一種量子點生物探針及其製備方法和基於其的微流控蛋白質晶片的製作方法

2023-08-03 05:58:46

專利名稱：：一種量子點生物探針及其製備方法和基於其的微流控蛋白質晶片的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物檢測領域，特別涉及一種量子點生物探針及其製備方法和基於其的微流控蛋白質晶片。
背景技術：
：目前，蛋白質晶片中的檢測探針多採用傳統生物螢光染料，如常用的有嗅乙錠、諾丹明等，這類染料只能進行單色標記，且其穩定性差，靈敏度也受到限制，越來越難以滿足蛋白質晶片的實際需要。納米量子點是一類由n-vi族或m-v族元素組成的半徑小於或接近激子波爾半徑的半導體納米粒子，具有獨特的光電性質，比生物醫學研究中常用的傳統螢光發色團更易檢測到。納米量子點具有特有的量子尺寸效應和表面效應，相對於傳統的螢光染料分子用納米量子點作標記物具有許多優點激發光譜寬，發射光譜窄、對稱，螢光發射波長可通過改變量子點的尺寸和組分而加以調節，因而不同尺寸的量子點能被單一波長的光激發而發射不同顏色的螢光，方便用於多目標分子的多色標記。因此量子點作為一類新型的螢光標記物，在分子生物學、免疫生物學、臨床醫學等生物醫學領域顯示出越來越誘人的應用前景。目前納米量子點，主要是有機相量子點已被應用於常規體外分析(US2001/0023078、CN1515909)或傳感器製作(US6379622),以及作為生物偶聯的光學成像探針進行組織和細胞的研究(WO2006/001848、WO2006/005065)等。但在蛋白質晶片中的應用還很少見。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種用於蛋白質晶片的量子點生物探針及其製備方法，其中量子點選用水溶性量子點。本發明人在研究中發現，水溶性量子點在生物分子特別是蛋白質標記中的技術及應用，與傳統量子點(有機相量子點)在功能和特質上表現出明顯的不同。與有機相量子點相比，水溶性量子點與生物分子具有更好的親和性，通過兩者之間更高效率的偶聯，可以獲得更高性能的"量子點-生物"複合探針；另外，因為水溶性量子點無有機試劑殘留，所以對生物分子(特別是蛋白質)的活性損傷可以減至最小，可以更好地發揮生物探針的結合性能。因此，本發明提供的一種量子點生物探針，其是水溶性量子點和靶蛋白配體連接而成的量子點-生物複合探針。根據本發明，所說的水溶性量子點是指採用水相法製備的暈子點，即在製備過程中未使用有機試劑，如可以根據CN1693206A、CN1693207A、CN1693208A、CN1687304A及CN1793923等專利文獻中公開的方法製備。本發明優選CdTe及核殼量子點CdTe/CdS等水溶性量子點為例來進行說明。根據本發明，所述的靶蛋白配體為各種可與靶蛋白質分子特異性結合的生物分子，如免疫球蛋白、抗體片斷、核酸適體、融合蛋白和蛋白質複合體等。而本發明所述的量子點生物探針的製備方法，其包括水溶性量子點和靶蛋白配體進行偶聯反應，並將偶聯產物進行純化。從理論上說，可以通過調整量子點與靶蛋白配體之間的比例，在量子點表面連接一個或一個以上不同數目的靶蛋白配體。為減少交聯物的形成，水溶性量子點與配體的配比優選為摩爾比1:11:20，優選1:31:10(根據後面實施例概括出)，故通常每個水溶性量子點上組裝120個，更優選115個靶蛋白配體分子。在配體分子與量子點之間通過物理吸附結合的基礎上，為製備更穩定的複合探針，更佳地可以選擇化學偶聯方式增強二者之間的有效連接；換言之，本發明偶聯反應中還可採用偶聯劑，諸如生物偶聯反應中常選用的碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺等。當本發明靶蛋白配體選用核酸適體時，按目前DNA分子組裝常用的方法通常選用用於調節核酸類分子界面組裝密度的多聚腺苷酸(T10)作為共組裝物。同其他生物偶聯反應，本發明反應完畢後需進行純化，即除去未反應的原料及副產物。所述的純化方法也可以選用現有技術，例如離心、超濾等方法。其中超濾可選用不同級別超濾管來分別除去小分子和大分子物質，如採用40k超濾管超濾除去未反應的量子點和小分子副產物後，截留液再採用500k超濾管超濾除去未反應的靶蛋白配體和大的交聯物，收集濾過液，得到偶聯物。由於不同粒徑和結構的量子點具有不同螢光，故可以將不同粒徑和/或結構的量子點與不同的靶蛋白配體進行偶聯反應得到各種偶聯物，作為蛋白質晶片中的多色信號探針(檢測探針)。因此，本發明還提供一種微流控蛋白質晶片，其包括靶蛋白、捕獲探針和信號探針，其中信號探針採用上述本發明的量子點生物探針。根據本發明，當所述的微流控蛋白質晶片為單向微流控蛋白質晶片時，其中不同靶蛋白所對應的作為信號探針的生物探針帶有不同螢光光譜的量子點。具體來說在單向微流控晶片反應區域固定多種靶蛋白捕獲探針，各種探針在該區域按一定比例均勻分布；當靶蛋白樣品通過微流控通道流經該區域時，各種靶蛋白被相應的捕獲探針捕獲並結合為一級複合物；然後通過微流動力系統及微型管道將包含有不同量子點標記的信號探針引入反應區域，並與所形成的各種一級複合物結合，形成各種二級複合物；每種靶蛋白所對應的二級複合物含有一種量子點納米粒子，不同的靶蛋白對應不同的量子點，具有不同螢光光譜；在一定發射光譜範圍內測量各種量子點的螢光強度，即可獲得相應靶蛋白的定性和定量信息。當所述的微流控蛋白質晶片為雙向微流控蛋白質晶片，其中不同靶蛋白所對應的作為信號探針的生物探針可以帶有相同螢光光譜的量子點。具體來說通過一個方向的多條微流控管道在微流控晶片反應區域固定多種靶蛋白捕獲探針，每條微型管道對應一種捕獲探針；樣品通過與前一方向非平行的一條或多條微型管道流經晶片反應區域，並與其呈交叉狀態，靶蛋白與相應交叉區域的對應捕獲探針結合形成一級複合物；然後通過微流動力系統及微型管道將包含有相同量子點標記的不同信號探針引入反應區域，並與所形成的各種一級複合物結合，形成各種二級複合物；各種靶蛋白所對應的二級複合物均含有相同量子點納米粒子，具有相同的螢光光譜；在同一固定波段測定量子點的螢光強度，各種二級複合物將在蛋白質晶片的特定空間位置上給出與靶蛋白數量對應的信號強度，經後續數據分析可以實現特定靶蛋白的定性和定量分析。本發明通過水溶性量子點表面所固有的金屬-非金屬鍵，實現與靶蛋白配體的偶聯，構建多色信號探針，螢光量子效率達到60%以上，蛋白質配體活性保持在50。％以上。圖1為基於本發明水溶性CdTe量子點探針的雙向微流控蛋白質晶片分析圖。'具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。實施例中的水溶性量子點根據現有技術自行製備。其中，不同最大發射波長CdTe/CdS量子點的製備，可以通過控制CdS殼外延生長的反應時間進行控制CdS殼的厚度，從而實現調控不同粒徑CdTe/CdS量子點的目的。實施例1~31、水溶性CdTe量子點的製備(直徑3nm左右)，根據CN1693206A中公開的方法製備(1)碲氫化鈉製備將92.7毫克NaBH4固體和127.6毫克Te粉放入到一個小的燒瓶中，加入3毫升水，於15T:下反應7個小時後，可得到NaHTe溶液備用；(2)CdTe前體溶液製備將30毫克CdCl2溶於100毫升水，加入0.03毫升巰基乙酸，用0.5摩爾/升的NaOH溶液調節pH=9，注入0.3毫升NaHTe溶液，作為CdTe前體溶液；(3)程序控制微波輻射製備CdTe量子點將所得到的CdTe前體溶液進行程序控制微波輻射，可得到CdTe量子點。控制條件如下第一程序微波功率70W;第一程序溫度:80°C;第一程序時間60s;第二程序微波功率300W;第二程序溫度ll(TC;第二程序時間5min。2、將250uL水溶性CdTe量子點(10uM)、240uL巰基衍生的凝血酶核酸適體(實施例1)、巰基衍生的血小板生長因子核酸適體(實施例2)或巰基衍生的免疫球蛋白E蛋白核酸適體(實施例3)lOOuM(0.5MPBS，0.1%NaN3，pH6.5)、200uM多聚腺苷酸(T10)混合，室溫反應16小時後，逐歩加入NaCl至濃度為3M，室溫老化40小時。3、將步驟2反應液採用10000G離心20分鐘，去除上清液，純淨水洗漆；反覆離心洗滌35次，所得沉澱用PBS重懸浮。4、測定懸浮液在波長260nm處的紫外吸收，並用螢光分析儀檢測螢光強度，通過標準曲線插入法計算得出，每個量子點所偶聯的核酸配體分子數約為6-15個。螢光光譜法測得螢光量子效率達到70%，雜交分析法測得配體活性保持在95%。上述實施例中各核酸適體由上海生工生物工程公司合成。實施例4~51、水溶性CdTe/CdS量子點的製備，根據CN1693207A中公開的方法製備(1)碲氫化鈉製備將90.5毫克NaBH4固體和91.2毫克Te粉放入到一個小的燒瓶中，加入3毫升水，於10攝氏度下反應10個小時後，可得到NaHTe溶液，備用；(2)CdTe量子點製備將22.5毫克CdCl2溶於100毫升水，加入0.03毫升巰基乙酸，用0.5摩爾/升的NaOH溶液調節pH=9.5,通氮氣30分鐘，升溫至100攝氏度，注入0.2毫升NaHTe溶液，反應3小時，得到CdTe量子點溶液；(3)CdTe/CdS前體溶液製備將18.5毫克CdCl2和5.6毫克Na2S溶於IOO毫升水，加入0.06毫升巰基乙酸，用0.5摩爾/升的NaOH容顏調節pH=10.5，注入10毫升CdTe量子點溶液，得到CdTe/CdS前體溶液；(4)微波輻射製備CdTe/CdS核/殼型量子點將所得到的CdTe/CdS前體溶液進行微波輻射製備，可得到CdTe/CdS核/殼型量子點。微波輻射條件如下微波功率50W;溫度IO(TC;時間lmin(實施例4);3min(實施例5)。分別得到最大發射波長為535nm和547nm的兩種CdTe/CdS型核/殼量子點。2、將250uL兩種不同螢光波長的水溶性CdTe/CdS量子點(10uM)分別與240uL的CA50(所用量子點的最大發射波長為535nm，實施例4)和CA125(所用量子點的最大發射波長為547nm，實施例5)兩種腫瘤標誌蛋白的多克隆抗體(商購自美國FITZGERALD公司)30uM(0.5MPBS，0.1%NaN3，pH7.5)混合，室溫反應2小時後，(C過夜。3、反應液採用40k超濾管(美國PALL公司)，3000G離心3分鐘，去除未反應的量子點和副產物，收集上層溶液。4、收集液採用500k超濾管(美國PALL公司)，3000G離心3分鐘，去除由多個抗體和量子點聚合形成的交聯物，收集下層濾液。5、測定濾液在波長280nm處的紫外吸收，並用螢光分析儀檢測螢光強度。通過標準曲線插入法計算得出，每個量子點所偶聯的免疫球蛋白分子數約為15個。螢光光譜法測得螢光量子效率達到60%，免疫分析法測得蛋白質配體活性保持在75%。實施例6~71、水溶性CdTe/CdS量子點的製備實驗過程基本同實施例45，微波輻射條件如下微波功率50W;溫度IOO'C;時間5min(實施例6);10min(實施例7)。分別得到最大發射波長為559nm和579nm的兩種CdTe/CdS型核/殼量子點。2、將250uL兩種不同螢光波長的水溶性CdTe/CdS量子點(10uM)分別與240uLCA19-9(所用量子點的最大發射波長為559nm，實施例6)或CA15-3(所用量子點的最大發射波長為579nm，實施例7)兩種腫瘤標誌蛋白的多克隆抗體(商購自美國FITZGERALD公司)30uM(0.5MPBS，0.1%NaN3，pH7.3)，以及5uL碳化二亞胺(500mM)和5uLN-羥基琥珀醯亞胺(100mM)混合，室溫反應2小時後，4t過夜。3、反應液採用40k超濾管(美國PAIX公司)，3000G離心3分鐘，去除未反應的量子點和異脲副產物，收集上層截留溶液。4、收集液採用500k超濾管，3000G離心3分鐘，去除由多個抗體和量子點交聯形成的聚合物，收集下層濾液。5、測定濾液在波長280nm處的紫外吸收，並用螢光分析儀檢測螢光強度。通過標準曲線插入法計算得出，每個量子點所偶聯的免疫球蛋白分子數約為15個。螢光光譜法測得螢光量子效率達到60%，免疫分析法測得蛋白質配體活性保持在75%。實施例8採用聚二甲基矽氧烷(PDMS)製備平行的單向微流控通道，方法可參考現有技術[如Duffy,DC等，《AnalyticalChemistry》第70巻(1998年)第4974頁]。該微通道與晶片基片通過表面等離子體技術進行不可逆封合。1、將CA50、CA125、CA19-9和CA15-3等4種腫瘤標誌蛋白的單克隆抗體通過1條單向微流控通道內固定在通道與晶片反應區的接觸區域，4種抗體的濃度均為200mg/L，2小時後進行洗滌和封閉等後處理，方法可參考現有技術(如專利文獻03150532.5)。2、將濃度為10ng/ml的CA50、CA125、CA19-9和CA15-3等4種腫瘤標誌蛋白通過同一微通道進入晶片反應區域，流動速度為2微升/小時，5分鐘後停止進樣。3、晶片經洗滌後，以與步驟2中同樣的進樣方式將實施例4~7獲得的4種量子點分別標記的CA50、CA125、CA19-9和CA15-3等4種腫瘤標誌蛋白的多克隆抗體注入晶片反應區域，5分鐘後停止進樣。4、晶片洗滌後在螢光檢測器(德國ZEISS公司AXIOSKOP2型)下採集針對4種量子點發射波長的螢光強度，並應用儀器配套軟體進行信號數據處理。結果:tableseeoriginaldocumentpage10實施例9採用聚二甲基矽氧烷(PDMS)製備相互垂直的雙向微流控通道，方法可參考本發明人的專利申請文件，申請號為CN200610117234,X。該微通道與晶片基片通過物理方法進行可逆封合。1、將凝血酶、血小板生長因子和免疫球蛋白E等3種蛋白質的單克隆抗體通過3條同一方向的獨立微流控通道固定在晶片反應區，3種抗體的濃度均為150mg/L，2小時後進行洗滌和封閉等後處理。2、將濃度分別為10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml和500pg/ml的凝血酶、血小板生長因子或免疫球蛋白E等3種靶蛋白通過與步驟l中微通道方向垂直的另一方向的微流控通道進入晶片反應區域，流動速度為2微升/小時，5分鐘後停止進樣。3、晶片經洗滌後，以與步驟2中同樣的進樣方式將實施例1~3獲得的同種量子點分別標記的凝血酶、血小板生長因子和免疫球蛋白E等3種蛋白質的核酸適體注入晶片反應區域，5分鐘後停止進樣。4、晶片經洗滌後在螢光檢測器(德國ZEISS公司AXIOSKOP2型)下觀察耙蛋白與信號探針的反應情況，採集各空間分離的反應單元內的量子點信號，應用儀器配套軟體進行信號數據處理。結果如圖1所示，基於水溶性CdTe量子點探針的雙向微流控蛋白質晶片可以實現的靶蛋白檢測最低限為10pg/ml。可見，本發明量子點生物探針作為信號探針的微流控蛋白質晶片，其檢測結果較現有微流控蛋白質晶片具有更佳的靈敏度和特異性。權利要求1.一種量子點生物探針，其是水溶性量子點和靶蛋白配體連接而成的量子點-生物複合探針。2、如權利要求1所述的量子點生物探針，其特徵在於所述的水溶性量子點為CdTe和/或CdTe/CdS。3、如權利要求1所述的量子點生物探針，其特徵在於所述的靶蛋白配體選自免疫球蛋白、抗體片斷、核酸適體、融合蛋白和蛋白質複合體中的一種或幾種。4、一種如權利要求1~3任一項所述的量子點生物探針的製備方法，其包括將水溶性量子點和靶蛋白配體進行偶聯反應，並將偶聯產物進行純化。5、如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述的偶聯反應中水溶性量子點和靶蛋白配體的摩爾比為1:11:20，每個水溶性量子點上組裝l20個靶蛋白配體分子。6、如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的偶聯反應還可採用偶聯劑，所述的偶聯劑為碳化二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺。7、如權利要求4所述的製備方法，其特徵在於所述的純化採用40k超濾管超濾後，截留液再採用500k超濾管超濾，收集濾過液。8、一種微流控蛋白質晶片，其包括靶蛋白、捕獲探針和信號探針，其特徵在於所述的信號探針採用如權利要求1~3任一項所述的量子點生物探針。9、如權利要求8所述的微流控蛋白質晶片，其特徵在於所述的微流控蛋白質晶片為單向微流控蛋白質晶片，其中不同靶蛋白所對應的作為信號探針的生物探針帶有不同螢光光譜的量子點。10、如權利要求8所述的微流控蛋白質晶片，其特徵在於所述的微流控蛋白質晶片為雙向微流控蛋白質晶片，其中不同靶蛋白所對應的作為信號探針的生物探針帶有相同螢光光譜的量子點。全文摘要本發明公開了一種量子點生物探針及其製備方法。該生物探針是水溶性量子點和靶蛋白配體通過偶聯反應連接而成的量子點-生物複合探針。本發明還提供採用上述量子點-生物複合探針作為信號探針(檢測探針)的微流控蛋白質晶片。本發明採用水溶性量子點，與蛋白質等生物分子具有更好的親和性，通過兩者之間更高效率的偶聯，可以獲得更高性能的量子點-生物複合探針；另外，因為水溶性量子點無有機試劑殘留，所以對蛋白質等生物分子的活性損傷可以減至最小，更好地發揮生物探針的結合性能。文檔編號G01N33/566GK101368944SQ20071004488公開日2009年2月18日申請日期2007年8月15日優先權日2007年8月15日發明者耀何,宋世平,樊春海,汪聯輝,娟顏,維黃申請人:蘇州市長三角系統生物交叉科學研究院有限公司