多孔矽微腔生物傳感器及其製備方法
2023-08-02 19:01:46
專利名稱：多孔矽微腔生物傳感器及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物傳感領域，具體涉及到一種基於多孔矽微腔結構的多通道生物傳感器、基於這種生物傳感器的光學檢測系統及這種生物傳感器的製備方法。
背景技術：
生物物質檢測技術對現代醫療技術的發展起著十分重要的作用，對生物分子類型、含量的準確測定是疾病診斷與治療的依據，也是醫藥研製中至關重要的環節。目前，應用較為廣泛的生物檢測技術是對生物樣品使用某種分子進行標記，然後通過測定標記物含量間接獲得被標記生物物質濃度。該方法的缺點是會受到較大的背景噪聲幹擾，降低了信號的可靠性，而且待檢生物分子活性也會受到影響。基於這樣的原因，免標記的基於表面等離子體共振(SPR)的生物分子檢測技術也得到了部分應用。但是這種方式的缺點在於，SPR生物分子檢測儀屬於大型儀器，製備成本高昂，操作複雜，需要培訓專門的檢驗人員。對比上述傳統檢測方法，免標記生物傳感器具有專一性強、分析速度快、操作簡單、成本低廉、靈敏度高等諸多優點。其中，基於多孔矽微腔結構的生物傳感器具有以下幾個優點
一、採用光學方法檢測，無須標記，通過對微腔的光譜信號進行分析可以迅速得到結
論；
二、多孔矽具有海綿狀結構，比表面積大，這在特異性檢測中增大檢測的動態範圍，更重要的是，考慮到sra利用生物分子與衰減場作用，且生物分子只在二維平面內與該衰減場作用，多孔矽微腔使用光子晶體的振蕩場與生物分子作用，且多孔材料三維表面內均可以附著生物分子與振蕩場作用，從而提高了檢測靈敏度；
三、多孔矽薄膜折射率可通過改變其微觀結構進行調節；
四、多孔矽表面化學性能易於調節，可使用各種生物分子進行修飾從而實現特異性檢
測；
五、多孔矽薄膜易於集成成為傳感器陣列，獲得高通量檢測。目前基於多孔矽微腔結構的生物傳感器以矽基底為主，例如公開號為 CN101710118A為的中國發明專利公開了一種基於多孔矽三元結構微腔的光學免疫檢測方法，其缺點是這樣的傳感器利用效率較低，一個矽基底上只能製備一個傳感器，傳感器失效後連同矽基底要一同棄置。此外，為了提高檢測準確性，常常需要進行多次檢測，這同樣會使用大量的傳感器樣品以及待測溶液，在一定程度上造成了浪費，並且在很多情況下，待測樣品可供檢測的量非常有限。
發明內容
針對上述缺陷，本發明的目的是提供一種多孔矽微腔生物傳感器、基於這種傳感器的光學檢測系統以及這種生物傳感器的製備方法，以解決現有技術的生物分子監測設備存在的成本高昂，操作複雜、檢測準確性低的技術問題。為實現上述目的，本發明採用了以下的技術方案
本發明首先提供一種多孔矽微腔生物傳感器，包括上Bragg反射鏡、下Bragg反射鏡以及夾在所述上Bragg反射鏡和下Bragg反射鏡之間的缺陷曾，所述上Bragg反射鏡和下 Bragg反射鏡分別包括五個周期循環交替排列的高多孔率層和低多孔率層，所述缺陷曾厚度為所述高多孔率層厚度的2倍。依照本發明較佳實施例所述的多孔矽微腔生物傳感器，所述高多孔率層由80mA/ cm2的電流腐蝕而成，所述低多孔率層由20mA/cm2的電流腐蝕而成.
本發明再提供一種基於上述生物傳感器的光學檢測系統於，其包括滷素燈光源、複數個帶有多孔矽微腔生物傳感器的檢測通道，計算機、光開關、光譜儀以及液流系統，所述滷素燈發出的光源經過分裂光纖進入所述檢測通道，所述分裂光纖的明哥哥分支通過適配器與所述檢測通道的每個分叉光纖相連，所述多孔矽微腔生物傳感器的反射光由所述分叉光纖另一分支傳輸到所述光開關，所述光開關在所述電腦控制下切換光路，選擇進入光譜儀的光信號，所述光譜儀將處理所述光信號後的數據傳送到所述計算機，在所述計算機中運算顯示檢測結果。本發明再提供一種上述多孔矽微腔生物傳感器的製備方法，該種製備方法包括以下步驟步驟1 基於P型矽片製備多孔矽微腔薄膜樣品；步驟2 製備多孔矽微腔薄膜陣列；步驟3 根據檢測需求對不用的傳感通道進行相應生物化學修飾改性。依照本發明較佳實施例所述的製備方法，所述步驟1進一步包括步驟1. 1 沿晶向將硼雙面拋光矽片切成2釐米乘以2釐米的方形樣品，依次使用去離子水和95%分析純酒精溶液衝洗矽片樣品，然後用高純氮氣吹乾樣品備用；步驟1. 2 在聚四氟乙烯製成的腐蝕槽中腐蝕所述樣品；步驟1. 3 咋計算機控制下控制電流密度和時間對樣品進行腐蝕。依照本發明較佳實施例所述的製備方法，在所述步驟1. 2中以鋁片作為陽極，鉬絲作為陰極，腐蝕液由41. 2%的分析純氫氟酸水溶液和95%的分析純酒精以1 :1. 5的體積比混合而成。依照本發明較佳實施例所述的製備方法，所述步驟2進一步包括步驟2. 1:施加200mA/cm2的電流2秒，使多孔矽微腔結構從襯底剝離，製成多孔矽微傳感器薄膜；步驟2. 2 將製得的多孔矽微腔傳感器薄膜浸泡於DMSO純溶液中5小時進行溼法氧化；步驟 2. 3 將氧化後的薄膜浸泡於足量DI水中10分鐘，以去除殘留的DSMO溶液；步驟2. 4 在清洗乾淨的玻璃基板上滴加一系列聚乙烯醇縮甲醛(Formvar)溶液液滴，溶劑是1，2- 二氯乙烷。然後將氧化後的多孔矽微腔薄膜迅速置於formvar溶液上，待1，2-二氯乙烷蒸發後， formvar就將多孔矽微腔薄膜牢牢粘於玻璃基底之上。由於採用了以上的技術方案，使得本發明相比於現有技術，具有如下的優點和積極效果
第一、本發明提供了一種多通道光學多孔矽微腔薄膜生物傳感器製備方法，使用移植於玻璃基底上的多孔矽微腔薄膜作為傳感器件，剩下的矽基底可以繼續腐蝕製備多孔矽微腔薄膜，從而提高了矽片的使用效率，進一步降低了檢測成本；
第二，本發明根據使用的液流腔設計，一次電化學腐蝕出的薄膜樣品能夠被分割成多個面積更小的傳感器，這在不降低信號強度的前提下提高了傳感器的使用效率。面積更小的傳感器單元消耗的待測溶液量也更少，節省了待測溶液。第三、同一次腐蝕得到的傳感器性能彼此接近，諧振峰位置一致，可以將其中一路作為參比通道，用於流過不含待測物質的純緩衝溶液，進一步提高檢測的可靠性，多通道檢測使得在一次檢測操作中能夠獲得多組實驗數據，從而提高檢測效率。第四、本發明提供的光學檢測系統除了設置參比通道，多通道還可以用於同時檢測不同的生物分子而不會互相干擾，從而提高檢測效率。尤其是目前醫學研究發現診斷疾病往往需要多種生物標記物(biomarker)的檢測作為依據，需要綜合多個生物標記物含量分析判斷。可以使用本發明技術方案，對不同的檢測通道進行不同的抗原、抗體分子修飾， 一次實驗就可以檢測多個生物標記物。當然，實施本發明內容的任何一個具體實施例，並不一定同時達到以上全部的技術效果。
圖1是本發明提供的多孔矽微腔生物傳感器結構示意圖； 圖2是液流腔的頂部視圖3是本發明提供的多通道光學檢測系統框圖； 圖4是實施本發明提供的製備方法的流程圖。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的幾個優選實施例進行詳細描述，但本發明並不僅僅限於這些實施例。本發明涵蓋任何在本發明的精髓和範圍上做的替代、修改、等效方法以及方案。為了使公眾對本發明有徹底的了解，在以下本發明優選實施例中詳細說明了具體的細節，而對本領域技術人員來說沒有這些細節的描述也可以完全理解本發明。另外，為了避免對本發明的實質造成不必要的混淆，並沒有詳細說明眾所周知的方法、過程、流程、元件和電路等。如圖1所示，如圖1所示的多孔矽微腔傳感器結構，它由上Bragg反射鏡1、下 Bragg反射鏡2以及它們所夾的缺陷層3組成。Bragg反射鏡1、3均由五個周期的高多孔率層4、低多孔率層5構成。高多孔率層4由80mA/cm2的電流密度腐蝕而成，低多孔率層5 由20mA/cm2的電流密度腐蝕而成，缺陷層是高多孔率層4厚度的二倍。制好的微腔結構再施加200mA/cm2的腐蝕電流2秒使其從矽基底上脫離。暴露的矽基底可以再次按照上述方法進行腐蝕多孔矽微腔並取膜，提高了對矽片的利用率，從而進一步降低了檢測成本。接下來將制好的微腔薄膜浸泡於DSMO中5小時後取出。接下來按圖2所示製備液流腔。首先將formvar溶液滴於載玻片上，再將多孔矽微腔薄膜樣品迅速置於其上，待溶劑1，2-二氯乙烷揮發後，薄膜便被粘於載玻片上。接下來要根據實際檢測需求對多孔矽微腔薄膜進行化學修飾，嫁接相應的探針生物分子。修飾完畢後，將液流腔貼於多孔矽微腔薄膜之上，出入口 11作為待測溶液進出腔室的通道，而兩個半圓形12為液流腔室，形成兩個檢測通道。由於本發明中腐蝕得到的多孔矽薄膜樣品為圓形，故液流腔室也設計為圓形，從而提高傳感器有效使用面積。其餘檢測通道可依此法進行製備。
如圖3所示，本發明提供的圖3學檢測系統包括了其包括滷素燈光源31、複數個帶有多孔矽微腔生物傳感器351的檢測通道35，計算機39、光開關37、光譜儀38以及液流系統36，由滷素燈31光源發出的光通過分裂光纖32同時進入各個檢測通道35，其各個分支使用適配器33與分叉光纖34的一個分支相連，光由此可以傳到多孔矽微腔生物傳感器 351表面，其反射光同時由分叉光纖34收集並由分叉光纖34另一分支傳入光開關，光開關 37根據計算機39端傳來的信號切換光路，特定的時間段內只有一路光信號進入光譜儀38， 光譜儀38處理後的數據送入計算機39，並最後由計算機39進行運算顯示檢測結果。如圖4所示，本發明提供一種製備上述多孔矽微腔生物傳感器的方法，包括
5401基於ρ型矽片製備多孔矽微腔薄膜樣品；
5402製備多孔矽微腔薄膜陣列；
5403並根據實際檢測需求對不同的傳感通道進行相應的生物化學修飾改性；
在完成之後，搭建多通道光學檢測系統對多孔矽微腔薄膜傳感器陣列進行信號檢測。基於ρ型矽片製備多孔矽微腔薄膜樣品又包含以下工序
首先，矽片切割；所使用矽片為P型摻雜元素為硼(100)雙面拋光矽片。沿晶向切成2釐米乘以2釐米的方形樣品。依次使用去離子水和95%分析純酒精溶液衝洗矽片樣品，然後用高純氮氣吹乾樣品備用；
第二，腐蝕在聚四氟乙烯製成的腐蝕槽中進行。鋁片作為陽極，鉬絲作為陰極，腐蝕液由41. 2%的分析純氫氟酸水溶液和95%的分析純酒精以1 :1. 5的體積比混合而成。第三，腐蝕的電流密度與時間由計算機進行精確控制。多孔矽微腔結構由兩個 Bragg反射鏡層以及其所夾的缺陷層組成。其中的Bragg反射鏡層由若干周期的高、低多孔率的多孔矽層交疊而成，電流參數由仿真和實驗得出。這樣電化學腐蝕得到的是垂直於矽片表面的一維光子晶體材料。夾在中間的缺陷層會在傳感器反射率譜線中的高反射帶中間引入一個極窄的諧振峰，它是結構靈敏參數，諧振峰對應的波長由缺陷層折射率影響。因此，當加入的被檢測生物分子進入缺陷層中後，諧振峰會發生相應的移動，從而能夠根據移動量的多少來判斷所加入的生物分子濃度值。步驟S402製備多孔矽微腔薄膜陣列包含以下工序
1、施加200mA/cm2的電流2秒，這可以將多孔矽微腔結構最下面一層與矽基底交界處的矽全部腐蝕，從而使多孔矽微腔結構從襯底剝離，製成多孔矽微腔薄膜；
2、將製得的多孔矽微腔薄膜浸泡於DMSO純溶液中5小時進行溼法氧化。這是由於製得的多孔矽表面有大量的矽氫鍵，矽氫鍵疏水且不穩定，從而會導致生物分子水溶液不易滲入以及諧振峰隨時間發生漂移。而當矽表面氧化後，表面親水而且非常穩定，生物分子溶液易進入孔內到達缺陷層。通常的高溫氧化辦法不適用於多孔矽薄膜，這裡採用溼法氧化的辦法，在DMSO中浸潤5小時後，實驗表明，認為多孔矽表面基本被氧化，矽氫鍵由矽氧鍵代替；
3、將氧化後的薄膜浸泡於足量DI水中10分鐘，以去除殘留的DSMO溶液；
4、在清洗乾淨的玻璃基板上按一定順序滴加一系列0.25%聚乙烯醇縮甲醛(formvar) 溶液液滴，溶劑是1，2- 二氯乙烷。然後將氧化後的多孔矽微腔薄膜迅速置於formvar溶液上。待1，2- 二氯乙烷蒸發後，formvar就將多孔矽微腔薄膜牢牢粘於玻璃基底之上；
之後，執行步驟S403，根據實際檢測需要再對多孔矽傳感器進行化學修飾。
在製備完成後，將液流腔貼於多孔矽微腔薄膜上，並將液體出入通道與液流系統相連，再連接多通道光學系統。使用分裂多模光纖將光源白光分成多路，各分光路使用適配器與分叉光纖一個分支相連，分叉光纖一方面將入射白光傳輸到傳感器表面，另一方面採集傳感器反射回來的光信號，並通過分叉光纖的另一分支輸入光路切換開關。光路切換開關以一定的頻率對光路進行切換，在某一特定的時間片內其輸出為一個特定的光路，光開關的輸出作為光纖光譜儀的輸入，對光信號進行實時採集分析，並通過電腦將結果進行顯示。以下簡要說明本發明的兩個應用例。應用例一
本應用例是使用多通道的多孔矽微腔生物傳感器檢測M鹼基對DNA單鏈分子，其包
括
首先，按照具體實施方式
中描述的方法製取多孔矽微腔樣品； 之後，按照具體實施方式
中描述的方法將多孔矽微腔從矽基底取下進行溼法氧化，並使用formvar貼於載玻片上；
最後，在多孔矽微腔內連接DNA探針分子，其具體包括步驟為 1.在多孔矽微腔薄膜表面滴加50 μ L濃度為21的APTES溶液。靜置20分鐘後用DI 水衝洗並用氮氣吹乾，置於100°C環境中烘烤10分鐘取出。2.在樣品表面按順序滴加100 μ L的2. 5%的戊二醛溶液，1 μ L的5mol/L的氰基硼氫化鈉(sodium cyanoborohydride)和Imol/L的NaOH溶液。在上述混合液中浸泡2小時。3.將傳感器樣品HEPES緩衝液衝洗並再次浸泡於其中1小時。之後再用緩衝液衝洗樣品表面並用氮氣吹乾。4. DNA探針分子的連接應在上一步醛基化的30分鐘內進行。將多孔矽微腔樣品浸泡於氨基修飾的DNA探針分子緩衝液中。之後重複步驟3。5.接下來傳感器樣品在3mol/L乙醇胺(ethanolamine)中浸泡2小時。之後重複
步驟3 ο6.將液流腔貼於處理完畢的多孔矽微腔之上，並將進液與出液口與液流系統相連。7.檢測DNA，連接外部多路光學檢測系統，調節蠕動泵緩慢將待測DNA緩衝液泵入液流腔內，待其全部充滿即停止，靜置1小時後，再泵入足量緩衝液進行衝洗未連接DNA樣品。此過程全程由光譜儀動態記錄。同時，液流腔所分的兩部分一部分作為檢測通道，另一部分作為對照通道，整個檢測過程中只通入緩衝液。應用例二
在本應用例中，使用多通道的多孔矽微腔生物傳感器檢測大腸桿菌(E-Coli)胞外親密素(Intimin-IBD)
首先，按照具體實施方式
中描述的方法製取多孔矽微腔樣品； 之後，按照具體實施方式
中描述的方法將多孔矽微腔從矽基底取下進行溼法氧化，並使用formvar貼於載玻片上；
然後，在多孔矽微腔內連接轉位緊密素抗體(translocation intiminreceptor-intimin binding domain, Tir-IBD),具體包括步驟為
1.在多孔矽微腔薄膜表面滴加50 μ L濃度為21的APTES溶液。靜置20分鐘後用DI 水衝洗並用氮氣吹乾，置於100°C環境中烘烤10分鐘取出。2.將樣品浸於20mM的HEPES緩衝液中，再滴加50 μ L的2. 5%的戊二醛溶液。靜置30分鐘後取出，使用HEPES緩衝液衝洗，並用氮氣吹乾。3.在傳感器樣品表面滴加50 μ L的Tri-IBD溶液，靜置1小時。再將樣品浸泡於 HEPES緩衝液中20分鐘。之後用氮氣吹乾。4.滴加5(^1^農度為1!1101/1的817(^1^ methyl ester，靜置1小時。再將樣品浸泡於HEPES緩衝液中20分鐘。之後用氮氣吹乾。5.將液流腔貼於處理完畢的多孔矽微腔之上，並將進液與出液口與液流系統相連。6.檢測htimin-IBD。連接外部多路光學檢測系統，調節蠕動泵緩慢將待測 Intimin-IBD緩衝液泵入液流腔內，待其全部充滿即停止，靜置1小時後，再泵入足量緩衝液進行衝洗未連接的htimin-IBD樣品。此過程全程由光譜儀動態記錄。同時，液流腔所分的兩部分一部分作為檢測通道，另一部分作為對照通道，整個檢測過程中只通入緩衝液。本發明優選實施例只是用於幫助闡述本發明。優選實施例並沒有詳盡敘述所有的細節，也不限制該發明僅為所述的具體實施方式
。顯然，根據本說明書的內容，可作很多的修改和變化。本說明書選取並具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發明的原理和實際應用，從而使所屬技術領域技術人員能很好地利用本發明。本發明僅受權利要求書及其全部範圍和等效物的限制。
權利要求
1.一種多孔矽微腔生物傳感器，其特徵在於，包括上Bragg反射鏡、下Bragg反射鏡以及夾在所述上Bragg反射鏡和下Bragg反射鏡之間的缺陷曾，所述上Bragg反射鏡和下 Bragg反射鏡分別包括五個周期循環交替排列的高多孔率層和低多孔率層，所述缺陷曾厚度為所述高多孔率層厚度的2倍。
2.如權利要求1所述的多孔矽微腔生物傳感器，其特徵在於，所述高多孔率層由80mA/ cm2的電流腐蝕而成，所述低多孔率層由20mA/cm2的電流腐蝕而成.一種光學檢測系統，其特徵在於，包括商素燈光源、複數個帶有多孔矽微腔生物傳感器的檢測通道，計算機、光開關、光譜儀以及液流系統，所述滷素燈發出的光源經過分裂光纖進入所述檢測通道，所述分裂光纖的明哥哥分支通過適配器與所述檢測通道的每個分叉光纖相連，所述多孔矽微腔生物傳感器的反射光由所述分叉光纖另一分支傳輸到所述光開關，所述光開關在所述電腦控制下切換光路，選擇進入光譜儀的光信號，所述光譜儀將處理所述光信號後的數據傳送到所述計算機，在所述計算機中運算顯示檢測結果。
3.如權利要求3所述的光學檢測系統，其特徵在於，所述多孔矽微腔生物傳感器包括上Bragg反射鏡、下Bragg反射鏡以及夾在所述上Bragg反射鏡和下Bragg反射鏡之間的缺陷曾，所述上Bragg反射鏡和下Bragg反射鏡分別包括五個周期循環交替排列的高多孔率層和低多孔率層，所述缺陷曾厚度為所述高多孔率層厚度的2倍。
4.一種多孔矽微腔生物傳感器的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟步驟1 基於P型矽片製備多孔矽微腔薄膜樣品；步驟2 製備多孔矽微腔薄膜陣列；步驟3 :根據檢測需求對不用的傳感通道進行相應生物化學修飾改性。
5.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟1進一步包括步驟1. 1 沿晶向將硼雙面拋光矽片切成2釐米乘以2釐米的方形樣品，依次使用去離子水和95%分析純酒精溶液衝洗矽片樣品，然後用高純氮氣吹乾樣品備用；步驟1. 2 在聚四氟乙烯製成的腐蝕槽中腐蝕所述樣品；步驟1. 3 咋計算機控制下控制電流密度和時間對樣品進行腐蝕。
6.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，在所述步驟1.2中以鋁片作為陽極，鉬絲作為陰極，腐蝕液由41. 2%的分析純氫氟酸水溶液和95%的分析純酒精以1 :1. 5的體積比混合而成。
7.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟2進一步包括步驟2. 1 施加200mA/cm2的電流2秒，使多孔矽微腔結構從襯底剝離，製成多孔矽微傳感器薄膜；步驟2. 2 將製得的多孔矽微腔傳感器薄膜浸泡於DMSO純溶液中5小時進行溼法氧化；步驟2. 3 將氧化後的薄膜浸泡於足量DI水中10分鐘，以去除殘留的DSMO溶液；步驟2. 4 在清洗乾淨的玻璃基板上滴加一系列聚乙烯醇縮甲醛(Formvar)溶液液滴， 溶劑是1，2-二氯乙烷。
8.然後將氧化後的多孔矽微腔薄膜迅速置於formvar溶液上，待1，2-二氯乙烷蒸發後，formvar就將多孔矽微腔薄膜牢牢粘於玻璃基底之上。
全文摘要
本發明提供一種多孔矽微腔生物傳感器、這種生物傳感器的製備方法以及基於這種傳感器的光學檢測系統，所述多孔矽微腔生物傳感器包括上Bragg反射鏡、下Bragg反射鏡以及夾在所述上Bragg反射鏡和下Bragg反射鏡之間的缺陷曾，所述上Bragg反射鏡和下Bragg反射鏡分別包括五個周期循環交替排列的高多孔率層和低多孔率層，所述缺陷曾厚度為所述高多孔率層厚度的2倍。本發明具有檢測效率高、結構簡單、檢測精確等優點。
文檔編號G01N21/41GK102313717SQ20111021965
公開日2012年1月11日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者吳超, 祝永新, 榮國光 申請人:上海交通大學