一種反向非病毒載體基因轉染的方法
2023-08-02 23:45:26 3
專利名稱：：一種反向非病毒載體基因轉染的方法
技術領域：
：本發明涉及基因轉染
技術領域：
，具體涉及一種反向非病毒載體基因轉染的方法。
背景技術：
：基因治療自1989年首次進入臨床試驗以來，已經經歷了近二十年的發展，其應用也從最初的針對遺傳性病症的治療擴展到對獲得性疾病的防治，迄今為止已有上千例基因治療被批准進入臨床試驗。而基因重組及轉染技術也進入到越來越多的研究領域，如組織工程與再生醫學等。對於基因重組及基因轉染而言，安全性好且能產生基因高效、定位表達的載體的構建是關鍵所在。眾所周知，基因治療載體有病毒載體與非病毒載體兩大類，病毒載體儘管具有轉染效率高、基因表達持續時間長等優點，但由於其安全性差，易引起免疫反應以及易整合入基因組帶來突變風險等，其使用往往受到限制。非病毒載體因其安全和易於大量獲得等優點而日益受到關注，但是由於非病毒載體的轉染效率普遍較低，限制了非病毒載體的廣泛應用。可見，一種成功而高效的基因轉染方法的確立可以方便地應用於一大類相關載體及細胞，為非病毒基因載體在臨床的廣泛應用奠定基礎，並可進一步推廣到組織工程與再生醫學、腫瘤基因治療、樹突狀細胞等更多研究領域，具有重要的應用價值。研究發現，基因轉染效率的提高不僅依賴於載體技術的進步，而且與轉染方法密切相關。運用非病毒載體在體外對細胞進行基因轉染的常規轉染方法是先將細胞加入培養器皿，然後加入載體與基因的複合物進行轉染。細胞培養所需的血清通常會影響載體與基因的複合物的穩定性，導致轉染效率的下降，所以大多數轉染是在無血清的條件下進行的，待細胞對複合物的攝取結束後再加入血清進行培養。雖然無血清條件下的轉染可以保全非病毒載體的轉染效率，但是對細胞的正常生長造成了不利影響。為了解決上述基因轉染存在的問題，目前一方面嘗試製備穩定性更佳的載體，另一方面嘗試改變載體加入轉染體系的方式來減輕血清的影響。實驗顯示反向轉染方法能改善血清存在對基因轉染效率的影響。此外，運用非病毒載體進行的基因轉染表達時間短，常規轉染方法對基因藥物的釋放可調控性差，為實現某些基因治療中所需的持續高效基因表達常需要反覆給藥，而反向轉染方法可實現對基因複合物釋放的控制，滿足長期給藥或智能給藥的需要。但現有技術中還未見有關於反向非病毒載體基因轉染方法的報導。
發明內容本發明提供了一種反向非病毒載體基因轉染的方法，採用高分子溶液與細胞培養器皿或生物材料表面進行修飾，再將非病毒載體與基因的複合物結合到細胞培養器皿或生物材料表面後對細胞進行轉染，大大提高了基因轉染的效率。—種反向非病毒載體基因轉染的方法，包括步驟(1)將高分子化合物水溶液與細胞培養器皿或將生物材料細胞培養支架接觸，經孵育後除去液體，製得表面改性的細胞培養器皿或表面改性的生物材料；3(2)將非病毒載體與基因混合，製得非病毒載體與基因的複合物；(3)向表面改性的細胞培養器皿或表面改性的生物材料滴加非病毒載體與基因的複合物，經孵育後再加入待轉染的細胞，進行基因的轉染。所述的高分子化合物可選用本領域常用的高分子化合物，主要包括合成高分子化合物如聚乙二醇(PEG)、多聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)等，以及天然高分子化合物及其衍生物如明膠、陰離子化的明膠、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉、白蛋白等。本發明可優選聚乙二醇、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、明膠、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉或白蛋白中的一種。進一步優選，分子量為20020000的PEG、分子量為6萬30萬的PLL、分子量為80025000的PEI、分子量為l萬15萬的明膠、分子量為5萬100萬的透明質酸或者分子量為50095萬的殼聚糖。所述的高分子化合物水溶液中高分子化合物的濃度優選為50iig/ml10mg/ml。所述的高分子化合物水溶液中還可以添加促進基因轉染的物質，所述的促進基因轉染的物質選自纖維連接蛋白、含有RGD序列的多肽、魚精蛋白或組氨酸中的一種。所述的高分子化合物水溶液中促進基因轉染的物質的濃度優選為10iig/ml5mg/ml。所述的高分子化合物水溶液的zeta電位優選為_50mv50mv。所述的細胞培養器皿和生物材料細胞培養支架均為本領域常用的細胞培養容器，其中，所述的細胞培養器皿可選自常見的細胞培養板、細胞培養瓶或細胞培養皿中的一種，細胞培養板、細胞培養瓶或細胞培養皿的材料一般為聚苯乙烯類材料。所述的生物材料細胞培養支架中採用的材料既可以為可降解生物材料也可以為不可降解生物材料，具體可選自聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、膠原、透明質酸、殼聚糖或聚對苯二甲酸乙二醇酯屬聚酯(PET)中的一種。所述方法中高分子化合物水溶液可以以滴加或浸泡的方式與細胞培養器皿或生物材料細胞培養支架接觸，例如可以將高分子化合物水溶液塗布到細胞培養器皿表面或將生物材料細胞培養支架浸泡到高分子化合物水溶液中，使高分子化合物或者高分子化合物及添加的促進基因轉染的物質充分結合到培養器皿或生物材料表面，對培養器皿或生物材料表面進行修飾，再將非病毒載體與基因的複合物結合到培養器皿或生物材料表面。所述的非病毒載體為本領域常用的細胞轉染用非病毒載體，可選自聚陽離子、脂質體、囊泡、樹突狀大分子化合物，如殼聚糖、聚乙烯亞胺(PEI)、Lipofectamine2000、FuGENE⑧HD、NanoJuice、聚醯胺-胺(PAMAM)等非病毒載體中的一種。所述的非病毒載體與基因的複合物的平均粒徑為5nm5iim。在此粒徑範圍內的非病毒載體與基因的複合物更有利於細胞對其的有效攝取。為了保證高分子化合物能更加充分地結合到培養器皿或生物材料表面，步驟(1)中，所述的孵育時間為lh24h。為了保證非病毒與基因複合物能更加充分地結合到經表面改性的細胞培養器皿或生物材料上，步驟(3)中，所述的孵育時間為0.5h24h。與現有技術相比，本發明具有如下優點本發明運用含有高分子化合物或者高分子化合物及蛋白多肽類促進基因轉染的物質的溶液對細胞培養器皿或生物材料表面進行修，使非病毒載體與基因的複合物可以通過非共價鍵結合到培養器皿或生物材料表面，用於體外基因輸送，且可以直接運用於局部給藥，較直接注射基因複合物可以更好實現靶向性。本發明可以根據基因治療對基因釋放速率及數量的要求調整高分子化合物水溶液的成分，實現基因的智能輸送。本發明操作簡單，各物質都是以溶液狀態加入體系中以非共價鍵進行結合，不涉及專業性要求高的對高分子材料表面的化學改性；另外，本發明所採用的高分子化合物及添加物容易獲得且成本低廉，具有可推廣性；本發明方法安全性與轉染效率均佳，能改善血清存在情況下血清對基因轉染效率的影響，具有很好的應用前景。由於基因治療方案所需治療基因表達持續時間各異，基因複合物從生物材料表面的控制釋放性能就顯得尤為重要，顯然反向轉染方法在此方面較常規轉染方法具有更大的可控性與靈活性。通過改變溶液的酸鹼度、溶液中各成分的比例、高分子化合物的類型、分子量與濃度，可以改變生物材料表面的電性與親水性，進而影響非病毒載體與基因的複合物與細胞培養器皿或生物材料表面的結合與釋放。通過添加可加強細胞與材料粘附作用或可促進基因轉染的蛋白質或多肽，可以增加生物材料的生物相容性以及非病毒載體的轉染效率。圖1為常規轉染方法與本發明反向轉染方法在無血清情況下的轉染效果對比圖2為常規轉染方法與本發明反向轉染方法在無血清情況下的轉染效果對比圖3為常規轉染方法與反向轉染方法在血清體積百分濃度為10%的培養液中的轉染效果對比圖；圖4為常規轉染方法與反向轉染方法在血清體積百分濃度為10%的培養液中的轉染效果對比圖；圖5為PEI/DNA複合物以反向轉染方法轉染HeLa細胞的存活率結果圖。具體實施方式實施例1(1)將PEG(Mw=3400)的濃度為2mg/ml、纖維連接蛋白的濃度為20yg/ml的高分子化合物水溶液塗布到24孔細胞培養板(美國corning公司生產)，孵育4h後除去液體，用PBS緩衝液(即吐溫-20的質量百分濃度為0.05%、pH7.4的磷酸鹽緩衝液)清洗兩次，製得表面改性的細胞培養板。(2)以殼聚糖作為非病毒載體，與含編碼蟲螢光素酶的基因的質粒DNA(即pGL3質粒DNA，浙江大學藥理所)混合製備殼聚糖與DNA的複合物。(3)將殼聚糖與DNA的複合物滴加到上述表面改性的細胞培養板上，孵育2h後加入人宮頸癌HeLa細胞進行轉染。實施例2(1)將透明質酸支架浸泡在PLL(Mw=10萬)的濃度為60iig/ml、含RGD序列的多肽(GRGDSP，由上海生工生物工程公司合成)的濃度為lmg/ml的高分子化合物水溶液中，孵育lh後除去液體，用PBS緩衝液清洗兩次，製得表面改性的透明質酸支架。5(2)以Lipofectamine2000(Invitrogen公司)作為非病毒載體，與pGL3質粒DNA混合製備Lipofectamine2000與DNA的複合物。(3)將Lipofectamine2000與DNA的複合物滴加到上述表面改性的透明質酸支架上，孵育0.5h後加入人肝癌H印G2細胞進行轉染。實施例3(1)將陰離子化明膠(Mw=5萬)的濃度為500iig/ml、魚精蛋白(Sigma公司)的濃度為200i！g/ml的高分子化合物水溶液塗布到細胞培養皿(杭州生友公司生產)，孵育12h後除去液體，用PBS緩衝液清洗兩次，製得表面改性的細胞培養皿。(2)以Fugene⑧HD(羅氏公司生產)作為非病毒載體，與pGL3質粒DNA混合製備FugeneHD與DNA的複合物。(3)將Fugene⑧HD與DNA的複合物滴加到上述表面改性的細胞培養皿上，孵育5h後加入白血病K562細胞進行轉染。實施例4(1)將PLGA支架浸泡在透明質酸(Mw=40萬)的濃度為lmg/ml的高分子化合物水溶液中，孵育24h後除去液體，用PBS緩衝液清洗兩次，製得表面改性的PLGA支架。(2)以聚醯胺PAMAM(Sigma公司)作為非病毒載體，與含編碼綠色螢光蛋白的基因的質粒DNA(pEGFP-Nl質粒DNA，浙江大學傳染病研究所)混合製備PAMAM與DNA的複合物。(3)將PAMAM與DNA的複合物滴加到上述表面改性的PLGA支架上，孵育18h後加入人乳腺HBL細胞進行轉染。實施例5(1)將PET支架浸泡在白蛋白(sigma公司生產)的濃度為8mg/ml、組氨酸的濃度為500iig/ml的高分子化合物水溶液中，孵育6h後除去液體，用PBS緩衝液清洗兩次，製得表面改性的PET支架。(2)以NanoJuice(默克公司生產)作為非病毒載體，與pEGFP-Nl質粒DNA混合製備NanoJuice與DNA的複合物。(3)將NanoJuice與DNA的複合物滴加到上述表面改性的PET支架上，孵育6h後加入大鼠骨髓間充質幹細胞(bMSC)進行轉染。本發明採用如下實驗方法對實施例15進行性能測定1、高分子化合物水溶液zeta電位的測定配置lmg/ml明膠溶液作為對照例，用zeta電位測定儀測量zeta電位，結果見表1。由表1可見，可選用的高分子化合物可具有不同的帶電性質，所帶電荷的多少會影響到體系吸附非病毒載體與基因複合物的量，以及複合物從體系中釋放的速率等。為了實現對複合物釋放量與釋放速率的控制，可根據實際需要選擇不同帶電性質的高分子化合物或對特定高分子化合物進行化學修飾。表1tableseeoriginaldocumentpage72、非病毒載體與基因的複合物的粒徑與zeta電位的測定採用PEI作為非病毒載體，與pGL3質粒DNA(浙江大學藥理所)混合製備載體與DNA的複合物作為對照例，用純水稀釋，利用雷射粒度測定儀測定複合納米粒的粒徑分布，利用zeta電位測定儀測量zeta電位，結果見表2。表2顯示了本發明方法適用於具有不同粒徑與電位分布的非病毒載體與基因複合物，此體系不僅適用於帶正電的複合物，對於常規轉染方法下轉染效率較低的帶負電荷的複合物也可以取得更佳的轉染效果。表2tableseeoriginaldocumentpage73、體外轉染效率測定對照例採用PEI作為非病毒載體，pGL3作為質粒DNA。將一定量載體溶解在一定體積的純水中，與一定濃度的質粒DNA等體積混合，在室溫下孵育15分鐘以獲得載體與DNA的複合物，用純水進行稀釋。(1)常規轉染方法在對照例中以HeLa細胞作為模型細胞。將細胞以每孔5萬個細胞的數量種在24孔板中培養24h，除去培養液，以PBS緩衝液清洗兩遍，加入0.5ml不含小牛血清或小牛血清體積百分濃度為10X的DMEM培養液(GIBCO公司)，將對照例或者實施例中配好的複合物加入到細胞中，放入37t:的C02培養箱培養。對於不含血清組，轉染6小時後吸去轉染液，每孔加0.5ml小牛血清體積百分濃度為10%的DMEM培養液，繼續培養24小時；對於含血清組，轉染液與細胞持續作用24h。對於EGFP質粒，24h後用螢光倒置顯微鏡下觀察轉染情況，拍片記錄。對於pGL3質粒，培養好後不含血清組和含血清組均吸去24孔板中培養液，PBS緩衝液清洗兩次，每孔加入200iU細胞裂解液，靜置5分鐘，小心吹打，吸取細胞於12000rpm、4t:離心兩分鐘。取上清液20y1，加入100iU蟲螢光素酶底物用化學發光儀測定螢光強度。配製濃度為0.5mg/ml的蛋白質水溶液，蒸餾水稀釋至濃度25yg/ml，50yg/ml，100iig/ml，200iig/ml，300iig/ml，400iig/ml，500iig/ml，以每孑L20ii1力口入至lj96孑L板中，每孔再加入200ii1二喹林甲酸(BCA)工作液(碧雲天公司)，595nm紫外測吸光度，繪標準曲線。將所得樣品上清液另取lOiU，稀釋到20iU，加入200iUBCA工作液測吸光光度值，帶入標準曲線得蛋白質含量。採用相對光單位與蛋白質量的比值作為轉染效率的評價指標。(2)反向轉染方法配置海藻酸鈉濃度為200iig/ml、魚精蛋白的濃度為400yg/ml的溶液作為對照例中的高分子溶液。滴加80iU對照例或者實施例中的高分子溶液到24板中，37t:靜置lh，用PBS緩衝液清洗兩次。將對照例或者實施例中製備好的載體與DNA的複合物以每孔40ii1的體積滴加到24板中，37t:靜置30min。對於含血清組，細胞用胰酶消化後加入小牛血清體積百分濃度為10%、雙抗(100U/ml)的DMEM培養液，吹打成細胞懸液，以每孔5萬個細胞的數量加到上述24孔板中培養24h;對於不含血清組，用不含血清的培養液製備細胞懸液，以相同密度種到24孔板，6h後換成小牛血清體積分數為10%的DMEM培養液，繼續培養18h。對於pGL3質粒，按(1)中相同的方法進行蟲螢光素酶檢測與蛋白質濃度測定。採用相對光單位與蛋白質量的比值作為轉染效率的評價指標。對於EGFP質粒，24h後用螢光倒置顯微鏡下觀察轉染情況，拍片記錄。常規轉染方法與本發明反向轉染方法在無血清情況下的轉染效果對比圖，見圖1和圖2;常規轉染方法與反向轉染方法在血清體積分數為10%的培養液中的轉染效果對比圖，見圖3和圖4。圖1、圖2、圖3和圖4顯示，在無血清情況下，反向轉染方法與常規轉染方法的轉染效率無顯著性差異。但當轉染時加入了體積分數為10%的血清時，運用本發明的反向轉染方法可以取得顯著高於常規轉染方法的轉染效果。4、細胞存活率實驗反向轉染方法下細胞存活率測定96孔培養板每孔滴加20ii1對照例或者實施例中用於轉染的高分子化合物水溶液，37t:靜置lh，用PBS緩衝液清洗兩次。每孔滴加10iUPEI與DNA的複合物或者實施例中的複合物，空白對照組加10ii1純水，37t:靜置30min後除去液體。細胞用胰酶消化後加入小牛血清體積百分濃度為10%、雙抗(100U/ml)的DMEM培養液吹打成細胞懸液，以每孔1.5萬個細胞的數量接種到96孔板中培養24h。除去培養液，PBS緩衝液清洗兩次，每孔加入20ii1噻唑蘭(MTT)水溶液(濃度5mg/ml)和80yl培養液，4h後吸去培養液，每孔加入150iU二甲基亞碸(匿SO)，振搖10min，在酶標儀上於570nm測定A值。按以下公式計算細胞生存率(即細胞存活率)。細胞生存率(％)=(樣品的A值/對照組的A值)X100%PEI與DNA的複合物以反向轉染方法轉染HeLa細胞的存活率結果圖，見圖5。由圖5可看出，採用本發明的反向轉染方法轉染HeLa細胞時，細胞存活率良好，表明此轉染方法不會對細胞的生長產生抑制。上述測試結果表明本發明的反向轉染方法能顯著改善血清存在對基因轉染效率的影響，非病毒載體運用反向轉染方法進行轉染安全性良好。8權利要求一種反向非病毒載體基因轉染的方法，其特徵在於，包括步驟(1)將高分子化合物水溶液與細胞培養器皿或生物材料細胞培養支架接觸，經孵育後除去液體，製得表面改性的細胞培養器皿或表面改性的生物材料細胞培養支架；(2)將非病毒載體與基因混合，製得非病毒載體與基因的複合物；(3)向表面改性的細胞培養器皿或表面改性的生物材料細胞培養支架滴加非病毒載體與基因的複合物，經孵育後再加入待轉染的細胞，進行基因的轉染。2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的高分子化合物選自聚乙二醇、多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、明膠、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鈉或白蛋白中的一種。3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的高分子化合物水溶液中高分子化合物的濃度為50iig/ml10mg/ml。4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的高分子化合物水溶液中添加有促進基因轉染的物質，所述的促進基因轉染的物質選自纖維連接蛋白、含有RGD序列的多肽、魚精蛋白或組氨酸中的一種。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的高分子化合物水溶液中促進基因轉染的物質的濃度為lOiig/ml5mg/ml。6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的高分子化合物水溶液的zeta電位為-50mv50mv。7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的細胞培養器皿選自細胞培養板、細胞培養瓶或細胞培養皿中的一種；所述的生物材料細胞培養支架中的生物材料選自聚乳酸-乙醇酸共聚物、膠原、透明質酸、殼聚糖或聚對苯二甲酸乙二醇酯屬聚酯中的一種。8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的非病毒載體選自聚陽離子、脂質體、囊泡、樹突狀大分子化合物中的一種。9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的非病毒載體與基因的複合物的平均粒徑為5nm5iim。10.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述的孵育時間為lh24h;步驟(3)中，所述的孵育時間為0.5h24h。全文摘要本發明公開了一種反向非病毒載體基因轉染的方法，包括步驟(1)將高分子化合物水溶液與細胞培養器皿或將生物材料細胞培養支架接觸，經孵育後除去液體，製得表面改性的細胞培養器皿或表面改性的生物材料；(2)將非病毒載體與基因混合，製得非病毒載體與基因的複合物；(3)向表面改性的細胞培養器皿或表面改性的生物材料滴加非病毒載體與基因的複合物，經孵育後再加入待轉染的細胞，進行基因的轉染。該方法操作簡單，成本低廉，可以顯著提高血清存在情況下非病毒載體的基因轉染效率，且可以對基因複合物的釋放加以控制。文檔編號C12N15/87GK101787375SQ20101010889公開日2010年7月28日申請日期2010年2月10日優先權日2010年2月10日發明者何彩霞,胡瑜蘭,高建青申請人:浙江大學