在上述的 R. R. C. New' s Volume中所述能夠進行本發明所用的陽離子脂質體複合物的製備。具體來 說，可用於製備本發明複合物的工藝包括下列步驟
a.藉助溶劑反相蒸發法製備脂質體(參考文獻為&oka P. et Alii. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 4194 1978) :4份有機相和1份水，其中有機相可以是極性的(例如，直 鏈或支鏈的C1-C4的低級脂肪族醇)或非極性的(如直鏈或支鏈的C1-C4的二烷基醚類，如 二乙醚，部分氯化的C1-C2W烴，優選氯仿)，其中溶有脂質類、陽離子表面活性劑和抗氧化 劑，把這樣得到的兩相系統在0°C進行超聲處理5-20分鐘，然後在室溫下減壓蒸發有機相， 由此得到一種乳濁液，
b.按照R. R. C. New volume的第5244頁所描述的技術使該乳濁液流過孔直徑在 100到600nm之間，優選400nm的聚碳酸酯膜；把該步驟至少重複三次，從而得到與膜孔相 當的平均直徑的小囊，
c.在加入凍幹輔助劑的含水溶液後，把含水乳濁液凍幹，其中的凍幹輔助劑如單 糖類如蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、果糖或多糖類如葡聚糖、具有不同分子量的麥芽糖糊精類， 從而使該輔助劑比脂質類至少多7倍。優選多10到15倍之間，
d.最終藥用乳劑的製備在無菌環境下，邊攪拌，邊把稀釋過的多脫氧核糖核苷 酸的無菌等滲水溶液加入裝有凍幹乳濁液的容器中。形成了含有脂質體複合物的乳濁液， 其中多脫氧核糖核苷酸用一個離子鍵與脂質體的外壁連接。另一種方法，把一種無菌等滲 溶液加入裝有凍幹脂質體的容器中，並且在無菌環境下把這樣得到的乳濁液與含有活性組 分的溶液混合。
本發明脂質體的穩定性已經通過在乳劑製備後迅速測定藥效活性，然後在25°C黑 暗中和無菌條件下放置第30天測定藥效活性而進行了評估。
將含有包裹有多脫氧核糖核苷酸脂質體複合物(Gursoy等，見上)的乳劑進行相 同的試驗並且用作對照製劑。
申請人也已經發現本發明複合物也可以用作具有較高活性而同時沒有毒副作用 的抗高血壓劑和抗血栓形成劑。
在下列試驗模型中已經測定了藥理活性。
-抗炎活性(Miyasaka等，Eur. J.Pharmacol· 77 229-236 1982)。
-動脈高血壓(F.Trento等，見上)。
-抗血栓形成的活性(R.Niada 等，Thromb. Res. 23 233-246，1981)。
在涉及抗炎活性的試驗中，已經檢測了存在於得到的動物胸膜滲出物的多形核白 細胞(polymorphonucleates)的髓過氧物酶的量。該酶的量與產生的炎症成正比。結果 用相對於對照組的髓過氧物酶(MPO)的百分變化量表示，用下列公式計算
權利要求
1.一種藥劑，其含有由陽離子型脂質體和具有15，000-60, 000道爾頓分子量的多脫氧 核糖核苷酸構成的複合物，所述的多脫氧核糖核苷酸是通過把核酸解聚得到的，在複合物 中多脫氧核糖核苷酸位於脂質體的外表面，其中所述脂質體和多脫氧核糖核苷酸之間的重 量比從 10 2 至Ij 10 0. 1。
2.權利要求1的藥劑，其具有抗炎活性。
3.權利要求1的藥劑，其具有抗血栓形成活性。
4.權利要求1的藥劑，其具有抗高血壓活性。
5.權利要求1的藥劑，用於需要持續釋放內皮前列環素的病理學療法的治療。
6.按照權利要求1的藥劑，其中多脫氧核糖核苷酸是去纖苷酸。
7.按照權利要求6的藥劑，其中多脫氧核糖核苷酸的分子量在15，000到30，000的範 圍中。
8.按照權利要求1的藥劑，其中加入一種或多種抗氧化劑。
9.按照權利要求1的藥劑，其中存在含有一個或多個單_、雙-取代的氨基或季銨基團 的陽離子表面活性劑，所述的季銨基團含有一個或多個碳原子數為8到22的脂族鏈。
10.按照權利要求1的藥劑，其中脂質體的脂質/脂質類的總量和陽離子表面活性劑之 間的摩爾比為10 0.05到10 3。
11.按照權利要求10的藥劑，其中脂質體中的磷脂包括卵磷脂或磷脂醯乙醇胺和第二 種不同的脂質，並且卵磷脂或磷脂醯乙胺第二種脂質陽離子表面活性劑的摩爾比範圍 從 9 1 0. 05 至Ij 7 3 3。
12.陽離子型脂質體和具有15，000-60，000道爾頓分子量的多脫氧核糖核苷酸構成的 複合物在製備用於治療患者炎症、血栓形成或高血壓或用於提供持續釋放內皮前列環素的 藥物的用途，所述的多脫氧核糖核苷酸是通過把核酸解聚得到的，在複合物中多脫氧核糖 核苷酸位於脂質體的外表面，其中所述脂質體和多脫氧核糖核苷酸之間的重量比從10 2 到 10 0.Io
全文摘要
本發明涉及一種複合物作藥劑特別是抗炎劑的用途，其中所述的複合物是由陽離子型脂質體和具有分子量為7,000-60,000道爾頓的多脫氧核糖核苷酸形成的，該多脫氧核糖核苷酸是通過解聚核酸得到的，在所述的複合物中多脫氧核糖核苷酸位於脂質體的外表面。
文檔編號A61P29/00GK102028702SQ201010542720
公開日2011年4月27日 申請日期1999年6月11日 優先權日1999年6月11日
發明者C·納斯特魯茲, E·埃斯波斯託, E·梅內加蒂, F·特倫託, L·菲爾羅, R·波爾塔 申請人:金帝姆公司