分泌性蛋白質的製作方法

2023-08-03 07:10:16

專利名稱：分泌性蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及新型蛋白質INSP037，它被本發明鑑定為一種分泌性蛋白質，特別是四螺旋束細胞因子摺疊的成員，優選是幹擾素-γ樣分子，以及涉及該蛋白質和來自編碼基因的核酸序列在診斷、預防和治療疾病中的應用。
本文所引用的出版物、專利和專利申請，均納入其全文作為參考。
背景技術：
目前，藥物發現方法正蘊釀著一場根本革命，因為功能基因組學年代已經來臨。術語「功能基因組學」應用於使用生物信息學工具將功能歸因於感興趣的蛋白質序列的方法。這些工具正日益顯示其必要性，因為序列數據產生的速度遠遠高於研究實驗室將功能劃分給這些蛋白質序列的能力。
隨著生物信息學工具的效力和準確性提高，這些工具正快速取代生物化學特性鑑定的常規技術。事實上，鑑定本發明所用的先進生物信息學工具現在能夠輸出可獲得較高置信度的結果。
各所研究院和商業機機正在檢查已有的序列數據，並且逐漸獲得重大發現。然而，仍然有必要鑑定和特性分析其他基因和它們編碼的多肽，作為研究和藥物發現的目標。
分泌性蛋白質的介紹細胞製造和分泌胞外蛋白質的能力是許多生物過程的中心。酶、生長因子、胞外基質蛋白和信號傳導分子全部由細胞分泌出來。這是分泌小泡與質膜融合所致。多數情況下，但不是所有情況，蛋白質被信號肽導入內質網，並進入分泌小泡。信號肽是順式作用序列，影響到多肽鏈從細胞質轉運至膜結合室如分泌小泡。靶向分泌小泡的多肽或者分泌進入胞內基質，或者留在質膜內。留在質膜內的多肽有一或多個跨膜結構域。在細胞機能中發揮中心作用的分泌性蛋白質的例子是細胞因子、激素、胞外基質蛋白(粘附分子)、蛋白酶及生長和分化因子。關於這些蛋白質的性質將於下文敘述。
細胞因子的介紹細胞因子是一族主要從白細胞分泌出來的生長因子，它們是信使蛋白質，在亞納摩爾濃度下用作能夠影響細胞過程的強力調節劑。白介素、神經營養素、生長因子、幹擾素和趨化因子全部定義為與細胞受體共同作用以調節細胞增殖和分化的細胞因子家族。它們的大小允許細胞因子在體內快速傳送，在需要的時間被降解。最近二十年，很多研究已經揭示它們具有控制較寬範圍的細胞功能，特別是控制免疫反應和細胞生長的作用(Boppana，S.B(1996)Indian.J.Pediatr.63(4)447-52)。細胞因子與其他生長因子一樣從典型激素中分化，這是基於它們是由多種不同細胞類型而非僅由一種特定組織或腺體產生，也能通過與位於靶細胞上具有親和力的受體相互作用來影響較寬範圍的細胞的事實。
所有細胞因子通信系統都顯示基因多效性(一個信使產生多種作用)和冗餘性(每種作用由一個以上信使產生)(Tringali，G.等，(2000)Therapie.55(1)171-5；Tessarollo，L.(1998)Cytokine Growth Factor Rev.9(2)125-137)。各個細胞因子對細胞的作用可依賴於其濃度、其他細胞因子的濃度、細胞因子的時間序列、以及該細胞的內在狀態(細胞周期、是否存在相鄰細胞、癌化)。
雖然細胞因子通常是小分子(200個胺基酸以下)蛋白質，但它們一般是從翻譯後剪接的大前體形成的。除了mRNA替換剪接通道之外，這也使每種細胞因子獲得範圍廣泛的變體，其中每一種的生物作用可以基本不同。現時也已分離出很多細胞因子的膜和胞外基相關形式(Okada-Ban，M.等(2000)Int.J.Biochem.Cell Biol.32(3)263-267；Atamas，S.P.(1997)Life Sci.61(12)1105-1112)。
細胞因子可組合成家族，即使大部分都是不相干的。因為序列相似性一般極低，所以分類通常基於二級結構組成。這些家族以原始膜命名，例如IFN樣、IL2樣、IL1樣、IL-6樣和TNF樣(Zlotnik，A.等，(2000)Immunity.12(2)121-127)。
研究顯示，細胞因子參與多細胞生物體體內的許多重要反應，例如免疫反應調節(Nishihira，J.(1998)Int.J.Mol.Med.2(1)17-28)、炎症(Kim，P.K.等，(2000)Surg.Clin.North.Am.80(3)885-894)、傷口癒合(Clark，R.A.(1991)J.Cell Biochem.46(1)1-2)、胚胎形成和發育以及細胞凋亡(Flad，H.D.等，(1999)Pathobiology.67(5-6)291-293)。致病生物體(病毒和細菌)，例如HIV和卡波西肉瘤相關性病毒，編碼抗細胞因子的因子和細胞因子類似物，以致它們可以與細胞因子受體相互作用，控制體內免疫反應(Sozzani，S.等，(2000)Pharm.Acta.Helv.74(2-3)305-312；Aoki，Y.等，(2000)J.Hematother.StemCell Res.9(2)137-145)。已經發現，病毒編碼的細胞因子、病毒因子是病毒因其能夠模擬和顛倒宿主免疫系統而具有致病性所必需的。
細胞因子可用於治療、預防和/或診斷醫學症狀和疾病，包括免疫疾病，例如自身免疫疾病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病、全身性紅斑狼瘡、和多發性硬化病，炎症疾病，例如過敏症、鼻炎、結膜炎、腎小球性腎炎、葡萄膜炎、克羅因病(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾病、胰腺炎、消化系統炎症、膿血症、內毒素性休克、膿毒性休克、惡病質、肌痛、強直性脊椎炎、重症肌無力、病毒後疲勞症候群、肺部疾病、呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道炎症、傷口癒合、子宮內膜異位、皮膚病、貝切特氏病(Behcet’s disease)，腫瘤，例如黑素瘤、肉瘤、腎腫瘤、結腸腫瘤，血液疾病、骨髓增生異常、何杰金氏病(Hodgkin′s disease)、骨質疏鬆症、肥胖、糖尿病、痛風、心血管疾病、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心衰竭、中風、肝病、愛滋病、愛滋病相關症候群、神經系統疾病、男性不孕症、衰老和感染，包括變形體感染、細菌感染和病毒感染，特別是人皰疹病毒5(細胞巨化病毒)感染。
業已顯示，病毒編碼的細胞因子，巨噬細胞抑制蛋白II能夠介導Th2型細胞的選擇性募集和免於細胞毒素免疫反應(Weber KS等，(2001)，Eur JImmunol.2001 31(8)2458-66)。這些數據是vMIP-II引導炎症細胞離開Th1型向Th2型反應募集，從而有利於免受細胞毒素反應的免疫調節作用的證據。所以，該蛋白質可用來調節涉及Th1型免疫反應過度刺激的疾病，例如腸道易激症候群。在另一項研究中，Kawamoto S等(Int Immunol.2001 13(5)685-94)給出vIL-10治療自身免疫糖尿病可能較細胞IL-10更好的結果。這些結果顯示，與單獨清除病毒的做法相比，病毒編碼的細胞因子可能在治療上有更好的有益效果。
細胞因子在臨床上的使用集中於它們作為免疫系統調節劑的作用(Rodriguez，F.H.等，(2000)Curr.Pharm.Des.6(6)665-680)，例如促進對甲狀腺癌症的反應(Schmutzler，C.等，(2000)143(1)15-24)。它們對細胞生長和分化的控制也令細胞因子成為抗癌目標(Lazar-Molnar，E.等，(2000)Cytokine.12(6)547-554；Gado，K.(2000)24(4)195-209)。還發現，細胞因子和細胞因子受體內的新突變在某些情形下賦予疾病抗性(van Deventer，S.J.等，(2000)Intensive Care Med.26(Suppl 1)S98S102)。為了調節活性和消除潛在的副作用而產生合成細胞因子(突變蛋白)是研究的重要方向(Shanafelt，A.B.等，(1998)95(16)9454-9458)。
如上所述，細胞因子分子已被發現在多種生理功能中發揮作用，其中很多在疾病過程中可能發揮作用。改變它們的活性是改變這些疾病表型的一種手段，同樣地，鑑定新型細胞因子分子有很密切的關係，因為它們在研究治療上述疾病及其他疾病狀態可有一定作用或得到應用。
幹擾素的介紹幹擾素是細胞因子四螺旋束家族的成員。根據其結構以及在酸介質中的穩定性將它們分為I型或II型。I型幹擾素按照它們的序列分為4組幹擾素-α(IFN-α)、幹擾素-β(IFN-β)、幹擾素-θ(IFN-θ)、幹擾素-τ(IFN-τ)。到目前為止，幹擾素-γ(IFN-γ)是唯一鑑定為II型的幹擾素，由活化T細胞和NK細胞產生。
I型幹擾素的基因聚集在人染色體9上。據估計，人體內至少有14個IFN-α非等位基因，天然存在的IFN-α蛋白質的數目通過IFN-α基因的等位基因形式獲得進一步增多(Jussain等，1996，J.Interferon Cytokine Res 16853-9)。
幹擾素通過與細胞表面特異性膜受體結合來發揮它們的細胞活性，如此地啟動胞內事件發生的複雜次序。I型幹擾素誘導各種各樣的生物反應，包括抗病毒、免疫調節和抗增生作用，這些作用的結果已經證實它們治療各種疾病和症狀是有效的。
幹擾素是強力的抗病毒試劑，特別是α幹擾素已被發現能用於治療各種病毒感染，包括人乳頭瘤病毒感染、B型肝炎和C型肝炎感染(Jaeckel等，2001，345(2)1452-7)。I型幹擾素還抑制細胞增殖，α幹擾素應用於臨床治療各種惡性病已經有多年，包括毛細胞白血病、多發性骨髓瘤、慢性淋巴細胞白血病、低度淋巴瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、慢性骨髓性白血病、腎細胞腫瘤和卵巢癌。另外，I型幹擾素能用於治療自身免疫疾病，而幹擾素-β已被證明可用於治療多發性硬化病。
幹擾素-τ最初在反芻動物的孕體勻漿中被鑑定出來，雖然它後來也在人體內被鑑定(參見WO96/35789)。儘管幹擾素-τ的許多活性與其他I型幹擾素相似，但它另有一些不同作用。具體地說，它具有促進妊娠形成和維持的抗黃體作用(Martal等，Reprod.Fertil Dev.，1997，9(3)355-80)。此外，幹擾素-α和幹擾素-β的病毒誘導是暫時的，持續數小時，而幹擾素-τ表達的病毒誘導可持續數天，並且已發現具有針對HIV-1的抗逆轉錄病毒作用(Dereuddre-Bosquet等，J.Acquir.Immune Defic Syndr.Hum.Retrovirol，1996，11(3)241-6)。
所以，屬於四螺旋束細胞因子家族成員的分泌性蛋白質已顯示在多個生理功能中發揮作用，其中有許多在疾病過程中發揮作用。具體地說，已經發現幹擾素在各種各樣的生理過程中發揮重要作用，其結果已被證實可用於治療範圍廣泛的疾病。然而，仍然有必要鑑定特別是能夠用於研製治療和預防疾病的新藥的新型分泌性蛋白質和新型幹擾素。

發明內容
本發明基於如下發現INSP037蛋白質是分泌性蛋白質，特別是四螺旋束細胞因子類成員。更具體地說，INSP037蛋白質是四螺旋束細胞因子摺疊的成員，優選是幹擾素-γ樣分子。
本發明第一方面的一實施例提供一種多肽，該多肽(i)包括SEQ ID NO36所示的胺基酸序列；(ii)是其具有分泌性蛋白質功能，特別是四螺旋束細胞因子功能，更好是幹擾素-γ樣功能，或者具有與(i)的多肽相同的抗原決定簇的片段；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等效物。
下文將具有SEQ ID NO36所示的序列的多肽稱為「INSP037多肽」。INSP037也稱為IPAAA44548。
優選地，本發明第一方面的INSP037多肽作為四螺旋束細胞因子摺疊的成員，最好作為幹擾素-γ樣分子運入。本發明第二方面提供一種編碼本發明第一方面的多肽的純化核酸分子。該純化核酸分子最好包括SEQ ID NO35所示的核酸序列(編碼INSP037多肽)。純化核酸分子最好由SEQ ID NO35所示的核酸序列組成(編碼INSP037多肽)，或者是該序列的一個冗餘等效物或片段。
術語「四螺旋束細胞因子組別的成員」在本領域已獲得很好的認知，本領域技術人員選用本領域公知的多種測定法之一，很容易能夠確定一種多肽是否作為該組別的成員運作。例如，通常以幹擾素對癌細胞的抗病毒活性或抗增殖活性來測定其活性。測定法的例子可參見Schiller J.H.，J Interferon Res1986；6(6)615-25和Gibson，U.E.等，J Immunol Methods(1989)20；125(1-2)105-13。
本發明第三方面提供一種在高度嚴謹條件下與本發明第二方面的核酸分子雜交的純化核酸分子。
本發明第四方面提供一種含有本發明第二或第三方面的核酸分子的載體，例如表達載體。本發明優選的載體包括pDEST14-IPAAA44548-6HIS(參見圖10)，PCRII-TOPO-IPAAA44548(參見圖11)，pDEST14-IPAAA44548-6HIS(參見圖12)和pEAK12D-IPAAA44548-6HIS(參見圖13)。
本發明第五方面提供一種用本發明第四方面的載體轉化的宿主細胞。
本發明第六方面提供一種配體，其特異性地結合，優選抑制本發明第一方面的多肽的分泌性蛋白質活性，更好是抑制本發明第一方面的多肽的四螺旋束細胞因子活性，最好是抑制本發明第一方面的多肽的幹擾素-γ樣活性。
本發明第七方面提供一種化合物，它能有效地改變編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者能調節本發明第一方面的多肽的活性。
本發明第七方面的化合物可增加(激動)或者減少(拮抗)基因的表達水平或多肽的活性。重要的是，對INSP037多肽功能的鑑定允許設計能夠鑑定有效地治療和/或診斷疾病的化合物的篩選方法。
本發明第八方面提供本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物在治療或診斷中的應用。這些分子還可用來製造治療細胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神經系統疾病、發育障礙、代謝性疾病、感染和其他病理病徵的藥物。具體地說，這些疾病可包括但不限於免疫疾病，例如自身免疫疾病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病、全身性紅斑狼瘡、和多發性硬化病，炎症疾病，例如過敏症、鼻炎、結膜炎、腎小球性腎炎、葡萄膜炎、克羅因病、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾病、胰腺炎、消化系統炎症、膿血症、內毒素性休克、膿毒性休克、惡病質、肌痛、強直性脊椎炎、重症肌無力、病毒後疲勞症候群、肺部疾病、呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道炎症、傷口癒合、子宮內膜異位、皮膚病、貝切特氏病，腫瘤，例如黑素瘤、肉瘤、腎腫瘤、結腸腫瘤，血液疾病、骨髓增生異常、何杰金氏病、骨質疏鬆症、肥胖、糖尿病、痛風、心血管疾病、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心衰竭、中風、肝病、愛滋病、愛滋病相關症候群、神經系統疾病、男性不孕症、衰老和感染，包括變形體感染、細菌感染和病毒感染，特別是人皰疹病毒5(細胞巨化病毒)感染。
本發明第九方面提供一種診斷患者疾病的方法，該方法包括評估所述患者組織中編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發明第一方面的多肽的活性，並將所述表達水平或者活性與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法最好在體外進行。可用類似方法監測對患者疾病的治療，其中多肽或核酸分子的表達水平或活性在一段時間內趨向於對照水平，表示該疾病獲得減緩。
檢測本發明第一方面的多肽的優選方法包括以下步驟(a)將本發明第六方面的一種配體，例如抗體，在適合形成配體-多肽複合物的條件下與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述複合物。
本領域的讀者將懂得，本發明第九方面的方法有很多種，例如，核酸與短探針雜交法、點突變分析法、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增法以及使用抗體檢測異常蛋白水平的方法。類似方法的使用可以是短期或長期，以治療患者被監測的疾病。本發明還提供一些用於這些方法中診斷疾病的試劑盒。
本發明第十方面提供本發明第一方面的多肽作為四螺旋束細胞因子摺疊的多肽成員，優選是幹擾素-γ樣分子的應用。
本發明第十一方面提供一種藥物組合物，該組合物含有本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物以及藥學上可接受的載體。
本發明第十二方面提供本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第五方面的宿主細胞，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物在製造診斷或治療疾病，例如細胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神經系統疾病、發育障礙、代謝性疾病、感染和其他病理病徵的藥物中的應用。具體地說，這些疾病包括但不限於免疫疾病，例如自身免疫疾病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病、全身性紅斑狼瘡、和多發性硬化病，炎症疾病，例如過敏症、鼻炎、結膜炎、腎小球性腎炎、葡萄膜炎、克羅因病、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾病、胰腺炎、消化系統炎症、膿血症、內毒素性休克、膿毒性休克、惡病質、肌痛、強直性脊椎炎、重症肌無力、病毒後疲勞症候群、肺部疾病、呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道炎症、傷口癒合、子宮內膜異位、皮膚病、貝切特氏病，腫瘤，例如黑素瘤、肉瘤、腎腫瘤、結腸腫瘤，血液疾病、骨髓增生異常、何杰金氏病、骨質疏鬆症、肥胖、糖尿病、痛風、心血管疾病、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心衰竭、中風、肝病、愛滋病、愛滋病相關症候群、神經系統疾病、男性不孕症、衰老和感染，包括變形體感染、細菌感染和病毒感染，特別是人皰疹病毒5(細胞巨化病毒)感染。
本發明第十三方面提供一種治療患者疾病的方法，該方法包括把本發明第一方面的多肽，或者本發明第二或第三方面的核酸分子，或者本發明第四方面的載體，或者本發明第六方面的配體，或者本發明第七方面的化合物給予該患者。
當與健康受試者中編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達水平或者本發明第一方面的多肽的活性相比，患病患者的該表達水平或活性較低的，給予該患者的多肽、核酸分子、配體或化合物應該是激動劑。相反，當與健康受試者中所述多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病患者的該表達水平或活性較高的，給予該患者的多肽、核酸分子、配體或化合物應該是拮抗劑。拮抗劑的例子包括反義核酸分子、核酶和配體，例如抗體。
本發明第十四方面提供轉基因或剔除非人動物，它們被轉化為表達更高水平、更低水平或缺乏本發明第一方面的多肽。這些轉基因動物是研究疾病極為有用的模型，也可用在鑑定有效治療或診斷該疾病的化合物的篩選方案中。
以下，給出為實施本發明而可採用的標準技術和步驟的概要。應明白，本發明並不限於所述的這些具體方法、方案、細胞系、載體和試劑。還應明白，本文所用的術語目的僅在於描述具體實施例，該術語不應該被看成為限定本發明的範圍。本發明的範圍只由所附權利要求書的術語限定。
本說明書中核苷酸和胺基酸使用標準縮寫。
除非另有指出，本發明的做法是採用分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學的常規技術，它們都已為本領域技術人員所掌握。
這些技術在有關文獻中已有詳細解釋。例如，可參考以下特別適用的文獻Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition(1989)；DNA Cloning，VolumesI and II(D.N Glover ed.1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames S.J.Higgins eds.1984)；Transcription and Translation(B.D.Hames S.J.Higginseds.1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney ed.1986)；Immobilized Cellsand Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide to MolecularCloning(1984)；the Methods in Enzymology series(Academic Press，Inc.)，especially volumes 154 155；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.1987，Academic Press，London)；Scopes，(1987)Protein PurificationPrinciplesand Practice，Second Edition(Springer Verlag，N.Y.)；Handbook of ExperimentalImmunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell eds.1986)。
本文所用的術語「多肽」包括含有相互間以肽鍵或修飾肽鍵即肽同構物(isostere)連接的兩個或以上胺基酸的任何肽或蛋白質。該術語指短鏈(肽和寡肽)和長鏈(蛋白質)。
本發明的多肽可以是成熟蛋白質形式，或者可以是前蛋白質，其可被前部分切割激活而產生活性成熟多肽。這些多肽中的前序列可以是先導序列或者分泌序列或者是用來純化成熟多肽序列的序列。
本發明第一方面的多肽可形成融合蛋白的一部分。例如，它一般適宜包括一或多個附加胺基酸序列，這些附加胺基酸序列可含有分泌序列或先導序列、前序列(pro-sequences)、有助純化的序列、或者例如在重組生產中賦予蛋白質更高穩定性的序列。另一個選擇或者另一方面是，成熟多肽可與另一種化合物，例如與延長該多肽半衰期的化合物(譬如聚乙二醇)融合。
除了20個基因編碼的胺基酸外，多肽還可含有由天然過程，例如翻譯後加工，或者由本領域公知的化學修飾技術修飾的胺基酸。在已知的修飾中，本發明的多肽通常帶有的修飾是糖基化、脂質附著、硫酸化、例如穀氨酸殘基的γ-羧酸化，羥基化和ADP-核糖基化。其他可能的修飾包括乙醯化、醯化、醯胺化、黃素的共價附著、血素分子的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質衍生物的共價附著、磷脂醯肌醇的共價附著、交聯、環化二硫鍵形成、脫甲基、共價交聯形成、半胱氨酸形成、焦穀氨酸鹽形成、甲醯化、GPI錨著形成、碘化、甲基化、豆蔻醯化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒醯化、轉移-RNA介導的蛋白質中插入胺基酸例如精氨醯化，以及遍在蛋白化。
修飾可發生於多肽的任何位置，包括肽骨架、胺基酸側鏈以及氨基或羧基末端。事實上，天然存在的肽和合成肽一般通過共價修飾封閉肽的氨基或羧基末端，或者封閉二者，這樣的修飾存在於本發明的多肽中。
發生在多肽內的修飾通常是如何製成該多肽的函數。對於重組製成的多肽，通過特定宿主細胞翻譯後修飾能力以及存在於所述多肽的氨基序列中的修飾信號來確定大部分修飾的性質和程度。例如，不同類型的宿主細胞之間糖基化型式是不同的。
本發明的多肽可以任何合適的方式製成。這些多肽包括分離的天然存在的多肽(例如自細胞培養基中純化而來)、重組產生的多肽(包括融合蛋白)、合成產生的多肽或者通過這些方法組合所產生的多肽。
本發明第一方面的功能等效多肽可以是與INSP037多肽同源的多肽。如果一個多肽的序列與另一個多肽的序列具有足夠高程度的同一性或相似性，本文就用術語「同源的」來形容該兩個多肽。「同一性」表示在對比序列的任何特定位置上，兩個序列之間的胺基酸殘基是相同的。「相似性」表示在對比序列的任何特定位置上，兩個序列的胺基酸殘基是相似的。同一性和相似性的程度不難計算(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing.Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysisof Sequence Data，Part1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
所以，同源多肽包括INSP037多肽的天然生物變體(例如，產生多肽的物種內等位基因變體或地理變體)和突變體(例如，含有胺基酸取代、插入或缺失的突變體)。這些突變體可包括其一或多個胺基酸殘基被保守性或非保守性胺基酸殘基(優選保守性胺基酸殘基)取代的多肽，這樣一個取代的胺基酸殘基可以或不必是遺傳密碼編碼的殘基。典型的取代是在Ala、Val、Leu和Ile之間；在Ser和Thr之間；在酸性殘基Asp和Glu之間；在Asn和Gln之間；在鹼性殘基Lys和Arg之間；或者在芳香族殘基Phe和Tyr之間。特別優選的是這樣一些變體有多個胺基酸，即5至10個胺基酸，1至5個胺基酸，1至3個胺基酸，1至2個胺基酸，或者僅有1個胺基酸以任意組合取代、缺失或插入的變體。特別優選的是不改變該蛋白質的性質和活性的沉默取代、插入和缺失。就此而言，特別優選的還有保守性取代。
這些突變體也包括其中一或多個胺基酸殘基包括一取代基團的多肽。
通常，兩個多肽之間的同一性大於80％，就認為它們在功能上是等效的。本發明第一方面的功能等效多肽與INSP037多肽，或其活性片段的序列同一性優選大於80％。更好的多肽分別具有大於90％、95％、98％或99％的同一性。
本發明第一方面的功能等效多肽還可以是已用一或多種結構對比技術鑑定的多肽。例如，可以應用Inpharmatica Genome Threader技術(它構成用於產生Biopendium檢索資料庫的檢索工具的其中一部分，參見共同待審批PCT專利申請PCT/GB01/01105)來鑑定現時具有未知功能的多肽，這些多肽雖然與INSP037多肽具有較低的序列同一性，但由於與INSP037多肽序列共享較高水平的結構同源性，故可預計它們有四螺旋束細胞因子活性，優選幹擾素-γ樣活性。「較高水平的結構同源性」指用Inpharmatica Genome Threader預測兩個蛋白質確定共享10％和以上的結構同源性。
本發明第一方面的多肽還包括INSP037多肽的片段、這些多肽的功能等效物的片段，只要那些片段保留了分泌性蛋白質的活性，優選四螺旋束細胞因子活性，更好是幹擾素-γ樣活性，或者帶有與這些多肽相同的抗原性決定簇。
本文所用的術語「片段」指胺基酸序列與INSP037多肽或它的其中一種功能等效物的部分而非全部胺基酸序列相同的多肽。這些片段應包括所述序列的至少n個保守性胺基酸，取決於特定的序列，n最好是7或以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或以上)。小片段可形成抗原性決定簇。
這些片段可以是「自力支持的(free-standing)」，即不是其他胺基酸或多肽的一部分，也不與其他胺基酸或多肽融合，或者它們可包含在它們構成其中一部分或區域的較大多肽之內。當包含在較大多肽之內時，本發明的片段最好構成單個連續區域。例如，一些優選實施例涉及一個片段，其具有與該片段的氨基末端融合的前多肽(pre-and/or pro-polypeptide region)區域，和/或具有與該片段的羧基末端融合的附加區域。然而，單一個較大多肽內可含有多個片段。
本發明的多肽或其免疫原性片段(包含至少一個抗原性決定簇)可被應用來產生對這些多肽有免疫特異性的配體，例如多克隆或單克隆抗體。這些抗體可用於分離或鑑定表達本發明的多肽的克隆，或者用於以親和力層析法純化這些多肽。抗體還可用來幫助診斷或治療，以及其他應用，這對本發領域讀者是顯而易見的。
術語「免疫特異性」指抗體對本發明的多肽的親和力遠遠大於它們對現有領域其他相關多肽的親和力。本文所用的術語「抗體」指能夠與所述抗原性決定簇結合的完整分子及其片段，例如Fab、F(ab′)2和Fv。所以，這些抗體與本發明第一方面的多肽結合。
如果需要多克隆抗體，可用本發明第一方面的多肽免疫一種選定哺乳動物，例如小鼠、兔、山羊或馬。用來免疫動物的多肽可通過重組DNA技術產生，或者可通過化學方法合成。有需要的時候，可將多肽與一載體蛋白質接合。通過化學方法與多肽偶聯的常用載體包括牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白和鑰孔血藍蛋白。然後，用偶聯的多肽來免疫動物。採集該免疫動物的血清，再按公知的程序，例如免疫親和力層析法加以處理。
本領域技術人員可輕易地生產針對本發明第一方面的多肽的單克隆抗體。應用雜交瘤技術生產單克隆抗體的一般方法已為人所公知(例如，參見Kohler，G.和Milstein，C.，Nature 256495-497(1975)；Kozbor等，ImmunologyToday 472(1983)；Cole等，77-96 in Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
可對針對本發明第一方面的多肽而生產的多系列單克隆抗體進行篩選，以測定它們的各種性質，即同種型、表位、親和力等。單克隆抗體在純化它們所針對的各種多肽是十分有用的。另一方面，編碼感興趣的單克隆抗體的基因可通過例如本領域公知的PCR技術在雜交瘤中分離出來，並可在適當載體中克隆和表達。
還可使用嵌合抗體，其中非人的可變區與人穩定區連接或融合(例如，參見Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，3439(1987))。
可對抗體進行修飾，例如通過使它人源化，以便在某一個體內的免疫原性減弱(參見ones等，Nature，321，522(1986)；Verhoeyen等，Science，239，1534(1988)；Kabat等，J.Immunol.，147，1709(1991)；Queen等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，86，10029(1989)；Gorman等，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88，34181(1991)；以及Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991))。本文所用的術語「人源化抗體」指非人供體抗體的重鏈和/或輕鏈可變區內CDR胺基酸和選定的其他胺基酸已經被人抗體的等效胺基酸所取代的抗體分子。所以，人源化抗體與人抗體極為相近，但具有與該供體抗體結合的能力。
另一個選擇是，抗體可以是「雙特異性」抗體，即它是一種有兩個不同抗原結合區的抗體，每一結合區針對不同表位。
可應用噬菌體展示技術選擇基因，所述基因編碼具有與本發明多肽結合的活性的抗體，它們來自篩選用來加工有關抗體的以PCR技術擴增的人淋巴細胞V基因的儲存庫，或者天然文庫(McCafferty，J.等，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，J.等，(1992)Biotechnology 10，779-783)。這些抗體的親和力也可通過鏈改組來加以改善(Clackson，T.等，(1991)Nature 352，624-628)。
以上述技術產生的多克隆抗體或單克隆抗體有額外應用，它們可用作免疫測定法、放射性免疫測定法(RIA)或者酶聯免疫吸附測定法(ELISA)中的試劑。在這些應用中，抗體可使用可分析檢測到的試劑，例如放射性同位素、螢光分子或酶來標記。
本發明第二和第三方面的優選核酸分子是編碼SEO ID NO36所示的多肽序列和功能等效多肽的那些分子。這些核酸分子可用於本文描述的方法和應用中。本發明的核酸分子最好含有至少n個本文所公開的序列中的連續核苷酸，取決於特定的序列，n是10或以上(例如，12、14、15、18、20、25、30、35、40或以上)。
本發明的核酸分子還包括上述核酸分子的補體序列(例如，用於反義或探測目的)。
本發明的核酸分子可以是RNA形式，如mRNA，或者是DNA形式，包括例如cDNA、合成DNA或基因組DNA。這樣一些核酸分子可通過克隆、化學合成技術或其組合獲得。例如，核酸分子可通過應用諸如固相亞磷醯胺化學合成從基因組或cDNA文庫化學合成，或者從生物體中分離而製備。
核酸分子可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA可以是編碼鏈，也稱有義鏈，或者它可以是非編碼鏈，也稱反義鏈。
術語「核酸分子」還包括DNA和RNA類似物，例如含有修飾骨架的那些類似物，以及肽核酸(PNA)。本文所用的術語「PNA」指含有長至少5個核苷酸的寡核苷酸的反義分子或反基因試劑，所述寡核苷酸與最好位於賴氨酸末端的胺基酸殘基肽骨架連接。該末端賴氨酸使組合物具有溶解性。PNA可被聚乙二醇化，延長它們在細胞內的停留時間，在細胞內它們優先與補體單鏈DNA和RNA結合，並終止轉錄延伸(Nielsen，P.E.等，(1993)AnticancerDrug Des.853-63)。
編碼SEQ ID NO36所示的多肽的核酸分子可與SEQ ID NO35所示的核酸分子的編碼序列相同。這些分子還可以有另一個不同序列，因為遺傳密碼簡併性，該不同序列編碼SEQ ID NO36所示的多肽。這樣一些核酸分子可包括，但不限於，成熟多肽自身的編碼序列；成熟多肽的編碼序列加上附加編碼序列，例如編碼先導或分泌序列(如前多肽序列)的序列；成熟多肽的編碼序列，加上或不加上前述附加編碼序列，再加上另外一些非編碼序列，包括非編碼5』和3』序列，例如在轉錄(包括終止信號)核糖體結合和mRNA穩定性中發揮作用的轉錄非翻譯序列。核酸分子還包括編碼附加胺基酸，例如提供附加功能的那些胺基酸的附加序列。
本發明第二和第三方面的核酸分子也可編碼本發明第一方面的多肽和片段的片段或功能等效物。這樣一種核酸分子可以是天然存在的變體，例如天然存在的等位基因變體，或者該分子可以是非天然存在的變體。核酸分子的非天然存在的變體可通過誘變技術製成，包括適用於核酸分子、細胞或生物體的那些技術。
就此而言，這些變體是通過核苷酸取代、缺失或插入而不同於上述核酸分子的變體。取代、缺失或插入可涉及一或多個核苷酸。變體可在編碼區或非編碼區或者二者內發生變化。編碼區內的變化可產生保守性或非保守性胺基酸取代、缺失或插入。
本發明的核酸分子也可以採用本領域公知的方法為多種原因而進行改造，這些原因包括修飾克隆、加工、和/或基因產物(多肽)的表達。可用來改造核苷酸序列的技術還包括應用隨機斷裂所作的DNA改組、基因片段和合成寡核苷酸的PCR重新裝配。可利用定點誘變插入新的限制位點，改變糖基化模式，修改密碼子偏向，產生剪接變體，引入突變等等。
編碼本發明第一方面的多肽的核酸分子可與異源序列連接，以致該組合核酸分子編碼融合蛋白。這樣一些組合核酸分子包括在本發明第二和第三方面之內。例如，要在肽庫中篩選抑制多肽活性的抑制劑，用這種組合核酸分子表達可被市售抗體識別的融合蛋白是有用的。融合蛋白還可被改造成含有位於本發明多肽的序列與異源蛋白質的序列之間的切割位點，以致該多肽可被切割，並從該異源蛋白質中純化出來。
本發明的核酸分子還包括一些反義分子，它們與編碼本發明的多肽的核酸分子部分互補，因而與編碼核酸分子雜交。如本領域普通技術人員所知，這些反義分子，例如寡核苷酸，可設計成識別、特異性地結合以及防止編碼本發明多肽的靶核酸的轉錄(例如，參見Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem.56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem56，560(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney等，Science241，456(1988)；Dervan等，Science 251，1360(1991))。
本文所用的術語「雜交」指兩個核酸分子通過氫鍵相互締合。通常，將一個分子固定於固相支持物上，而另一個分子在溶液中游離。然後，在有利氫鍵合的條件下使兩個分子相互接觸。影響鍵合的因素包括溶劑的類型和體積；反應溫度；雜交時間；攪拌；封閉液相分子與固相支持物非特異性附著的試劑(Denhardt′s試劑或BLOTTO)；分子的濃度；提高分子締合率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；雜交後洗滌條件的嚴謹程度(參見上述文獻Sambrook等)。
應用本領域公知的雜交測定法(例如，參見上述文獻Sambrook等)，可檢查一個完全互補分子與靶分子雜交的抑制。遵照Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987；Methods Enzymol.152399-407)以及Kimmel，A.R.(1987；MethodsEnzymol.152507-511)的教導，在不同嚴謹程度的條件下，使基本上同源的分子競爭並抑制完全同源的分子與靶分子的結合。
「嚴謹程度」指在雜交反應中與不同分子締合相比，有利於極度相似的分子締合的條件。高度嚴謹雜交條件定義為42℃下在一溶液中培養過夜，該溶液含有50％甲醯胺、5XSSC(150mM氯化鈉，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升變性剪切鮭魚精子DNA，然後，約65℃下在0.1X SSC中洗滌過濾器。低度嚴謹條件涉及在35℃下進行的雜交反應(參見上述文獻Sambrook等)。雜交使用的優選條件是高度嚴謹雜交條件。
本發明該方面的優選例子是其全長至少有70％與編碼INSP037多肽(SEQID NO36)的核酸分子相同的核酸分子以及基本上與這些核酸分子互補的核酸分子。本發明該方面的優選核酸分子含有一區域，該區域的全長至少有80％與具有SEQ ID NO35產生的序列的核酸分子相同，或者一個互補核酸分子。就此而言，特別優選的是其全長至少有90％，優選至少95％，更好至少98％或99％與所述核酸分子相同的核酸分子。優選的例子是編碼基本上保留與INSP037多肽相同的生物功能或活性的多肽的核酸分子。
本發明還提供一種檢測本發明核酸分子的方法，該方法包括以下步驟(a)在雜交條件下將本發明的核酸探針與生物樣品接觸，形成雙鏈體；以及(b)檢測所形成的任何雙鏈體。
下文另外討論關於本發明可採用的測定法，上述的核酸分子可用作RNA、cDNA或基因組DNA的雜交探針，分離編碼INSP037多肽的全長cDNA和基因組克隆，以及分離與編碼該多肽的基因有高度同一性的同源或直向同源基因的cDNA和基因組克隆。
在這點上，以下技術已為本領域技術人員所知和使用，為了舉例說明目的下面對這些技術進行討論。DNA的測序和分析方法已為人公知，在本領域中可以找得到，事實上可用來實施此處討論的很多本發明實施例。這些方法可使用酶，例如DNA聚合酶I的克列諾片段測序酶(US Biochemical Corp，Cleveland，OH)、Taq聚合酶(Perkin Elmer)、耐熱T7聚合酶(Amersham，Chicago，IL)或者這些酶的組合，以及校讀外切核酸酶，例如Gibco/BRL(Gaithersburg，MD)出售的ELONGASE擴增系統中找到的那些外切核酸酶。優選的測序方法可應用Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton，Reno，NV)、PeltierThermal Cycler (PTC200；MJ Research，Watertown，MA)和ABI催化劑以及373和377 DNA測序儀(Perkin Elmer)等儀器進行自動操作。
一種分離編碼具有與INSP037多肽相同功能的多肽的核酸分子的方法是按照本領域公認的標準程序用天然或人工設計的探針探測基因組或cDNA文庫(例如，參見″Current Protocols in Molecular Biology″，Ausubel等(eds)，GreenePublishing Association and John Wiley Interscience，New York，1989，1992)。特別有用的探針是這樣的探針含有至少15個，優選至少30個，更好是至少50個鄰接鹼基，這些鹼基對應於，或者與適當的編碼基因(SEQ ID NO35)的核酸序列互補。這樣探針可使用可分析檢測到的試劑標記，方便鑑定。有用的試劑包括，但不限於，放射性同位素、螢光染料和能夠催化待檢測產物形成的酶。有了這些探針，本領域普通技術人員就能夠從人、哺乳動物或其他動物來源中分離出感興趣的基因組DNA、cDNA或RNA聚核苷酸編碼蛋白質的互補拷貝，並在這些來源中篩選出有關序列，例如該家族、類型和/或亞型的額外成員。
多數情況下，分離的cDNA序列是不完整的，因為編碼多肽的區域通常在5』端被截短。現時有一些方法可獲得全長cDNA，或者將短cDNA延長。應用部分核苷酸序列和本領域公知的方法檢測上遊序列，例如啟動子和調控元件，可將這些序列延長。例如，可採用的一種方法是基於快速擴增cDNA末端的方法(RACE；例如參見Frohman等，PNAS USA 85，8998-9002，1988)。最近，MarathonTM technology(Clontech Laboratories Inc.)對這種技術進行了改進，例如使較長cDNA的檢索大大簡化。另一種稍稍不同的技術稱為「限制位點」PCR，它使用通用探針檢索鄰接一已知基因座的未知核酸序列(Sarkar，G.(1993)PCR Methods Applic.2318-322)。以基於已知區域的趨異性引物，也可用反向PCR來擴增或延長序列(Triglia，T.等，(1988)NucleicAcids Res.168186)。捕捉PCR是可使用的另一種方法，它涉及通過PCR技術擴增鄰接人和酵母人工染色體DNA中已知序列的DNA片段(Lagerstrom，M.等，(1991)PCR Methods Applic.，1，111-119)。可用來檢索未知序列的另一種方法是Parker，J.D.等描述的方法(1991，Nucleic AcidsRes.193055-3060)。另外，人們可使用PCR、嵌套引物和PromoterFinderTM文庫來查看基因組DNA(Clontech，Palo Alto，CA)。這種方法不用篩選文庫，可用於尋找內含子/外顯子接合。
當篩選全長cDNA時，最好用已經按大小進行選擇包含了較大cDNA的文庫。優選的還有隨機引物文庫，因為它們含有較多含基因5』區的序列。對於寡d(T)文庫不能產生全長cDNA的情形，最好使用隨機引物文庫。基因組文庫可用來將序列延伸進入5』非轉錄調控區。
在本發明一實施例中，本發明的核酸分子可用來進行染色體定位。在這一技術中，核酸分子特異性靶向，並能與單個人染色體的特定位置雜交。對本發明染色體的相關序列作圖譜，是確認那些序列與基因相關性疾病相互關係的重要步驟。一旦將序列與準確染色體位置在圖譜反映出來，就可以將染色體上序列的物理位置與基因圖譜數據關聯起來。這些數據例如可以在人類孟德爾遺傳學資料庫中找到(Johns Hopkins大學韋爾奇醫學庫在線提供)。然後，通過連鎖分析(物理相鄰基因的共同繼承)確定基因與定位在同一個染色體區的疾病之間的關係。這為研究人員用定位克隆或其他基因發現技術檢索疾病基因提供了有價值的信息。一旦通過遺傳連鎖粗略確定了疾病或症候群位於特定基因組區，定位在該區域的任何序列代表相關或調控基因，可作進一步研究。核酸分子還可用來檢測由於正常、載體或染病個體之間移位、反轉等造成染色體位置的差異。
本發明的核酸分子對於組織定位也是有價值的。這些技術通過檢測編碼多肽的mRNA可以確定該多肽在組織中表達模式。這些技術包括原位雜交技術和核苷酸擴增技術，例如PCR。從研究中獲得的結果可知道生物體中多肽的正常功能。另外，mRNA的正常表達模式與突變基因編碼的mRNA的正常表達模式之間的比較研究為理解突變多肽在疾病中的作用提供了有價值的認知。不適當表達可以是時間、空間或量化。
可採取基因沉默方法使編碼本發明多肽的基因內源表達下調。RNA幹擾(Elbashir，SM等，Nature 2001，411，494-498)是可用來使序列特異性翻譯後基因沉默的一種方法。短dsRNA寡核苷酸在體外合成，並導入細胞中。這些dsRNA寡核苷酸的序列特異性結合引發靶mRNA降解，從而減少或消除蛋白質表達。
評估上述基因沉默方法的功效可用TaqMan方法在RNA水平上測量多肽的表達(例如，Western印跡)。
本發明的載體包含本發明的核酸分子，可以是克隆或表達載體。本發明的宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，它們可用本發明的載體轉化、轉染或轉導。
本發明的多肽的製備可以重組形式在宿主細胞所含的載體內表達它們的編碼核酸分子。這些表達方法已為本領域技術人員公知，很多方法在上述文獻Sambrook和Fernandez與Hoeffler的書(1998，eds.″Gene expressionsystems，Using nature for the art of expression″.Academic Press，San Diego，London，Boston，New York，Sydney，Tokyo，Toronto)中已有描述。
一般而言，可使用適合維持、繁殖或表達核酸分子在一所需宿主內產生多肽的任何系統或載體。應用各種公知的常規技術，例如上述文獻Sambrook中描述的技術，可將適當的核苷酸序列插入一表達系統中。通常，可使編碼基因受控於調控元件，例如啟動子、核糖體結合位點(對於細菌表達)，任選地是操縱子，以便將編碼所希望的多肽的DNA序列轉錄至轉化宿主細胞的RNA內。
例如，適當的表達系統的例子包括染色體系統、附加體系統和病毒衍生系統，包括例如衍生自以下物質的載體細菌質粒、噬菌體、轉位子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、病毒，例如杆狀病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆轉錄病毒，或者其組合，例如從質粒和噬菌體遺傳因子所產生的載體，包括粘粒和噬菌粒。人的人工染色體(HACs)也可用來輸送在質粒中所含和表達的較大DNA片段。
特別適合的表達系統包括微生物，例如用重組噬菌體、質粒或粘粒DNA表達系統轉化的細菌；用酵母表達載體轉化的酵母；用病毒表達載體(例如杆狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；用病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒CaMV；菸草花葉病毒TMV)或者用細胞表達載體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統；或者動物細胞系統。無細胞翻譯系統也可用來產生本發明的多肽。
參照許多標準實驗手冊，例如Davis等(Basic Methods in MolecularBiology(1986))和上述文獻Sambrook等中描述的方法，可將編碼本發明的多肽的核酸分子導入宿主細胞內。特別適合的方法包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、轉位、微量注射、陽離子質粒介導的轉染、電穿孔、轉導、劃痕加載、彈導導入或感染(參見上述文獻Sambrook等，1989；Ausubel等，1991；Spector，Goldman Leinwald，1998)。在真核細胞中，表達系統可以是暫時的(例如附加體)或者永久的(染色體整合)，取決於該系統的需要。
編碼核酸分子可以包括或不包括編碼調控序列，例如信號肽或先導序列的序列，的序列，有需要的時候，例如將翻譯的多肽分泌到內質網腔、胞質間隙或胞外環境中。這些信號可以與該多肽內源，或者它們可以是異源信號。先導序列可在翻譯後加工中被細菌宿主除去。
除了調控序列之後，希望可以加入能調節相對於宿主細胞生長的多肽表達的調節序列。調節序列的例子是可引致基因的表達對化學和物理刺激，包括調節化合物的存在，或者對各種溫度或代謝條件的應答增大或減少的序列。調節序列是載體的那些非翻譯區，例如增強子、啟動子以及5』和3』非翻譯區。它們與宿主細胞蛋白質相互作用，進行轉錄和翻譯。這些調節序列的強度和特異性可以是不同的。取決於所用的載體系統和宿主，可使用任何數量的適當轉錄和翻譯元件，包括組成型和誘導型啟動子。例如在細菌系統內克隆時，可使用誘導型啟動子，例如Bluescript噬菌粒的雜交lacZ啟動子(Stratagene，LaJolla，CA)或pSportlTM質粒(Gibco BRL)等等。在昆蟲細胞內可用杆狀病毒多角體蛋白啟動子。由植物細胞基因組(例如，熱激、RUBISCO和貯藏蛋白基因)或者植物病毒(例如，病毒啟動子或先導序列)衍生而來的啟動子或增強子可克隆到載體中。哺乳動物細胞系統優選使用哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。如果需要產生含有序列的多個拷貝的細胞系，可使用基於SV40或EBV的載體和一適當選擇性標記物。
構建一個表達載體，用適當的調節序列可以使特定核酸編碼序列位於該載體內，編碼序列相對於調節序列的定位和方向使得該編碼序列在該調節序列的「控制」下轉錄，即與DNA分子結合的RNA聚合酶在調控序列下轉錄該編碼序列。在一些情況下，有需要將序列修飾成它可以適當方向附著於調控序列，即維持讀框。
調控序列和其他調節序列可在插入載體之前先連接到核酸編碼碼序列。另一個選擇是，直接將編碼序列克隆到已經含有調控序列和適當限制位點的表達載體中。
對於長時間高得率地生產重組多肽，最好有穩定的表達。例如，穩定地表達感興趣的多肽的細胞系可以用含有病毒來源複製的表達載體和/或同一個或不同載體上的內源性表達元件和選擇性基因轉化。導入載體之後，允許細胞先在富集培養基中生長1-2天，再轉移到選擇培養基中。選擇性標記物的目的是針對選擇帶來抗性，它的存在可以使成功表達導入序列的細胞生長和恢復。穩定轉化的細胞的抗性克隆可應用適合細胞類型的組織培養技術進行增殖。
作為表達宿主可供使用的哺乳動物細胞系已為本領域技術人員公知，包括美國典型菌種保藏中心(ATCC)的許多無限增殖化細胞系，包括但不限於，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎(COS)細胞、C127細胞、3T3細胞、BHK細胞、HEK293細胞、Bowes黑色素瘤細胞和人肝細胞癌(例如Hep G2)細胞以及其他許多細胞系。
杆狀病毒系統中，用於杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統的物質，在市場上以試劑盒形式提供，可以購自inter alia、Invitrogen、San Diego CA(「MaxBac」試劑盒)。這些技術對本領域技術人員而言是眾所周知的，在Summers和Smith的文章(Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987))中也有所描述。特別適合該系統使用的宿主細胞包括昆蟲細胞，例如果蠅S2細胞和草地夜蛾Sf9細胞。
本領域已經知道很多植物細胞培養基和全植物遺傳表達系統。合適的植物細胞遺傳表達系統的例子包括美國專利US 5,693,506；US 5,659,122；和US 5,608,143中描述的系統。植物細胞培養基的遺傳表達的另外一些例子在Zenk，Phytochemistry 30，3861-3863(1991)中已有描述。
具體地說，可使用原生質體被分離和培養得到全再生植物的所有植物，以致回收到的全植物含有轉移基因。特別是所有植物可從培養細胞或組織中再生，包括但不限於甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果和其他樹木、豆類和蔬菜的所有主要種屬。
特別優選的細菌宿主細胞的例子包括鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈黴菌和枯草芽孢桿菌細胞。
特別適合真菌表達的宿主細胞的例子包括酵母細胞(例如釀酒酵母)和麴黴菌細胞。
本領域已經知道許多選擇系統，它們都可用來回收轉化細胞系。例如，單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Wigler，M.等，(1977)Cell 11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy，I.等，(1980)Cell 22817-23)基因可分別用在tk-或aprt±細胞中。
另外，選擇的基礎可以是抗代謝物、抗生素或除草劑抗性；例如，二氫葉酸還原酶(DHFR)賦予氨甲蝶呤抗性(Wigler，M.等，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt賦予氨基糖苷新黴素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等，(1981)J.Mol.Biol.1501-14)，als或pat分別賦予綠黃隆和草丁膦乙醯轉移酶抗性。此外，還描述了其他選擇性基因，它們的例子為本領域技術人員所知。
雖然標記基因表達存在或不存在提示感興趣的基因也是存在的，但它的存在和表達有待確認。例如，如果在一標記基因序列中插入相關的基因，以不存在標記基因功能可確定含有適當序列的轉化細胞。另一個選擇是，在單個啟動子控制下將標記基因與編碼本發明的多肽的序列串聯放置。標記基因應答誘導和選擇的表達通常也表示串聯基因的表達。
另外，含有編碼本發明的多肽的核酸序列，並表達所述多肽的宿主細胞可通過本領域技術人員公知的各種程序進行鑑定。這些程序包括但不限於DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白質生物分析，例如，螢光激活細胞分類術(FACS)或免疫測定技術(例如，酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和放射性免疫測定法(RIA))，包括用來檢測和/或定量分析核酸或蛋白質的膜、溶液或晶片技術(參見Hampton，R.等，(1990)Serological Methods，a Laboratory Manual，APS Press，St Paul，MN和Maddox，D.E.等，(1983)J.Exp.Med，158，1211-1216)。
本領域技術人員公知的各種各樣標記和連接技術可用在不同的核酸和胺基酸測定法中。產生標記雜交的裝置或檢測與編碼本發明的多肽的核酸分子有關的序列的PCR探針包括，寡標記、鎳翻譯、末端標記或使用標記聚核苷酸的PCR擴增。另外，也可將編碼本發明的多肽的序列克隆到載體內，以產生mRNA探針。這些載體是本領域公知的，可通過商業途徑獲得，加入諸如T7、T3或SP6等適當RNA聚合酶和標記核苷酸可在體外合成RNA探針。這些步驟使用市場上供應的各種試劑盒(Pharmacia Upjohn，(Kalamazoo，MI)；Promega(Madison WI)；和U.S.Biochemical Corp.，Cleveland，OH))進行。
可用易於檢測的合適報導分子或標記包括放射性核、酶和螢光、化學發光或發色試劑和物質、協同因子、抑制劑、磁性粒子等等。
本發明的核酸分子還可用來製造轉基因動物，特別是齧齒動物。這些轉基因動物構成本發明的另一方面。這可通過局部修飾體細胞，或者通過種系治療引入遺傳修飾來實現。這些轉基因動物特別適用於製作動物模型，分析作為本發明多肽的調節劑的藥物分子。
從重組細胞培養基中回收和純化多肽的方法是公知的，包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陽離子或陰離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水基相互作用層析法、親和力層析法、羥磷灰石層析法和血凝素層析法。高效液相層析法特別適用於純化。當分離和/或純化期間多肽發生變性時，可應用蛋白質再摺疊的公知技術來再產生活性構造。
也可利用特異性載體結構來幫助蛋白質純化，有需要的時候，將編碼本發明的多肽的序列與編碼有利於可溶性蛋白質純化的多肽結構域的核酸序列連接。有利於純化的結構域的例子包括金屬螯合肽，例如允許在固定金屬上純化的肌氨酸-色氨酸組件，允許在固定免疫球蛋白上純化的蛋白A結構域，以及用在FLAGS延伸/親和純化系統(Immunex Corp.，Seattle，WA)中的結構域。在純化結構域與本發明的多肽之間包含可切割的接頭序列，例如對XA因子或腸激酶有特異性的序列，有利於純化。一種這樣的表達載體為融合蛋白的表達提供準備，該融合蛋白含有本發明的多肽，與硫氧還蛋白或腸激酶切割位點前面的多個肌氨酸殘基融合。肌氨酸殘基有利於固定金屬離子親和力層析法(IMAC)的純化，參見Porath，J.等的描述(Prot.Exp.Purif.3263-281，(1992))，而硫氧還蛋白或腸激酶切割位點為在融合蛋白中純化多肽提供了手段(Kroll，D.J.等，1993；DNA Cell Biol.12441-453)。
如果多肽的表達是用在篩選測定中，通常最好是在它表達的宿主細胞表面上產生該多肽。在此情況下，宿主細胞可於篩選測定使用之前例如用螢光激活細胞分類術(FACS)或免疫測定技術收穫。如果多肽分泌到培養基中，可回收該培養基以便回收和純化表達多肽。如果多肽是在細胞內產生，則回收多肽之前必須先溶解細胞。
本發明的多肽可用來篩選各種藥物篩選技術使用的化合物庫。這些化合物可以激活(激動)或抑制(拮抗)本發明多肽的基因的表達水平或活性，構成本發明的另一方面。優選的化合物是能有效地改變編碼本發明第一方面的多肽的天然基因的表達，或者調節本發明第一方面的多肽的活性。
激動劑或拮抗劑化合物可從，例如，細胞製劑、無細胞製劑、化學庫或天然混合產物中分離出來。這些激動劑或拮抗劑可以是天然的或者是經修飾的物質、配體、酶、受體或者結構或功能類似物。關於這些篩選技術的綜述，可參見Coligan等，Current Protocols in Immunology1(2)Chapter 5(1991)。
最有可能成為良好拮抗劑的化合物是與本發明的多肽結合但在結合後又不會誘導該多肽生物作用的分子。潛在的拮抗劑包括有機小分子、肽、多肽和抗體，它們與本發明的多肽結合，從而抑制或消除它的活性。以這種方式，多肽與正常細胞結合分子的結合可被抑制，從而抑制該多肽的正常生物活性。
用在此篩選技術中的本發明的多肽可以在溶液中游離，附著於固相支持物上，留在細胞表面或位於細胞內。一般而言，這些篩選程序可涉及使用表達與測試化合物接觸的多肽的適當細胞或細胞膜，觀察結合，或功能反應的刺激或抑制。再將與測試化合物接觸的細胞和不接觸測試化合物的對照細胞的功能反應作比較。藉助適當檢測系統，這種測定方法可以評估測試化合物是否導致多肽激活產生一個信號。一般情況下，在已知激動劑的存在下分析激活的抑制劑，在測試化合物存在下觀察激活對激動劑的影響。
一種鑑定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優選方法包括(a)在允許與多肽結合的條件下將在其表面上表達本發明第一方面的多肽的該細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結合之後提供可檢測信號的第二成分締合。
(b)通過測定化合物與多肽相互作用所產生的信號水平來確定該化合物是否結合和激活或抑制該多肽。
另一種鑑定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑化合物的優選方法包括(a)在允許與多肽結合的條件下將在其表面上表達本發明第一方面的多肽的該細胞與待篩選化合物接觸，所述的多肽與能夠在化合物與該多肽結合之後提供可檢測信號的第二成分締合。
(b)通過對化合物與多肽相互作用所產生的信號水平與在該化合物不存在下的信號水平作比較來確定該化合物是否結合和激活或抑制該多肽。
在另一優選實施例中，上述的通用方法還包括在多肽的標記或無標記配體存在下對激動劑或拮抗劑進行鑑定。
在另一實施例中，鑑定本發明的多肽的激動劑或拮抗劑的方法包括在允許結合多肽的條件和候選化合物存在下，測定配體與其表面上帶有本發明的多肽的細胞、或者與含有這樣一種多肽的細胞膜結合的抑制，並測定與該多肽結合的配體數量。能夠引起配體結合減少的化合物就認為是激動劑或拮抗劑。配體最好是帶標記的。
更具體地說，篩選多肽拮抗劑或激動劑化合物的方法包括以下步驟(a)使標記的配體與在細胞表面上表達本發明的多肽的全細胞，或者含有本發明的多肽的細胞膜培養，(b)測定與全細胞或細胞膜結合的標記配體數量，(c)在步驟(a)的標記配體和全細胞或者細胞膜的混合物中加入候選化合物，使該混合物達到平衡；(d)測定步驟(c)之後與全細胞或細胞膜結合的標記配體數量；以及(e)比較步驟(b)和(d)中結合的標記配體之差值，將引起步驟(d)的結合減少的化合物看成激動劑或拮抗劑。
在上述測定法中發現多肽以劑量依賴方式調節各個生理和病理過程。所以，本發明的多肽的「功能等效物」包括在上述測定法中具有任何相同的劑量依賴方式調節活性的多肽。雖然劑量依賴活性的程度不必與本發明的多肽完全一樣，但「功能等效物」在給定的活性測定法中最好基本上具有與本發明的多肽相類似的劑量依賴關係。
上述一些實施例可應用簡單結合測定法，其中測試化合物與帶有多肽的表面的附著用直接或間與該測試化合物結合的標記檢測，或者可應用涉及與標記競爭物競爭的測定法檢測。另一個實施例採用競爭藥物篩選測定法，其中能夠結合多肽的中和抗體與測試化合物特異性地競爭結合。以此方式可用抗體檢測對多肽有特異性結合親和力的任何測試化合物的存在。
測定法也可設計成檢測加入的測試化合物對細胞內編碼多肽的mRNA產生的作用。例如，ELISA可構建成通過本領域公知的標準方法以單克隆抗體或多克隆抗體測量多肽的分泌或細胞相關水平，這可用來檢索可抑制或增強在適當操縱的細胞或組織中產生多肽的化合物。然後，測定多肽與測試化合物之間的結合複合物的形成。
本發明包括的測定法是在過表達或消除測定中涉及使用本發明的基因和多肽的方法。這些測定法涉及細胞內這些基因/多肽水平的操縱，以及該操縱事件對被操縱細胞生理的影響的評估。例如，這些實驗揭示與特定基因/多肽有關聯的信號傳導和代謝通道的詳細信息，產生關於與待研究多肽相互作用的多肽同一性的信息，並提供調節相關基因和蛋白質的方法的思路。
還可使用簡單結合測定法，其中測試化合物與帶有多肽的表面結合的附著用直接或間與該測試化合物結合的標記檢測，或者可應用涉及與標記競爭物競爭的測定法測定。另一個實施例採用競爭藥物篩選測定法，其中能夠結合多肽的中和抗體與測試化合物特異性地競爭結合。以此方式可用抗體檢測對多肽有特異性結合親和力的任何測試化合物的存在。
測定法也可設計成檢測加入的測試化合物對細胞內編碼多肽的mRNA產生的作用。例如，ELISA可構建成通過本領域公知的標準方法以單克隆抗體或多克隆抗體測量多肽的分泌或細胞相關水平，這可用來檢索可抑制或增強在適當操縱的細胞或組織中產生多肽的化合物。然後，測定多肽與測試化合物之間的結合複合物的形成。
可採用另一種藥物篩選技術，它提供高通量篩選對感興趣的多肽具有適當結合親和力的化合物(參見國際專利申請WO84/03564)。在這一方法中，在固相基質上合成大量不同的小測試化合物，它們再與本發明的多肽反應，洗滌。一種固定多肽的方法是用非中和抗體。以本領域公知的方法可檢測結合多肽。純化的多肽也可直接鋪在板上，用於上述藥物篩選技術中。
通過本領域公知的標準受體結合技術，例如配體結合和交聯測定法，本發明的多肽可用來鑑定膜結合或可溶性受體，在配體結合和交聯測定法中，多肽用放射性同位素標記，以化學方法修飾，或者與有利於它的檢測或純化的肽序列融合併與推定受體來源(例如，細胞組合物、細胞膜、細胞上清液、組織抽提物或體液)一起培育。結合的效率可用生物物理技術，如表面胞質基因共振和光譜測定。結合測定法用於純化和克隆受體，但也可鑑定多肽的激動劑和拮抗劑，這些激動劑和拮抗劑與其受體競爭給合該多肽。進行篩選測定的標準方法已為本領域所熟悉。
本發明還包括一種篩選試劑盒，它可用在鑑定上述的激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質、酶的方法中。
本發明包括激動劑、拮抗劑、配體、受體、基質和酶以及通過上述方法發現的能調節本發明的多肽的活性或抗原性的其他化合物。
本發明還提供一些藥物組合物，其含有本發明的多肽、核酸、配體或化合物，以及合適的藥物載體。這些組合物適合用作治療或診斷試劑、疫苗、或其他免疫原性組合物，下文將作詳細說明。
根據本文的術語，當組合物中以X+Y的總重量計時至少85％是X，認為含有多肽、核酸、配體或化合物[X]的組合物「基本上不含」雜質[本文以Y表示]。優選X佔組合物中X+Y總重量的至少約90％，更好至少約95％、98％或者甚至99％(重量)。
藥物組合物最好含有治療有效量的本發明的多肽、核酸分子、配體或化合物。本文所用的術語「治療有效量」指需要治療、減緩、或預防目標疾病或病徵，或者具有可檢測的治療或預防作用的治療藥劑的用量。任何一種化合物的有效治療劑量最初可在例如腫瘤細胞的細胞培養測定法、或者動物模型通常是小鼠、兔、狗、或豬模型中估計。動物模型還可用來確定適當的濃度範圍和給藥途徑。有了這些信息，就可以確定給予人的有用給藥劑量和途徑。
人受試者的準確有效劑量取決於疾病狀態的嚴重性、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應靈敏度，以及治療耐受性/反應。該用量可以常規實驗測定，可由醫生判斷。通常，有效劑量從0.01毫克/千克至50毫克/千克，優選從0.05毫克/千克至10毫克/千克。組合物可單獨給予患者，或者與其他藥劑、藥物或激素結合給予。
一種藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體，給予治療試劑。這些載體包括抗體和其他多肽、基因和其他治療試劑，例如脂質體，只要該載體本身不會誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，而且載體的給予不會產生過高毒性。合適的載體可以是大的代謝緩慢的大分子，例如蛋白質、聚糖、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物和失活病毒顆粒。
還可使用藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽等等；以及有機酸鹽，如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等等。Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)對藥學上可接受的載體作了詳盡討論。
治療組合物中藥學上可接受的載體也可含有水、鹽水、甘油和乙醇等液體。另外，這些組合物還可含有輔助物質，例如，溼潤劑或乳化劑、pH緩衝物質等等。這些載體能將藥物組合物配製成供患者攝取的片劑、丸劑、糖衣片、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮液等等。
一旦配成以後，本發明的組合物可直接給予受試者。接受治療的受試者可以是動物；特別是人受試者。
本發明使用的藥物組合物可以任何途徑給予，包括但不限於，口服、靜脈內、肌內、動脈內、脊髓內、鞘內、心室內、透皮或經皮(例如參見WO98/20734)、皮下、腹腔內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。本發明的藥物組合物也可用基因槍或無針注射器給予。一般將治療組合物製成可注射的液體溶液或懸浮液；也可以製成適合注射前溶解或懸浮於液體介質中的固體形式。
通過注射可將組合物直接輸送到皮下、腹腔內、靜脈內或肌內，或者送到組織間質空間。組合物也可施加在病變部位。劑量治療可分單劑或多劑。
如果本發明的多肽的活性在一特定疾病狀態中是過量的，可採用多種方法。其中一種方法包括把上述抑制劑化合物(拮抗劑)與藥學上可接受的載體一起給予受試者，抑制劑化合物的量為通過例如阻斷配體、基質、酶、受體的結合，或者抑制第二信號而抑制多肽的功能，從而緩解異常狀況的有效量。這些拮抗劑優選是抗體。這些拮抗劑最好是嵌合抗體和/或人源化抗體，如前所述，可使它們的免疫原性減至最低。
另一種方法是給予保留弓對上述配體、基質、酶、受體有結合親和力的多肽的可溶形式。通常，多肽以保留相關部分的片段的形式給予。
在一替換方法中，應用表達封閉技術，例如用內部產生或另外給予的反義核酸分子(如上所述)，抑制編碼多肽的基因表達。設計編碼多肽的基因的調控區、5』區或調節區(信號序列、啟動子、增強子和內含子)的互補序列或反義核酸分子(DNA、RNA或PNA)，可獲得對基因表達的修飾。類似地，用「三螺旋體」鹼基成對方法可實現抑制。三螺旋體成對是有用的，這是因為它能引起抑制雙螺旋體充分打開以結合聚合酶、轉錄因子或調節分子的能力。應用三螺旋DNA的治療取得最新進展，已在文獻中有所描述(Gee，J.E.等，(1994)InHuber，B.E.and B.I.Carr，Molecular and ImmunologicApproaches，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，NY)。互補序列或反義分子還可設計成防止轉錄子與核糖體結合，從而封閉mRNA的翻譯。這些寡核苷酸可給予，或在體內表達中原位產生。
另外，使用對它的編碼mRNA序列有特異性的核糖體，可防止表達本發明的多肽。核糖體是具有催化活性的天然或合成RNA(例如，參見Usman，N等，Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4)，527-33)。合成核糖體可設計成在選定位置上特異性切割mRNA，從而防止mRNA翻譯為功能多肽。核糖體通常在RNA分子中找到，可用天然的磷酸核糖骨架和天然鹼基合成。另一個選擇是，核糖體可用非天然骨架，例如2』-氧-甲基RNA合成，保護核糖核酸酶免於降解，可含有經修飾的鹼基。
可對RNA分子進行修飾，以增加胞內穩定性和延長半衰期。可能的修飾包括但不限於，在分子的5』和/或3』末端加入側翼序列或在分子的骨架內使用硫代磷酸或2』-氧-甲基而不用磷酸二酯酶連鎖。這一概念對於產生PNA是固有的，可延伸至所有這些分子中，方法是包含非常規鹼基，例如肌苷、queosine和butosine以及乙醯基-、甲基-、硫代-、及類似修飾形式的腺嘌呤、胞苷、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿苷，它們不易被內源性內切核酸酶識別。
有一些方法治療與本發明的多肽表達不足夠或其活性相關的異常徵狀，可採取一些方法。其中一種方法包括把治療有效量的能激活該多肽的化合物，即上述激動劑給予患者，緩解異常徵狀。另外，也可以給予治療量的多肽與適當藥物載體，以恢復多肽的相關生理平衡。
可用基因療法在受試者體內用相關細胞內源性產生多肽。基因療法以修正治療基因置換缺陷基因，永久治療多肽的不適當產生。
本發明的基因療法可發生於體內或體外。體外基因療法需要分離和純化患者的細胞，導入治療基因，以及將經基因改造的細胞再引入患者體內。與之相反，體內基因療法不需要分離和純化患者的細胞。
治療基因往往被「包裝」以方便給予患者。基因輸送介質可以是非病毒，例如脂質體，或者複製缺陷型病毒，例如Berkner，K.L.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，39-66(1992))所述的腺病毒，或者Muzyczka，N.(Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158，97-129(1992)和美國專利US5,252,479所述的腺伴隨病毒(AVV)載體。例如，可對編碼本發明的多肽的核酸分子進行改造，以在複製缺陷型逆轉錄病毒載體中表達。再分離這種表達構造體，導入用含有編碼多肽的RNA的逆轉錄病毒質粒載體轉導的包裝細胞內，使該包裝細胞現在能產生含有感興趣的基因的感染病毒粒子。將這些生產細胞給予患者，以體內改造細胞和體內表達多肽(參見「Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches」(納入作為文獻參考)，Human MolecularGenetics(1996)，T Strachan和AP Read，BIOS Scientific Publishers Ltd)。
另一種方法是給予「裸露DNA」，其中治療基因直接注入血流和肌肉組織。
對於本發明的多肽或核酸分子是引起疾病的試劑的情形，本發明提出它們可用在疫苗中，產生針對疾病引發劑的抗體。
本發明的疫苗可以是預防性(即預防感染)或者是治療性的(即治療感染後疾病)。這些疫苗包括免疫抗原、免疫原、多肽、蛋白質或核酸，通常與前述藥學上可接受的載體結合，包括本身不會誘導產生對接受該組合物的個體有害的任何載體。這些載體還可用作免疫刺激劑(「輔助劑」)。此外，抗原或免疫原可與細菌類毒素例如來自白喉、破傷風、霍亂、幽門螺桿菌和其他致病原的類毒素偶聯。
因為多肽可以在胃內分解，所以含有多肽的疫苗最好腸胃外給予(例如皮下、肌內、靜脈內、或皮內注射)。適合腸胃外給予的製劑包括無菌水溶液或非水溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑和使製劑與接受者的血液等滲的溶解物，以及無菌水懸浮液或非水懸浮液，其可包括懸浮劑或增稠劑。
本發明的疫苗製劑可製成單劑或多劑容器。例如，密封安瓿和小瓶可儲存於凍幹條件下，只要在使用之前加入無菌液體載體。劑量取決於疫苗的比活性，通過常規實施可輕易測定。
本發明還涉及本發明的核酸分子作為診斷試劑的應用。檢測以本發明的核酸分子為特點，並與功能障礙相關的基因的突變形式提供了一種工具，它可加至或限定因為基因的表達不足、過度表達或者空間或時間表達發生改變而引起的疾病或疾病易感性的診斷。通過各種技術可在DNA水平上檢測攜帶基因突變的個體。
用於診斷的核酸分子可從受試者的細胞中獲得，例如從血液、尿、唾液、組織活體或屍體材料中獲得。基因組DNA可直接用作檢測，或者在分析前用PCR、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)或者其他擴增技術酶解擴增(參見Saiki等，Nature，324，163-166(1986)；Bej等，Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.，26，301-334(1991)；Birkenmeyer等，J.Virol.Meth.，35，117-126(1991)；Van Brunt，J.，Bio/Technology，8，291-294(1990))。
在一實施例中，本發明該方面提供一種診斷患者疾病的方法，該方法包括評估編碼本發明的多肽的天然基因的表達水平，並將所述表達水平與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。這種方法包括以下步驟(a)在允許本發明的核酸分子和核酸探針形成雜交複合物的嚴謹條件下將患者的組織樣品與探針接觸；(b)在與步驟(a)相同的條件下將對照樣品在與所述探針接觸；(c)以及檢測所述樣品中是否存在雜交複合物。
其中，檢測到患者樣品中雜交複合物的水平與對照樣品中雜交複合物不同，表示患病。
本發明另一方面包括一種診斷方法，其包括以下步驟(a)從待測試疾病的患者中獲得組織樣品；(b)從所述組織樣品中分離本發明的核酸分子；(c)通過檢測與疾病相關的核酸分子是否存在突變，診斷患者疾病。
為了幫助上述方法檢測核酸分子，可包括擴增步驟，例如利用PCR技術。
將擴增產物大小的變化與正常基因型比較，可檢測到缺失或插入。將擴增DNA與本發明的標記PA，或者與本發明的反義標記DNA序列雜交，可以鑑定點突變。以核糖核酸酶消化或評估熔點溫度的差異，發現完全匹配的序列與錯配的雙鏈體截然不同。患者是否存在突變可這樣檢測將DNA與在嚴謹條件下和該DNA雜交的核酸探針接觸，形成雜交雙鏈分子，該雜交雙鏈分子在對應於與疾病相關的突變的任何部分具有核酸探針鏈的未雜交部分；檢測探針鏈的未雜交部分是否存在即表示該DNA鏈的對應部分存在或不存在與疾病相關的突變。這樣的診斷特別適用於產前，甚至新生兒測試。
參考基因與「突變體」基因之間的點突變和其他序列差異可以公知技術鑑定，例如，直接DNA測序或單鏈構象多態性(參見Orita等，Genomics，5，874-879(1989))。例如，測序引物可與改良PCR產生的雙鏈PCR產物或單鏈模板分子一起使用。以使用放射性標記的核苷酸的常規程序或者通過使用螢光標記的自動測序程序，進行序列測序。克隆DNA片斷也可用作檢測特異性DNA片段的探針。當與PCR結合時該方法的靈敏度大大提高。另外，點突變和其他序列變異，例如多態性，可參照上述方法檢測，例如使用等位基因特異性寡核苷酸對不同於單個核苷酸的序列進行PCR擴增。
在變性試劑存在或不存在下改變DNA片段的凝膠電泳遷移率，或直接對DNA測序都可以檢測到DNA序列的差異(例如Myers等，Science(1985)2301242))。特定位置的序列變化可通過核酸酶保護測定法揭示，例如RNase和S1保護，或者化學切割方法發現(Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)854397-4401)。
除了常規凝膠電泳和DNA序列測定之外，微小缺失、非整倍性、易位、倒位等突變也可用原位分析檢測(例如，參見Keller等，DNA Probes，2nd Ed.，Stockton Press，New York，N.Y.，USA(1993))，換言之，可分析細胞內DNA或RNA序列的突變，無需分離或固定在膜上。螢光原位雜交(FISH)是目前最常用的方法，就FISH的綜述已有很多報導(例如，參見Trachuck等，Science，250，559-562(1990)，and Trask et al.，Trends，Genet.，7，149-154(1991))。
本發明另一實施例中，可構建包括本發明核酸分子的寡核苷酸探針陣列，對遺傳變體、突變和多態性進行有效篩選。陣列技術方法是公知的，獲得廣泛應用，可用來解釋分子遺傳方面的各種問題，包括基因表達、遺傳連鎖和遺傳變異性(例如，參見M.Chee等，Science(1996)，Vol 274，pp 610-613)。
在一實施例中，按照PCT申請WO95/11995(Chee等)；Lockhart，D.J.等((1996)Nat.Biotech.141675-1680))；以及Schena，M.等((1996)Proc.Natl.Acad.Sci.9310614-10619))描述的方法製作和使用陣列。寡核苷酸對的範圍從2至1,000,000以上。應用光引導化學法在基質的指定區域上合成低聚物。基質可以是紙、尼龍或其他種類的膜、過濾器、晶片、玻璃載片或其他任何合適的固相支持物。另外，參照PCT申請WO95/251116(Baldeschweiler等)中描述的方法，使用化學偶聯程序和噴墨應用裝置可在基質表面上合成寡核苷酸。另一方面，利用真空系統、熱學、紫外線、機械或化學結合程序，以類似斑點(或狹線)印跡的「柵格」陣列將cDNA片段或寡核苷酸設置和連接於基質表面上。陣列，例如上述的那些陣列，可用人手或現有設備(斑點印跡或狹線印跡裝置)、材料(任何合適的固相支持物)和機器(包括自動儀器)製作，它們可含有8、24、96、384、1536或6144個寡核苷酸，或者2至1,000,000以上之間的任何數目，該數目能夠使陣列有效地應用於市場上買到的儀器中。
除了上述討論的方法之外，通過包括測定受試者樣品中多肽或Mrna水平異常增加或減少的方法可以診斷疾病。採用本領域公知的任何方法可以在RNA水平上測定表達減少或增加，以便對聚核苷酸作定量分析，例如核酸擴增，如PCR、RT-PCR、RNase保護、Northern印跡和其他雜交方法。
可用來確定從宿主獲得的樣品中本發明的多肽水平的測定技術已為本領域技術人員所知，在上文提到的一些文獻中已有討論(包括放射性免疫測定法、競爭結合測定法、Western印跡分析和ELISA試驗)。本發明該方面提供一種診斷方法，其包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽複合物的條件下將上述一種配體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述複合物。
測定多肽水平的方案，例如ELISA、RIA和FACS還可為診斷多肽表達的變化或異常水平提供基礎。在適合形成複合物的條件下將正常哺乳動物受試者，優選是人的體液或細胞抽提物與針對多肽的抗體結合，確立多肽表達的正常或標準值。標準複合物形成的數量可用各種方法定量測定，例如光度計裝置。
特異性結合本發明的多肽的抗體可用來診斷以多肽表達為特點的徵狀或疾病，或者用在測定法中監測以本發明的多肽、核酸分子、配體和其他化合物治療的患者。用於診斷目的的抗體可以用上述關於治療所述的相同方法製成。對多肽的診斷分析包括利用抗體和標記檢測人體液或者細胞或組織抽提物的多肽的方法。使用的多肽可以修飾或不作修飾，將它們與報導分子共價或非共價結合加上標記。可以應用本領域已知的各種各樣報導分子，其中一些已在上文作了描述。
將在受試者活體組織獲得的對照和患病樣品中表達的多肽數量與標準值作比較。標準值與受試者值之間的偏差建立診斷疾病的參數。可用診斷分析區分多肽不存在、存在和過度表達，並監測治療幹預期間多肽水平的調節。這些分析也可用來評估動物研究、臨床試驗或個體患者的監測治療中特定治療方案的療效。
本發明的一種診斷試劑盒可包括(a)本發明的核酸分子；(b)本發明的多肽；或者(c)本發明的配體。
在本發明一方面中，一種診斷試劑盒可包括第一容器，它含有在嚴謹條件下與本發明的核酸分子雜交的核酸探針；第二容器，它含有用來擴增該核酸分子的引物；以及該探針和引物的使用說明書，方便診斷疾病。這種試劑盒還可包括帶有消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
在本發明另一方面中，一種診斷試劑盒可包括核酸分子陣列，其中至少一個核酸分子是本發明的核酸分子。
為了檢測本發明的多肽，一種診斷試劑盒可包括一或多種與本發明的多肽結合的抗體；一種用來檢測該抗體與多肽之間結合反應的試劑。
這些試劑盒都可用於診斷疾病或疾病易感性，特別是細胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神經系統疾病、發育障礙、代謝性疾病、感染和其他病理病徵的藥物。具體地說，這些疾病可包括但不限於免疫疾病，例如自身免疫疾病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病、全身性紅斑狼瘡、和多發性硬化病，炎症疾病，例如過敏症、鼻炎、結膜炎、腎小球性腎炎、葡萄膜炎、克羅因病、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾病、胰腺炎、消化系統炎症、膿血症、內毒素性休克、膿毒性休克、惡病質、肌痛、強直性脊椎炎、重症肌無力、病毒後疲勞症候群、肺部疾病、呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道炎症、傷口癒合、子宮內膜異位、皮膚病、貝切特氏病，腫瘤，例如黑素瘤、肉瘤、腎腫瘤、結腸腫瘤，血液疾病、骨髓增生異常、何杰金氏病、骨質疏鬆症、肥胖、糖尿病、痛風、心血管疾病、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心衰竭、中風、肝病、愛滋病、愛滋病相關症候群、神經系統疾病、男性不孕症、衰老和感染，包括變形體感染、細菌感染和病毒感染，特別是人皰疹病毒5(細胞巨化病毒)感染。
以下，將通過舉例說明，特別是結合INSP037多肽對本發明的各個方面和實施例進行描述。
應明白，對細節的修改並不脫離本發明的範圍。


圖1由Inpharmatica Genome Threader查詢序列SEQ ID NO36得到的結果。
圖2由Inpharmatica Genome Threader獲得SEQ ID NO36與最接近相關結構之間的序列對比。
圖3INSP037的預計核苷酸序列(包括SEQ ID NO35)和翻譯(SEQ IDNO36)。
圖4INSP037的克隆核苷酸序列(包括SEQ ID NO35)和翻譯(SEQ IDNO36)，證明INSP037的預計序列和克隆序列是相同的。
圖5PCRII-TOPO-IPAAA44548的圖譜。
圖6表達載體pEAK12d的圖譜。
圖7質粒pDONR201的圖譜。
圖8表達載體pEAK12d-IPAAA44548-6HIS的圖譜。
圖9大腸桿菌表達載體pDEST14的圖譜。
圖10質粒PCRII-TOPO-IPAAA44548的圖譜。
圖11PCRII-TOPO-IPAAA44548的核苷酸序列。
圖12pDEST14-IPAAA44548-6HIS的核苷酸序列。
圖13pEAK12D-IPAAA44548-6HIS的核苷酸序列。
圖14INSP037多肽(SEQ ID NO36)的NCBI-NR結果，表明匹配不是100％的，由此證明INSP037是新穎的。
圖15INSP037多肽(SEQ ID NO36)的NCBI-month-aa結果，表明匹配不是100％的，由此證明INSP037是新穎的。
圖16INSP037多肽(SEQ ID NO36)的翻譯核苷酸資料庫NCBI-month-nt的結果，表明匹配不是100％的，由此證明INSP037是新穎的。
具體實施例方式
實施例1 INSP037從SEQ ID NO36產生的多肽序列表示INSP037的外顯子的翻譯，該序列可用作針對PDB資料庫已有的蛋白質結構的Inpharmatica GenomeThreader查詢工具。上部匹配是四螺旋束細胞因子家族成員的結構。上部匹配與查詢序列對比的Genome Threader置信水平為84％(圖1)。圖2所示為INSP037查詢序列與牛幹擾素-γ序列(PDB-1d9g，四螺旋束細胞因子家族成員)的序列對比(Randal等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.2000 Jan；56(Pt1)14-24)。應注意，INSP037多肽序列在圖2以「IPAAA445」表示。蛋白質的四螺旋束細胞因子家族成員具有重要的治療作用。
1.從cDNA文庫中克隆IPAAA445481.1cDNA文庫人cDNA文庫(在噬菌體λ載體中)購自Stratagene或Clontech，或者在Serono Pharmaceutical Research Institute按照生產商(Stratagene)的方案在ZAP或λGT10載體中製成。噬菌體λDNA按照生產商(Promega，Corporation，Madison WI.)的指示用Wizard Lambda Preps DNA純化系統在小規模的感染大腸桿菌宿主菌培養基中製備。所用的文庫和宿主菌清單列於表I中。
1.2對噬菌體文庫DNA的虛擬cDNA進行PCR擴增應用基因特異性克隆引物(CP1和CP2，圖3和表II)，獲得編碼IPAAA44548的全長虛擬cDNA(圖3)，作為264bp的PCR擴增產物(圖4)。用MJ Research DNA Engine在50微升終體積中進行PCR擴增，該終體積含有1X AmpliTaqTM緩衝液、200μM dNTPs、克隆引物各50pmole、2.5個單位AmpliTaqTM(Perkin Elmer)和噬菌體文庫DNA各100ng，程序如下94℃，1分鐘；94℃循環40次，1分鐘，x℃，以及y分鐘，72℃(其中x是最低溫度-5℃，y＝1分鐘/kb產物)；然後，72℃循環1次，7分鐘，4℃持續循環。
在1X TAE緩衝液(Life Technologies)中的0.8％瓊脂糖凝膠上看到擴增產物，用Wizard PCR Preps DNA純化系統(Promega)從凝膠純化得到PCR產物，其以預定分子量遷移。PCR產物在50微升無菌水中洗脫出來，或者直接亞克隆或者儲存於-20℃。
1.3用於PCR的基因特異性克隆引物設計長度為18至25個鹼基的PCR引物對，以便運用引物設計軟體(Scientific Educational Software，PO Box 72045，Durham，NC 27722-2045，USA)擴增虛擬cDNA的全長序列。將PCR引物優化至溫度接近55±10℃，GC含量為40-60％。選擇對靶序列IPAAA44548有高度選擇性的引物(很少或沒有非特異性引發)。
1.4PCR產物的亞克隆用購自Invitrogen Corporation的TOPT TA克隆試劑盒(cat.No.分別是K4600-01和K4575-01)，在生產商指定的條件下將PCR產物亞克隆到拓樸異構酶I修飾克隆載體(pCR II TOPO)中。簡言之，從人推定文庫(文庫3)取4微升凝膠純化的PCR產物，室溫下與1微升TOPO載體和1微升鹽溶液培養15分鐘。再按以下方法將反應混合物轉化到大腸桿菌菌株TOP10(Invitrogen)中50微升One Shot TOP10細胞等分試樣在冰上解凍，加入20微升TOPO反應物。該混合物冰上培育15分鐘，再在42℃培育熱激剛好30秒。將樣品送回冰上，加入250微升溫熱SOC培養基(室溫)。樣品在37℃搖動培育(220rpm)1小時。然後，將轉化混合物鋪在含有氨比西林(100μg/ml)的L-broth(LB)板上，37℃培育過夜。通過集落PCR鑑定含有cDNA插入片段的抗氨比西林抗性集落。
1.5集落PCR用無菌牙籤將集落接種在50微升無菌水中。然後，按照上述方法，將10微升接種物等分試樣在20微升總反應體積中進行PCR擴增，但引物對用SP6(5』和T7。循環條件如下94℃，2分鐘；94℃循環30次，30秒，47℃，30秒，以及72℃1分鐘)；72℃循環1次，7分鐘。作進一步分析之前將樣品保持在4℃(持續循環)。
在1X TAE緩衝液中的1％瓊脂糖凝膠上分析PCR反應產物。使產生預期PCR產物大小(由於多個克隆位點或MCS而得到264bp cDNA+187bp)的集落生長過夜，生長條件溫度為37℃，5毫升含有氨比西林(50μg/ml)的L-broth(LB)板，37℃220rpm搖動。
1.6質粒DNA的製備和測序按照生產商的指示，用Qiaprep Turbo 9600自動化系統(Qiagen)或WizardPlus SV Minipreps試劑盒(Promega cat.no.1460)在5毫升培養基中小量製備質粒DNA。將質粒DNA在100微升無菌水中洗脫。用Eppendorf BO光度計測定DNA濃度。按照生產商的指示，用BigDyeTerminator系統(AppliedBiosystems cat.no.4390246)以T7和SP6為引物對質粒DNA(200-500ng)進行DNA測序。測序反應用Dye-Ex柱(Qiagen)或者Montage SEQ 968淨化板(Millipore cat.no.LSKS09624)純化，再用Applied Biosystems 3700測序儀分析。
2.在HEK293/EBNA細胞中表達IPAAA44548的質粒的構建通過DNA測序鑑定含有IPAAA44548全編碼序列(ORF)的pCRII-TOPO克隆(圖5)，再運用GatewayTM克隆方法(Invitrogen)以該pCRII-TOPO克隆將插入片段亞克隆到哺乳動物細胞表達載體pEAK12d(圖6)。克隆序列含有單個核苷酸取代A134G(圖4)。
2.1與符合讀框的6HIS標記序列融合的Gateway相容性IPAAA44548全編碼序列的產生Gateway克隆方法的第一階段涉及二步PCR反應，該反應用attB1重組位點和Kozak序列在5』末端側翼，以及用編碼符合讀框的6組氨酸(6HIS)標記、終止密碼子和attB2重組位點(Gateway相容性cDNA)在3』末端側翼產生IPAAA44548全編碼序列。第一次PCR反應(在50微升終體積中)含有25ngpCR II TOPO-IPAAA44548(質粒13124，圖5)、2μl dNTPs(5mM)、5μl 10X Pfx聚合酶緩衝液、基因特異性引物各0.5μl(100μM)(正向引物EX1，反向引物EX1)和0.5μl Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)。在95℃首次變性步驟進行PCR反應2分鐘，然後94℃循環12次15秒，以及68℃30秒。按照生產商的指示，用Wizard PCR prep DNA純化系統(Promega)直接在反應混合物中純化PCR產物。第二次PCR反應(在50微升終體積中)含有10μl純化PCR product、2μl dNTPs(5mM)、5μl 10X Pfx聚合酶緩衝液、Gateway轉化引物各0.5μl(100μM)(正向引物GCP，反向引物GCP)和0.5μl ofPlatinum Pfx DNA聚合酶。第二次PCR反應的條件是95℃1分鐘；94℃循環4次15秒；45℃30秒以及68℃3.5分鐘；94℃循環25次15秒；55℃30秒和68℃3.5分鐘。參照上述方法純化PCR產物。
另一個選擇是在大腸桿菌中表達IPAAA44548，在上述相同條件下，第一次PCR用基因特異性引物(正向引物EX3，反向引物EX2)，然後用引物GCPF和GCPR產生全編碼序列，其含有啟動甲硫氨酸密碼子上遊的ShineDalgarno序列。所得的PCR產物命名為SD-IPAAA44548。
2.2 Gateway相容性IPAAA44548全編碼序列亞克隆到Gateway進入載體pDONR201和表達載體pEAK12dGateway克隆方法的第二階段按如下方法將Gateway修飾PCR產物亞克隆到Gateway進入載體pDONR201(Invitrogen，圖7)將5微升純化的PCR產物與1.5μl pDONR201載體(0.1μg/μl)、2μl BP緩衝液和1.5μl BP克隆酶混合物在室溫培育1小時。加入蛋白酶K(2μg)終止反應，37℃培育多10分鐘。取該反應的一等分試樣，用Biorad Gene Pulser電穿孔儀通過電穿孔轉化到大腸桿菌DH10B細胞中。將轉化物鋪在LB-卡那黴素板上。用Wizard PlusSV Minipreps試劑盒(Promega cat.no.1460)在1-4個所得集落中小量製備質粒DNA，在重組反應中使用1.5μl該質粒洗脫液，該反應的終體積為10毫升，含有5μl pEAK12d載體(圖6)(0.1μg/μl)、2μl LR緩衝液和1.5μl LR克隆酶(Invitrogen)。混合物室溫培育1小時，加入蛋白酶K(2μg)終止培育，再在37℃培育10分鐘。取該反應的一等分試樣(1μl)，通過電穿孔技術轉化到大腸桿菌DH10B細胞中。
參照上述方法，以集落PCR鑑定含有正確插入片段的克隆，但PCR的引物用pEAK12d(正向引物pEAK12d，反向引物pEAK12d)。用Qiaprep Turbo9600自動化系統(Qiagen)或人手以Wizard Plus SV Minipreps試劑盒(Promega)在含有正確插入片段的克隆中分離出小量製備質粒DNA，並用正向引物pEAK12d和反向引物pEAK12d確認序列。
從500毫升序列已被確認的克隆中製備用氯化銫梯度純化的質粒pEAK12d-IPAAA44548-6HIS(質粒ID號11775，圖8)的大量製備DNA(Sambrook J.等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，重懸於1μg/μl無菌水中，-20℃儲存。
2.3 Gateway相容性SD-IPAA44548全編碼序列亞克隆到Gateway進入載體pDONR201和大腸桿菌表達載體pDEST14以BP克隆酶將含有符合讀框的3』6HIS標記編碼序列和5』上遊ShineDalgarno序列的Gateway相容性SD-IPAAA44548全編碼序列亞克隆到pDONR201。如上所述，重組反應使用所得的質粒與大腸桿菌表達載體pDEST14(購自Invitrogen，圖9)以及LR克隆酶。參照上述方法，對得到的表達質粒(pDEST14-IPAAA44548-6HIS)(圖10，質粒ID號12896)作序列確認。對於在大腸桿菌中的表達，將氯化銫梯度純化的大量製備DNA重新轉化至大腸桿菌宿主菌BL21中。插入cDNA的表達受T7啟動子控制。
2.4表達質粒pEAK12d的構建載體pEAK12d是哺乳動物細胞表達載體pEAK12的Gateway克隆系統相容譯本(購自Edge Biosystems)，其中感興趣的cDNA在人EF1α啟動子的控制下表達。pEAK12d按以下方法產生用限制酶HindIII和NotI消化pEAK12，用克列諾(New England Biolabs)平端，並用牛小腸鹼性磷酸鹽(Roche)脫磷酸。在脫磷酸作用之後，使載體與含有ccdB基因旁側的AttR重組位點和氯黴素抗性的平端Gateway讀框盒C(Gateway載體轉化系統，Invitrogen cat no.11828-019)連接，再轉化到大腸桿菌DB3.1細胞(可使含ccdB基因的載體增殖)中。用Wizard Plus SV Minipreps試劑盒(Promega)使小量製備DNA從幾個所得集落中分離出來，以AseI/EcoRI消化鑑定集落，得到670bp片段，這表示讀框盒以正確方向插入。得到的質粒命名為pEAK12d(圖6)。
3.含有IPAAA44548的cDNA文庫的鑑定在文庫3、8和12(分別是推定、大腦皮層和胎兒腎)中鑑定用CP1和CP2獲得，並以正確大小(264bp)遷移的PCR產物。
表I 人cDNA文庫


表II IPAAA44548克隆引物

表III IPAAA44548亞克隆和測序的引物

下劃線序列＝Kozak序列粗體＝終止密碼子斜線序列＝His標記

＝Shine Dalgarno序列(核糖體結合位點)
4.克隆的IPAAA44548-S-6HIS(質粒號12118)在哺乳動物細胞中的表達4.1細胞培養基表達埃-巴二氏病毒核抗原的人胚胎腎293細胞(HEK293-EBNA，Invitrogen)保持在不含Ex-cell VPRO血清的培養基懸浮液中(種子儲備，維持培養基，JRH)。轉染前16至20小時(第1天)，將細胞接種在2x T225燒瓶中(每個燒瓶50毫升，接種在含有2％FBS移種培養基(JRH)的DMEM/F12(1∶1)中，密度為2×105個細胞/毫升)。第二天(轉染第0天)，用JetPEITM試劑進行轉染(2μl/μg質粒DNA，PolyPlus-transfection轉染試劑)。每個燒瓶中，113μg質粒(No.12118)與2.3μg GFP(螢光報導基因)共轉染。再將轉染混合物加入2x T225燒瓶中，37℃(5％CO2)培育6天。
在第1和第6天定性螢光檢驗確認為陽性轉染。
在第6天(收穫天)，將兩個燒瓶中的上清液(100ml)合併，離心(4℃，400g)，並置於帶有獨特鑑定器的器皿內。
保留一等分試樣(500μl)對6His標記蛋白作QC(內部生物加工QC)。
參照BP/PEI/HH/02/04中稱之「懸浮細胞PEI轉染」的方案，以Polysciences的聚乙烯亞胺為轉染劑進行放大批量生產。
這種方案基於以下比例對於400毫升旋轉器在200毫升FEME 1％FBS中每毫升1E6hek293EBNA個細胞，取400微克(質粒號12118)稀釋在10毫升1％FEME中，加入800微克PEI，轉染後90分鐘，加入1％FEME培養基至總體積400毫升。Spinner靜置於培養基中培養6天，收穫。
4.2純化方法含有C端帶6His標記的重組蛋白質的培養基樣品(100或400毫升)分別用1體積冷凍緩衝液A(50mM磷酸二氫鈉；600mM氯化鈉；8.7％(重量/體積)甘油，pH7.5)稀釋至終體積200和800毫升。樣品經0.22μm無菌過濾器(Millipore，500毫升過濾裝置)過濾，4℃儲存於無菌方形培養瓶中(Nalgene)。
4℃下用連接到樣品自動裝載器(Labomatic)的VISION工作站(AppliedBiosystems)進行純化。純化程序由兩個連續步驟組成在裝有鎳離子的Poros20MC(Applied Biosystems)柱(4.6×50mm，0.83ml)上進行金屬親和力層析，再在Sephadex G-25培養(Amersham Pharmacia)柱(1.0×10cm)上進行凝膠過濾。
第一個層析步驟的金屬親和柱用30柱體積的EDTA溶液(100mMEDTA；1M NaCl；pH8.0)再生，用15柱體積的100mM硫酸鎳溶液洗滌重新裝載鎳離子，用10柱體積的緩衝液A和7柱體積的緩衝液B(50mM磷酸二氫鈉；600mM氯化鈉；8.7％(重量/體積)400mM甘油；咪唑，pH7.5)洗滌，最後用15柱體積含15mM咪唑的緩衝液A平衡。樣品用Labomatic的樣品裝載器轉移到200毫升定量環，然後以10ml/min的速率裝到鎳金屬親和柱上。如果是400毫升放大取樣，轉移和裝載步驟重複4次。親和柱再用12柱體積的緩衝液A和28柱體積的含20mM咪唑的緩衝液A洗滌。在20mM咪唑洗滌期間，附著比較鬆散的汙染蛋白質從柱中洗脫出來。重組的His標記蛋白質最後用10柱體積的緩衝液B洗脫，流速為2ml/min，洗脫出來的蛋白質收集得到1.6毫升餾分。
第二層析步驟的Sephadex G-25凝膠過濾柱用2毫升緩衝液D(1.137M氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；pH7.2)再生，然後用4柱體積的緩衝液C(137mM氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；20％(重量/體積)甘油；pH7.4)平衡。從鎳柱洗脫出來的峰值餾分自動通過裝在Sephadex G-25柱並連接到VISION的整合型樣品裝載器，蛋白質用緩衝液C洗脫，流速為2ml/min。去鹽後樣品回收得到2.2毫升餾分。該餾分經過0.22μm無菌離心過濾器(Millipore)過濾，凍存於-80℃。取樣品的一等分試樣用SDS-PAGE(4-12％NuPAGE凝膠；Novex)的考馬斯亮藍染色以及抗His抗體的Western印跡進行分析。
考馬斯亮藍染色NuPAGE凝膠用0.1％考馬斯亮藍R250染色溶液(30％甲醇，10％乙酸)室溫染色1小時，然後用20％甲醇，7.5％乙酸去色，直至背景澄清，蛋白質帶清晰可見。
Western印跡電穿孔後在4℃、290mA、1小時內將蛋白質從凝膠電轉移到硝基纖維素膜上。室溫下用5％在緩衝液E(137mM氯化鈉；2.7mM氯化鉀；1.5mM磷酸二氫鉀；8mM磷酸二氫鈉；0.1％Tween 20，pH7.4)中的奶粉封閉纖維素膜1小時，再於4℃在2.5％在緩衝液E中的奶粉中與2種兔多克隆抗His抗體(G-18和H-15，各0.2μg/ml；Santa Cruz)混合物培養過夜。室溫再培養1小時之後，膜用緩衝液E(3x10分鐘)洗滌，再與結合HRP的第二抗兔抗體(DAKO，HRP 0399)室溫培養2小時，第二抗體用含2.5％奶粉的緩衝液E稀釋至1/3000。用緩衝液E(3x10分鐘)洗滌之後，膜用ECL試劑盒(Amersham Pharmacia)顯影1分鐘。然後，將膜與超膜(Hyperfilm)(Amersham Pharmacia)接觸，使超膜顯影，對Western印跡影像作目測分析。
蛋白質測定用BCA蛋白質測定試劑盒(Pierce)確定通過考馬斯亮藍染色檢測到蛋白質帶的樣品中蛋白質的濃度，以牛血清白蛋白為標準。
4.3IPAAA44548-SEC-6HIS(質粒號12896)在細菌細胞中的表達以下方法描述大腸桿菌BL-21 DE3細菌菌株在生產蛋白質中的應用。「BL21 DE3」是T7 RNA聚合酶表達系統的一部分，該系統已廣泛用於過度表達重組蛋白質。
4.4細菌菌株BL21(DE3)的轉化我們使用TSS方法的程序，該方案參照Chung，C.T等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)862172-2175)。
取重組質粒號12896的10-100ng DNA(2μl)，加入到感受態BL21中進行TSS方法，冰上放置20分鐘。加入SOC培養基(0.8ml)，試管在37℃、200rpm培養1小時。從該培養基中取樣20μl和200μl，鋪在含氨比西林(終濃度為40μg/ml)的LB板上，37℃靜置過夜。
第二天，分離出3個集落，用來製備甘油儲備，將生產轉移到發酵罐之前在搖動燒瓶實驗中測試表達(從3個集落中選取1個進行放大試驗，因為它們都在搖動燒瓶內進行相同的程序)。
4.5長期儲存重組大腸桿菌菌株的種子儲備的建立將從新鮮瓊脂平板獲得的單個集落接種到含有LB培養基和40μg/ml氨比西林(終濃度)的5毫升試管中。細菌在37℃、200rpm生長過夜。第二天早上，取出50μl過夜培養基，接種在5毫升新的LB試管(含抗生素)，在37℃、200rpm培養2-3小時，細菌進入指數生長期。
然後，在培養基中加入5毫升20％甘油，混合。取5個冷凍小管，每個加入1.5毫升上述混合物，建立一個種子儲備(seed stock)，凍存於-80℃(內部甘油儲備)。
4.6 5升規模的表達使重組菌株在5升Biolafitte攪拌的反應罐內增殖(反應罐工作時含有5升ECPM1培養基(培養基組成見表IV)和適當抗生素(終濃度為40μg/ml)以及0.5％葡萄糖，以避免預誘導T7啟動子)。製備研究級run2462，送去純化。
以一環冷凍細菌(從其中一個甘油種子儲備小管中刮出)為原料，在500毫升LB(帶抗生素，0.5％葡萄糖)搖動燒瓶內製備接種物，生長9小時再進行自動接種。當細胞到達OD 10(一般生長7至9小時之後)，用1mM終濃度的IPTG誘導蛋白質產生。誘導時間持續3小時。
整個生長和誘導過程中，發酵裝置條件設定為溶解氧濃度為50％；300至700rpm，取決於氧分壓(PO2)，pH7.0。以25ml/min通入空氣+/-O2維持PO2。每小時抽取5毫升樣品，在600nm處測量光密度。
收穫細胞，4000rpm(Sorvall RC 3B)離心。沉澱物凍存於-20℃，直至作進一步處理。
通過SDS-PAGE的考馬斯亮藍染色評估細胞抽提物中是否存在蛋白質。
表IVECPM1的組成
加入幾滴消泡劑PPG P2000。
表V微量元素 每種元素分別溶解在鹽酸中。
4.7純化方法取67克冷凍細菌膏狀物懸於270毫升緩衝液A(50mM磷酸二氫鈉；600mM氯化鈉；1mM PMSF；1mM苯甲脒；8.7％(重量/體積)甘油，pH7.5)，每50毫升加入1片完全不含EDTA的蛋白酶抑制劑(Roche)。在Z-plus細胞破碎儀(高壓細胞破碎系統)使細胞破碎兩代，壓力為1300bar。
然後，使樣品以36,000xg離心30分鐘。以流速4ml/min將上清液(300ml)裝在用緩衝液A平衡的Ni-NTA-Agarose柱(2.5×3.0cm)上。
柱先用100毫升緩衝液A洗滌，再用在緩衝液A中的85毫升20Mm咪唑洗滌。蛋白質用在緩衝液A中的300毫升咪唑線性梯度(20至250mM)洗脫蛋白質，流速為3ml/min，回收到7.5毫升餾分。每秒餾分樣品用還原SDS樣品緩衝液稀釋至1/6。在4-12％NuPage凝膠(Novex)上每孔裝15μl樣品，電穿孔之後，用考馬斯亮藍使凝膠染色。
將具有最高IPAAA44548濃度的餾分(餾分36-42)合併，總體積為53毫升(pool N1)。pool N1兩側的餾分(餾分32-35+43-44)純度和濃度較低，合併(pool N2)，體積為44毫升。
用經過緩衝液B(50mM Tris-HCl，1mM苯甲脒，pH7.5)平衡的Q-Sepharose Fast flow柱(1.5×12cm)進一步純化從鎳柱洗脫出來的合併液。取52毫升pool N1，用300毫升緩衝液B和648毫升水稀釋至終體積1000毫升。以流速5ml/min將樣品裝在柱上，柱用150毫升緩衝液B洗滌，蛋白質用在緩衝液B中的160毫升氯化鈉線性梯度(0至400mM)洗脫。回收到2毫升餾分，按上述方法用染有考馬斯亮藍的SDS-PAGE分析。餾分28-30(pool Q1)含有一條預定分子量9.6kDa的蛋白質帶。餾分31-33(pool Q2)還含有一條分子量約20kDa的蛋白質帶外，表示形成二聚物。
從鎳柱洗脫出來的pool N2取43毫升，用300毫升緩衝液B和657毫升水稀釋至1000毫升。將樣品裝在Q瓊脂糖柱上，參照上述關於pool N1的方法，洗脫蛋白質，並對餾分進行分析。餾分28-30(pool Q3)含有一條預定分子量9.6kDa的蛋白質帶。每次Q柱的洗脫合併液Q-pool的體積為5.5毫升。
使Q-Sepharose洗脫出來的合併液通過Superdex G75凝膠過濾柱(HiLoad16/60，Pharmacia)。柱用0.5M氫氧化鈉洗滌，用PBS平衡。柱的流速為1ml/min，將5毫升合併液裝在柱上。收集到2毫升餾分，按上述方法用染有考馬斯亮藍的SDS-PAGE分析。
合併液Q1的IPAAA44548洗脫出餾分31-35(9.5毫升)(S1)，合併液Q2的蛋白質洗脫出兩個峰，餾分31-34(7.5毫升)(S2)和餾分26-28(5.8毫升)(S3)，合併液Q3的蛋白質洗脫出餾分32-35(7.5毫升)(S4)。當以非還原性SDS-PAGE進行分析時，發現合併液S3含有80％以上形成二聚物的蛋白質，而其他合併液僅含有微量二聚物。合併液S1和S2的純度和濃度接近，合併成一種合併液S1b(9.5+7.5＝15毫升)。
以計算出的摩爾消光係數7,090和分子量9,625，測量280nm處的吸光度，確定蛋白質濃度。質譜法確定合併液S1b和S4中蛋白質的分子量為9，624.6。合併液S3的分子量是19,252.2，證實此合併液中有二硫鍵連接的二聚物。分析合併液，發現其含有的LPS在1.1至3.4U/mg。
純化合併液的概要合併液 濃度總量 批號合併液S1b 2.1mg/ml35.7mg2合併液S31.7mg/ml9.8mg 3合併液S40.95mg/ml 7.1mg 6
共回收到52毫克純蛋白質，或者0.77毫克/克細菌膏狀物。全部三種合併液經過RP-HPLC後的純度大於97％。
序列表SEQ ID NO35(INSP037核甘酸序列)1 ATGACTTCAC CAAACGAACT AAATAAGCTG CCATGGACCA ATCCTGGAGA51 AACAGAGATA TGTGACCTTT CAGACACAGA ATTCAAAATA TCTGTGTTGA101 AGAACCTCAA AGAAATTCAA GATAACACAG AGAAGGAATC CAGAATTCTA151 TCAGACAAAT ATAAGAAACA GATTGAAATA ATTAAAGGGA ATCAAGCAGA201 AATTCTGGAG TTGAGAAATG CAGATGGCAC ACTTTAGSEQ ID NO36(INSP037蛋白質序列)1 MTSPNELNKL PWTNPGETEI CDLSDTEFKI SVLKNLKEIQ DNTEKESRIL51 SDKYKKQIEI IKGNQAEILE LRNADGTL其他疾病包括轉移性黑色素瘤(Vaishampayan U，Clin Cancer Res 2002Dec8(12)3696-701)、慢性肝炎(Semin Liver Dis 200222 Suppl 17)、抗菌免疫性相關疾病(Bogdan，Current Opinion in Immunology 2000，12419-424)、HIV感染、(Dereuddre-Bosquet N.，等，J Acquir Immune Defic Syndr HumRetroviol 1996 Mar 111(3)241-6)、病毒引起的人癌症和疾病(Pfeffer LM，Semin Oncol 1997 Jun 24S9-63-69)、佩羅尼氏病(Peyronie’s disease)(Lacy等，Int J Impot Res 2002 Oct14(5)336-9)、肺結核(Dieli et al.，J Infect Dis 2002Dec 15；186(12)1835-9)、慢性肺病(Oei J等，Acta Paediatr 200291(11)1194-9)、攻擊型慢性牙周炎(Gonzales JR，等，J clin Periodontol 2002 Sep29(9)816-22)、銀屑病(Kimball等，Arch Dermatol 2002 Oct138(10)1341-6)、移植物抗宿主疾病(Miura Y.，等，Blood 2002 Oct 1100(7)2650-8)、斯耶格倫氏病(Sjogren’s disease)(Anaya等，J Rheumatol 2002 Sep；29(9)1874-6)以及克羅恩氏病(Schmit A.等，Eur Cytokine Netw 2002 Jul-Sep13(3)298-305)。
權利要求
1.一種多肽，其特徵在於所述多肽(i)包括或者由SEQ ID NO36所示的胺基酸序列組成；(ii)是其具有分泌性蛋白質功能，特別是四螺旋束細胞因子功能，更好是幹擾素-γ樣功能，或者具有與(i)的多肽相同的抗原決定簇的片段；或者(iii)是(i)或(ii)的功能等效物。
2.如權利要求1所述的多肽，其特徵在於所述多肽作為分泌性蛋白質，特別是作為四螺旋束細胞因子摺疊的成員，優選作為幹擾素-γ樣分子運作。
3.一種屬於權利要求1(iii)的功能等效物的多肽，其特徵在於它與SEQ IDNO36所示的胺基酸序列同源，具有分泌性蛋白質活性，優選有四螺旋束細胞因子活性，最好有幹擾素-γ樣分子活性。
4.如上述權利要求中任何一項所述的片段或功能等效物，其特徵在於它與SEQ ID NO36所示的胺基酸序列或其活性片段具有80％以上的序列列同一性，優選90％、95％、98％或99％以上的序列同一性。
5.如上述權利要求中任何一項所述的功能等效物，其特徵在於它與胺基酸序列為SEQ ID NO36的肽有明顯的結構同源性。
6.如權利要求1、2或4中任何一項所述的片段，其特徵在於所述片段具有與權利要求1(i)的多肽相同的抗原決定簇，由7或以上(例如8、10、12、14、16、18、20或以上)個SEQ ID NO36所示序列的胺基酸殘基組成。
7.一種編碼上述權利要求中任何一項所述的多肽的純化核酸分子。
8.如權利要求7所述的純化核酸分子，其特徵在於所述核酸分子具有SEQID NO35所示的核酸序列或者是其冗餘等效物或片段。
9.一種在高度嚴謹條件下與權利要求7或8的核酸分子雜交的純化核酸分子。
10.一種含有權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子的載體。
11.一種用權利要求10所述的載體轉化的宿主細胞。
12.一種配體，其特徵在於所述配體特異性地結合權利要求1至6中任何一項所述的多肽，最好抑制所述多肽的分泌性蛋白質活性，特別是抑制四螺旋束細胞因子摺疊活性，更好是抑制有幹擾素-γ樣分子活性。
13.如權利要求12中所述的配體，其特徵在於所述配體是一種抗體。
14.一種增加或降低權利要求1至6中任何一項所述的多肽的表達水平或活性的化合物。
15.如權利要求14所述的化合物，其特徵在於所述化合物與權利要求1至6中任何一項所述的多肽結合，但不會誘導該多肽的任何生物作用。
16.如權利要求14或15所述的化合物，其特徵在於所述化合物是天然或修飾的基質、配體、酶、受體或者結構或功能類似物。
17.如權利要求1至6中任何一項所述的多肽、權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子、權利要求10所述的載體、權利要求11所述的宿主細胞、權利要求12或13所述的配體、或者權利要求14至16中任何一項所述的化合物，在治療或診所疾病中的應用。
18.一種診斷患者疾病的方法，其特徵在於所述方法包括評估所述患者組織中編碼權利要求1至6中任何一項所述的多肽的天然基因的表達水平或者評估權利要求1至6中任何一項所述的多肽的活性，並將所述表達水平或者活性與對照水平作比較，若該水平與所述對照水平不同，則表示患病。
19.如權利要求18所述的方法，其特徵在於所述方法在體外進行。
20.如權利要求18或19所述的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(a)在適合形成配體-多肽複合物的條件下將權利要求12或13所述的配體與生物樣品接觸；以及(b)檢測所述複合物。
21.如權利要求18或19所述的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(a)在允許權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子和探針之間形成雜交複合物的嚴謹條件下將患者的組織樣品與該探針接觸；(b)在步驟(a)使用的相同條件下將對照樣品與所述探針接觸；以及(c)檢測所述樣品中是否存在雜交複合物，其中，檢測到患者樣品中雜交複合物的水平與對照樣品中雜交複合物水平不同，表示患病。
22.如權利要求18或19所述的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟(a)在允許權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子和核酸引物之間形成雜交複合物的嚴謹條件下將患者組織的核酸樣品與該引物接觸；(b)在步驟(a)使用的相同條件下將對照樣品與所述引物接觸；(c)擴增樣品中的核酸；(d)檢測患者和對照樣品中擴增核酸的水平；其中，檢測到患者樣品的擴增核酸水平與對照樣品的擴增核酸水平明顯不同，表示患病。
23.如權利要求18或19所述的方法，其特徵在於所述方法包括(a)從有待測試疾病的患者中獲得組織樣品；(b)從所述組織樣品中分離權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子；(c)通過檢測核酸分子與疾病相關的突變是否存在，診斷患者疾病。
24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於所述方法還包括擴增核酸分子以形成擴增產物，以及檢測該擴增產物中是否存在突變。
25.如權利要求23或24所述的方法，其特徵在於所述患者是否是否存在突變是這樣檢測的將所述核酸分子與在嚴謹條件下和所述核酸分子雜交的探針接觸，形成雜交雙鏈分子，該雜交雙鏈分子在對應於與疾病相關的突變的任何部分具有核酸探針鏈的未雜交部分；以及檢測探針鏈的未雜交部分是否存在，表示與疾病相關的突變存在或不存。
26.如權利要求18至25中任何一項所述的方法，其特徵在於所述疾病選自細胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神經系統疾病、發育障礙、代謝性疾病、感染和其他病理病徵，特別是免疫疾病，例如自身免疫疾病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病、全身性紅斑狼瘡、和多發性硬化病，炎症疾病，例如過敏症、鼻炎、結膜炎、腎小球性腎炎、葡萄膜炎、克羅因病、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾病、胰腺炎、消化系統炎症、膿血症、內毒素性休克、膿毒性休克、惡病質、肌痛、強直性脊椎炎、重症肌無力、病毒後疲勞症候群、肺部疾病、呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道炎症、傷口癒合、子宮內膜異位、皮膚病、貝切特氏病，腫瘤，例如黑素瘤、肉瘤、腎腫瘤、結腸腫瘤，血液疾病、骨髓增生異常、何杰金氏病、骨質疏鬆症、肥胖、糖尿病、痛風、心血管疾病、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心衰竭、中風、肝病、愛滋病、愛滋病相關症候群、神經系統疾病、男性不孕症、衰老和感染，包括變形體感染、細菌感染和病毒感染，特別是人皰疹病毒5(細胞巨化病毒)感染。
27.如權利要求1至6中任何一項所述的多肽作為分泌性蛋白質，特別是作為四螺旋束細胞因子類別的成員，優選作為幹擾素-γ樣分子的應用。
28.一種藥物組合物，其特徵在於所述組合物含有權利要求1至6中任何一項所述的多肽、權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子、權利要求10所述的載體、權利要求11所述的宿主細胞、權利要求12或13所述的配體、或者權利要求14至16中任何一項所述的化合物。
29.一種疫苗組合物，其特徵在於所述組合物含有權利要求1至6中任何一項所述的多肽或權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子。
30.如權利要求1至6中任何一項所述的多肽、權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子、權利要求10所述的載體、權利要求11所述的宿主細胞、權利要求12或13所述的配體、權利要求14至16中任何一項所述的化合物、或者權利要求28所述的藥物組合物在製備治療以下疾病的藥物中的應用細胞增殖性疾病、自身免疫/炎症疾病、心血管疾病、神經系統疾病、發育障礙、代謝性疾病、感染和其他病理病徵，特別是免疫疾病，例如自身免疫疾病、類風溼性關節炎、骨關節炎、銀屑病、全身性紅斑狼瘡、和多發性硬化病，炎症疾病，例如過敏症、鼻炎、結膜炎、腎小球性腎炎、葡萄膜炎、克羅因病、潰瘍性結腸炎、炎症性腸疾病、胰腺炎、消化系統炎症、膿血症、內毒素性休克、膿毒性休克、惡病質、肌痛、強直性脊椎炎、重症肌無力、病毒後疲勞症候群、肺部疾病、呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病、氣道炎症、傷口癒合、子宮內膜異位、皮膚病、貝切特氏病，腫瘤，例如黑素瘤、肉瘤、腎腫瘤、結腸腫瘤，血液疾病、骨髓增生異常、何杰金氏病、骨質疏鬆症、肥胖、糖尿病、痛風、心血管疾病、再灌注損傷、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心衰竭、中風、肝病、愛滋病、愛滋病相關症候群、神經系統疾病、男性不孕症、衰老和感染，包括變形體感染、細菌感染和病毒感染，特別是人皰疹病毒5(細胞巨化病毒)感染。
31.一種治療患者疾病的方法，其特徵在於所述方法包括把權利要求1至6中任何一項所述的多肽、權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子、權利要求10所述的載體、權利要求11所述的宿主細胞、權利要求11或12所述的配體、或者權利要求14至16中任何一項所述的化合物、或者權利要求28所述的藥物組合物給予該患者。
32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於當與健康受試者中多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病患者的該表達水平或活性是較低的，給予該患者的多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是激動劑。
33.如權利要求31所述的方法，其特徵在於當與健康受試者中多肽的天然基因的表達水平或者活性相比，患病患者的該表達水平或活性是較高的，給予該患者的多肽、核酸分子、載體、配體、化合物或組合物是拮抗劑。
34.一種監測治療患者疾病的方法，其特徵在於所述方法包括在一段時間內監測患者組織中權利要求1至6中任何一項所述的多肽的表達水平或活性、權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子的表達水平，若在該時間內所述表達水平或活性趨向於對照水平，表示該疾病獲得減緩。
35.一種鑑定有效地治療和/或診斷疾病的化合物的方法，其特徵在於將權利要求1至6中任何一項所述的多肽、或者權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子與懷疑對所述多肽或核酸分子有結合親和力的一或多種化合物接觸，選擇能特異性地結合所述核酸分子或多肽的化合物。
36.一種診斷疾病的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括第一容器，它含有在嚴謹條件下與權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子雜交的核酸探針；第二容器，它含有用來擴增該核酸分子的引物；以及該探針和引物的使用說明書，方便診斷疾病。
37.如權利要求36所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括裝有消化未雜交RNA的試劑的第三容器。
38.一種試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括核酸分子陣列，其中至少一個核酸分子是權利要求7至9中任何一項所述的核酸分子。
39.一種試劑盒，其特徵在於所述試劑盒包括一或多種與權利要求1至6中任何一項所述的多肽結合的抗體；一種用來檢測所述抗體與所述多肽之間結合反應的試劑。
40.一種轉基因或剔除非人動物，其特徵在於所述動物被轉化為表達更高水平、更低水平或缺乏權利要求1至6中任何一項所述的多肽。
41.一種篩選有效治療疾病的化合物的方法，其特徵在於所述方法將權利要求40所述的非人轉基因動物與候選化合物接觸，並測定該化合物對動物疾病的影響。
全文摘要
本發明涉及被本發明鑑定為四螺旋束細胞因子家族成員的新型蛋白質INSP037以及該蛋白質和來自編碼基因的核酸序列在診斷、預防和治療疾病中的應用。
文檔編號A61P9/04GK1620467SQ02828275
公開日2005年5月25日 申請日期2002年12月23日 優先權日2001年12月21日
發明者R·J·法根, C·B·菲爾普斯, A·古特裡吉, C·包爾 申請人:阿雷斯貿易股份有限公司