一種從人乳中分離、純化骨橋蛋白opn的方法

2023-07-08 17:44:41

專利名稱：一種從人乳中分離、純化骨橋蛋白opn的方法
技術領域：
本發明屬於生物化學領域。具體地說，本發明涉及一種從人乳中分離、純化骨橋蛋白 OPN的方法。
背景技術：
骨橋蛋白(Oste叩ontin, OPN)是一種重要的多功能細胞外基質蛋白，也是一個與炎症 過程有關的潛在的促炎症細胞因子，主要來源於人、小鼠、大鼠、牛、豬和兔，在骨組織細 胞、巨噬細胞、平滑肌細胞、上皮細胞等多種細胞上表達，在介導細胞的趨化、聚集、黏附、 增殖和遷移，以及骨組織的礦化與重建、免疫調節、信號轉導等方面起著重要的作用。由於 這種蛋白是細胞在骨基質中的產物，並能在細胞與基質中的礦質形成一種橋連，人們將其命 名為骨橋蛋白。OPN是一種含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)帶負電荷的非 膠原性骨基質分泌型糖基化磷蛋白，由於它是一種高度酸化的多功能域的蛋白，理論分子量 約為33kDa，但由於高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以達到75kDa。其中含有特異的序 歹ij:信號肽序列、7 10個連續Asp序歹"RGD序列和酪氨酸激酶II磷酸化識別序列。在RGD 下遊還存在N-連結糖基化部位序列和O-連結糖基化部位。磷酸化後的OPN主要是以RGD結 構與細胞表面的整合素受體(oM3p 04卩3)結合，而未磷酸化OPN則不依賴於RGD結構與某些 CD44的變異體結合，OPN和細胞表面受體相互作用能誘導信號傳導從而促進細胞的黏附和 遷移，與多種生物學功能密切相關。
蛋白質的分離、純化主要有二維聚丙烯醯胺凝膠電泳(2D-Gel)、親和層析(Affinity Chromatography, AC)以及高效液相色譜分離(HPLC)的方法，它們各自有獨特的優勢。但 2D-Gel分離蛋白的方法所用試劑消耗大、程序繁瑣""fl/. CTzm. /卯6， 6& S50-WS) ; AC 方法 (/Vofd" Expre咖'ow朋c/ Pwny ca"肌 2003, 23S-245;fixpressfo" cmc/ 屍w訴c^/o". 7卯7, 9: M9-JW)，雖然在OPN分離、純化上有一定優勢，但程序複雜、消耗 時間長、所用試劑種類多、成本又高，而且，AC是在一種特製的具有專一性吸附能力的親 和層析試劑上進行的層析，不是所有的蛋白質都可以找到合適的親和層析試劑，在蛋白質純 化工作中存在一定的局限性
發明內容
本發明的目的是提供一種步驟簡單、快速的分離、純化人乳中骨 橋蛋白OPN的方法。
本發明所用的傅立葉變換離子迴旋共振質譜(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, FT-ICR-MS)，是最近三十年快速發展起來的一項 質譜檢測手段。它以高解析度、高質量檢測上限、高掃描速度、寬的動態範圍、最佳的質量 準確度等技術優勢，越來越廣泛地應用到蛋白質的研究中，成為將各種蛋白質與序列資料庫 聯繫起來的橋梁。本專利採用"Bottom Up"方法，在多肽水平上鑑定和研究蛋白質，採用 HPLC (SCX和C4色譜柱)和配有Nano-spray技術的高分辨FT-ICR-MS等化學方法，摸索 出分離與純化了人乳中骨橋蛋白OPN的最佳色譜條件，所用試劑簡單、操作方便。將純化 後樣品OPN利用胰蛋白酶在溫和條件下進行酶解，利用FT-ICR-MS串聯質譜(MS/MS或 MSn)，母離子的活化採取碰撞激發解離(CAD)和電子捕獲誘導解離(ECD)的方式，根 據多肽碎片命名規則以及CAD的C-N肽鍵斷裂和ECD的N-Ca斷裂在裂解機理上的互補性 規律，藉助先進的Mascot軟體資料庫，分析了 OPN中有代表性的多肽片段GDSVVYGLR 和QNLLAPQTLPSK的質譜裂解機理，充分證明了高分辨質譜的準確性，可以達到100%的 覆蓋率，不僅增強了OPN鑑定的可信度，也能更好的鑑定OPN翻譯後的修飾位點。 本發明從人乳中分離、純化骨橋蛋白(OPN)的方法，按以下步驟進行
(A) 將人乳樣品經高速離心分離，高速離心機的轉速需大於12000轉/分鐘，溫度控制在 不超過0。C，離心時間為30 45min;分離出乳脂、乳清和乳粒，其中乳脂在上層、乳粒在下 層，OPN在中層的乳清部分中；
(B) 初步分離乳清部分用lmol/L硫酸調節至PH為4.6，沉澱，除去酪蛋白後，採用 高效液相色譜配有SCX色譜柱進行分離，流動相A(20mmol/L檸檬酸、20mmol/L擰檬酸銨、 pH 3.0)和流動相B (20 mmol/L擰檬酸、20 mmol/L擰檬酸銨、0.5 mol/LNaCl、 pH3.0)進行 梯度洗脫，先100。/。A洗脫20min,然後流動相B含量從0%到10%洗脫10min,後再大幅 度使用流動相B含量從60%到100。/。洗脫10min，在洗脫的過程中保持總流速為lmL/min， 柱溫為35。C，得到八個組份(見圖l),其中，SCX5、 SCX6組份含有OPN;
(C) 進一步純化將SCX5、 SCX6組份合併，用高效液相色譜配有C4色譜柱對SCX5、 SCX6組份進行純化，流動相組成為A(0.1%TFA 、 99.9%水(v/v))和B (0.1% TFA 、9.9% 水與90%乙氰(v/v))，進行梯度洗脫，先100。/。A洗脫10min,然後流動相B含量從20。/o提 高到40%，洗脫10min，後流動相B含量從40%到60%,洗脫25min，最後使流動相B含量 從60%到100%，洗脫10min，在洗脫的過程中保持總流速為lmL/min，柱溫為40 。C，可 以得到純度較高的骨橋蛋白OPN (圖2)，圖3、圖4給出了分離、純化OPN的色譜圖。
將純化後樣品OPN用胰蛋白酶在溫和條件下進行酶解，採用"Bottom Up"並結合HPLC等化學方法，利用FT-ICR-MS串聯質譜(MS/MS或MS")，母離子的活化採取碰撞激發解 離(CAD)和電子捕獲誘導解離(ECD)的方式，根據多肽碎片命名規則(圖5)以及CAD 的C-N肽鍵斷裂和ECD的N-Ca斷裂在裂解機理上的互補性(圖6)，鑑定了OPN蛋白中 有代表性的雙電荷分子離子峰為483.2570的多肽GDSVVYGLR片段(圖7)和雙電荷分子 離子峰為655.3816的多肽QNLLAPQTLPSK片段(圖8)。而且，多肽GDSVVYGLR片段 和多肽QNLLAPQTLPSK片段與標準譜庫匹配率(Score)分別為69禾B 101。藉助先進的 Mascot軟體資料庫進行質譜分析，MS/MS串聯質譜顯示，平均分子量為964.4977的單電荷 中性多肽片段GDSVVYGLR，與平均分子量為964.4998 (483.2572, 2+)多肽片段 GDSVVYGLR的匹配分子離子相對照，相對偏差為0ppm，平均分子量為1308.7401的單電 荷中性多肽片段QNLLAPQTLPSK,與平均分子量為1310.7632 (655.3816， 2+)多肽片段 QNLLAPQTLPSK的匹配分子離子相對照，相對偏差為4ppm (圖9)，充分證明了高分辨質 譜的準確性充分驗證了高分辨質譜的準確性，從而驗證了 OPN蛋白鑑定的可信度。
本發明的有益效果利用FT-ICR-MS並結合HPLC等化學方法，摸索出最佳的色譜分離 條件，步驟簡單，不需藉助親和層析特有的層析試劑複雜的吸附、解析過程，可以成倍縮短 時間，快速地分離、純化人乳樣品中的OPN， 1L人乳樣品中可得到10mg純度在95。/。以上的 OPN。藉助Mascot軟體資料庫進行質譜分析，可以簡潔、準確地獲得相關多肽片段的結構信 息，從而進一歩鑑定OPN。隨著各種酶解方法的不斷改進，高分辨質譜配合HPLC分離、純 化OPN方法的進一歩成熟，必將為OPN多肽片段不同修飾位點與相關疾病的發病機理及研發 新的藥物提供理論依據。


圖l:分離與純化人乳的流程圖； 圖2:人乳乳清部分的純化流程圖3:人乳乳清部分SCX色譜柱的HPLC分離與純化色譜圖； 圖4: SCX5和SCX6組分C4色譜柱的HPLC分離與純化色譜圖； 圖5:多肽碎片命名規則示意圖； 圖6:多肽碎片互補裂解機理示意圖7: OPN中雙電荷分子離子峰為483.2570多肽GDSVVYGLR片段的FT-ICR-MS C AD譜圖8: OPN中雙電荷分子離子峰為483.2570多肽GDSVVYGLR片段的FT-ICR-MS ECD
譜圖9: OPN中雙電荷分子離子峰為655.3816多肽QNLLAPQTLPSK片段的FT-ICR-MSCAD譜圖10: OPN中雙電荷分子離子峰為655.3816多肽QNLLAPQTLPSK片段的FT-ICR-MS ECD譜圖ll:多肽片段GDSVVYGLR分子量準確度分析示意圖； 圖12: QNLLAPQTLPSK分子量準確度分析示意圖。
具體實施方式
實施例1:
從人乳中分離、純化骨橋蛋白(OPN)按以下步驟進行
(A) 將人乳樣品1L經高速離心分離，轉速需大於12000轉/分鐘，溫度控制在不超過 0°C，離心時間為30 45min;分離出乳脂(60mL)、乳清(920mL)和乳粒(20mL)，其中乳脂 在上層、乳粒在下層，OPN在中層的乳清部分中；
(B) 初步分離乳清部分用lmol/L硫酸調節至PH為4.6，沉澱，除去酪蛋白後，採用 高效液相色譜配有SCX色譜柱進行分離，流動相A( 20mmol/L檸檬酸、20mmol/L檸檬酸銨、 pH 3.0)和流動相B (20 mmol/L檸檬酸、20 mmol/L檸檬酸銨、0.5 mol/L NaCl、 pH3.0)進行 梯度洗脫，先100。/。A洗脫20min，然後流動相B含量從0%到10%洗脫10min,後再大幅 度使用流動相B含量從60%到100%洗脫10 min，在洗脫的過程中保持總流速為lmL/min， 柱溫為35 。C，得到八個組份(見圖1)，其中，SCX5 (50mL)、 SCX6 (40mL)組份含有
OPN;
(C) 進一步純化將SCX5、 SCX6組份合併，用高效液相色譜配有C4色譜柱對SCX5、 SCX6組份進行純化，流動相組成為A(0.1%TFA 、 99.9%水(v/v))禾卩B (0.1% TFA 、 9.9% 水與90%乙氰(v/v))，進行梯度洗脫，先100% A洗脫10 min,然後流動相B含量從20%提 高到40%，洗脫10min,後流動相B含量從40%到60%，洗脫25min，最後使流動相B含量 從60%到100%,洗脫10min，在洗脫的過程中保持總流速為lmL/min，柱溫為40 。C，得 到純度較高的骨橋蛋白OPN(10mg)(圖2)，圖3、圖4給出了分離、純化OPN的色譜圖。
本專利採用"Bottom Up"和配有Nano-spray技術的高分辨FT-ICR-MS等化學方法，將純化 後樣品OPN利用胰蛋白酶在溫和條件下進行酶解，利用FT-ICR-MS並藉助先進的Mascot軟體 資料庫將所獲得的質譜圖進行分析，得到了其相關多肽片段的質譜結構信息。根據多肽碎片 命名規則(圖5)以及CAD的C-N肽鍵斷裂和ECD的N-Ca斷裂在裂解機理上的互補性(圖6)， 鑑定了OPN蛋白中有代表性的雙電荷分子離子峰為483.2570的多肽GDSVVYGLR片段(圖7) 和雙電荷分子離子峰為655.3816的多肽QNLLAPQTLPSK片段(圖8)。而且，多肽 GDSVVYGLR片段和多肽QNLLAPQTLPSK片段與標準譜庫匹配率(Score)分別為69和101。藉助先進的Mascot軟體資料庫進行質譜分析，MS/MS串聯質譜顯示，平均分子量為964.4977 的單電荷中性多肽片段GDSVVYGLR，與平均分子量為964.4998 (483.2572， 2+)多肽片段 GDSVVYGLR的匹配分子離子相對照，相對偏差為0ppm。平均分子量為1308.7401的單電荷 中性多肽片段QNLLAPQTLPSK，與平均分子量為1310.7632 (655.3816， 2+)多肽片段 QNLLAPQTLPSK的匹配分子離子相對照，相對偏差為4ppm (圖9)，充分說明了高分辨質譜 的準確性，也驗證了OPN蛋白鑑定的可信度。
權利要求
1.一種從人乳中分離、純化骨橋蛋白(OPN)的方法，其特徵是按以下步驟進行(A)將人乳樣品經高速離心分離，轉速需大於12000轉/分鐘，溫度控制在不超過0℃，離心時間為30～45min，分離出乳脂、乳清和乳粒，其中乳脂在上層、乳粒在下層，OPN在中層的乳清部分中；(B)初步分離乳清部分用1mol/L硫酸調節至PH為4.6，沉澱，除去酪蛋白後，採用高效液相色譜配有SCX色譜柱進行分離，流動相A為20mmol/L檸檬酸、20mmol/L檸檬酸銨、pH 3.0和流動相B為20mmol/L檸檬酸、20mmol/L檸檬酸銨、0.5mol/LNaCl、pH3.0，進行梯度洗脫，先100％A洗脫20min，然後流動相B含量從0％到10％洗脫10min後，再大幅度使用流動相B含量從60％到100％洗脫10min，在洗脫的過程中保持總流速為1mL/min，柱溫為35℃，分離得到八個組份見圖1，其中，SCX5、SCX6組份含有OPN；(C)進一步純化將SCX5、SCX6組份合併，用高效液相色譜配有C4色譜柱對SCX5、SCX6組份進行純化，流動相組成為A為0.1％TFA、99.9％水(v/v)和B為0.1％TFA、9.9％水與90％乙氰(v/v)，進行梯度洗脫，先100％A洗脫10min，然後流動相B含量從20％提高到40％，洗脫10min後，流動相B含量從40％到60％，洗脫25min，最後使流動相B含量從60％到100％，洗脫10min，在洗脫的過程中保持總流速為1mL/min，柱溫為40℃，可以得到純度較高的骨橋蛋白OPN。
全文摘要
本發明提供了一種從人乳中分離、純化骨橋蛋白(OPN)的方法。該方法先從人乳樣品經高速離心分離出含OPN的乳清，然後採用高效液相色譜配有SCX色譜柱進行初步梯度分離，得到含有OPN的SCX5、SCX6組份，該二組份在C4色譜柱上進一步純化，最後可以得到純度較高的骨橋蛋白OPN。使用該方法，步驟簡單、快速省時、所用試劑種類少、成本較低。
文檔編號C07K1/00GK101638428SQ200810051738
公開日2010年2月3日 申請日期2008年12月30日 優先權日2008年12月30日
發明者雷 於, 劉曉梅, 韶 王, 磊 石, 舸 程, 蔣鑫萍 申請人:吉林大學