一種基於Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體及其製備方法

2023-08-02 16:39:21

專利名稱：一種基於Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及構建一種基於魚類Tgf2轉座子的基因轉移載體，同時還公開了該載 體涉及的轉基因供體質粒和轉座酶輔助質粒載體的構建方法，及其在斑馬魚和養殖魚類中 的應用。屬於魚類基因工程領域。
背景技術：
隨著人民生活水平的提高，人們對包括魚、蝦、貝、藻在內的優質水產品有較大需 求。通過轉基因來改良水產養殖對象的生長、抗逆和肉質等方面的種質是一種極其有效的 途徑。早在1984年我國朱作言等即研製出世界上第一批轉基因魚，建立了轉基因魚理論模 型。水產轉基因研究儘管成就斐然，但是，仍然存在許多不足之處，例如，魚類早期的轉基因 表達載體僅是帶有目標基因的質粒，該技術不僅難以做到定點整合，而且整合效率很低，在 後代的遺傳率通常低於5%，可供轉移的有效啟動子、功能基因和通用載體缺乏，很難應用 於不同繁殖類型的水產養殖動物，如不能在浮性卵、黏性卵魚類、排卵量較少的魚類和卵子 較小的蝦類中進行有效轉基因育種。另外，與目標性狀相關的功能基因缺乏，所轉的功能基 因或基因組合不能確實完成抗逆、肉質改良和促生長目標。因此，現階段仍需進一步建立簡 便、安全、高效和通用的轉基因和基因捕獲方法。轉座子主要分為兩類一類是具有類似反轉錄病毒結構的I型轉座子，即逆轉錄 轉座子，採用「複製粘貼」機制，首先將DNA轉錄為RNA，在反轉錄酶的作用下合成DNA，反轉 錄的DNA插人染色體的其他部位，結果在染色體上的位置發生了移動。另一類是II型轉座 子，即DNA轉座子，主要採用「剪切_粘貼」的轉座機制，將DNA從染色體上切下來後直接插 入到別的部位，由兩端較短的反向重複序列(inverted terminal r印eat，ITR)和編碼轉座 酶的基因組成。作為基因轉移和表達系統的DNA轉座子在細菌、真菌、植物、無脊椎動物和 脊椎動物中已有較多應用。隨著McClintock於1951年在玉米中首次發現了 AC轉座子後， 利用轉座子在受體基因組的可整合性，構建了果蠅P因子、hobo因子、piggyBac轉座子和 mariner因子，並已成功地轉化了多種外源基因。脊椎動物中也存在很多轉座子，但是此類 轉座子的轉座酶大多在漫長的進化中失活。直到1996年，日本學者Inagaki H和Koga A等 對青鏘的白化變種進行連鎖分析的時候發現了在白化變種的青鏘的酪氨酸酶基因插入了 一個4. 7kb左右的片段，他們經過克隆和分析最終把其命名為Tol2，不久之後發現了 Το12 具有天然活性。這是在脊椎動物中第一個發現的天然有活性的轉座子。2008年，發明人發現一個新的具有天然活性的hAT轉座子，該轉座子在我國一些 金魚品種中廣泛存在，命名為金魚Tgf2轉座子。金魚Tgf2轉座子是迄今發現的第二例脊 椎動物轉座子。與青鏘Tol2轉座子元件相同，金魚Tgf2轉座子含有末段倒位重複、亞末端 重複、中間倒位重複和活性轉座酶基因，金魚Tgf2與青鏘Tol2轉座子在末段倒位重複和轉 座酶基因編碼上存在一定差異，這些差異為開發新的高效魚類Tgf2轉座子提供了可能。本 發明所涉及的一種源於魚類Tgf2轉座子的簡便、高效轉基因元件的構建就是建立在金魚 Tgf2轉座子發現的基礎上。

發明內容
本發明就是為了解決上述問題，克服金魚Tgf2與青鏘Tol2轉座子在末段倒位重 復和轉座酶基因編碼上存在一定差異的問題，本發明的目的是提供一種基於Tgf2轉座子 的魚類基因轉移載體，本發明還公開了所述載體的製備方法，具有操作簡單、轉化效率高和 低成本的特點。該發明適用於魚類基因功能研究和轉基因育種的研究。本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現作為本發明的一方面，一種基於Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體，其特徵在於， 包括Tgf2轉座子轉基因供體質粒和表達Tgf2轉座酶的輔助質粒。其中，所述Tgf2轉座子轉基因供體質粒包括Tgf2轉座子包含反向重複序列的左 右臂序列和魚類特異性表達蛋白的調控元件。其中，所述輔助質粒在魚類特異性表達蛋白的調控元件指導下表達Tgf2轉座酶。其中，所述Tgf 2轉座子的左右臂序列及轉座酶選自金魚。進一步，所述供體質粒的魚類特異性表達蛋白的調控元件為斑馬魚krt8啟動子 序列。進一步，所述輔助質粒的魚類特異性表達蛋白的調控元件為斑馬魚β-actin啟 動子序列。作為本發明的另一方面，一種基於Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體的製備方法， 包括以下步驟(1)魚類Tgf2轉座子轉基因供體質粒的構建運用PCR技術，分別克隆斑馬魚 krt8啟動子序列；構建目的基因表達盒；通過基因克隆技術將上述構建的包含啟動子和目 的基因表達盒克隆入Tgf2轉座子的左右臂序列所包含反向重複序列之間，構建魚類Tgf2 轉座子轉基因供體質粒；(2)魚類Tgf2轉座酶輔助質粒的構建將斑馬魚β -actin啟動子序列和Tgf2轉 座酶編碼基因連接，構建能表達轉座酶的輔助質粒。為了實現將目的基因穩定整合到魚類基因組中，本發明轉基因供體質粒包含Tgf2 轉座子的左右臂，包含反向重複序列和亞末端重複序列，可由轉座酶識別，促進左右臂間 DNA片段的轉座。本發明利用DNA重組技術，目的基因表達盒克隆入Tgf2轉座子的左右臂 序列之間，構建了魚類轉基因的供體質粒。轉座子發生轉座除需Tgf2轉座子的左右臂序列之外，還需要Tgf2轉座酶的參與。 轉座酶識別左右臂內的順式元件，並實現左右臂序列及其內部的DNA片段發生轉座。為實 現轉座的基因穩定整合到魚類基因組中，本發明將斑馬魚β -actin啟動子序列和Tgf2轉 座酶編碼基因連接，構建能在胚胎細胞內自主表達轉座酶的輔助質粒。這種由魚類Tgf2轉座子構建的轉基因元件，不但可以在魚類中實現高效轉基因， 而且由於不含轉座酶mRNA的體外轉錄和注射，因此，具有操作簡便性和低成本特徵。本發明的有益效果基於魚類高效Tgf2轉座子，構建轉基因供體質粒和Tgf2轉座酶輔助質粒，二者共 同構成的魚類高效轉基因方法，確保外源目的基因在魚類基因組中的高效整合。本發明與 現有技術相比，具有簡便、高效和低成本特點，為魚類基因功能研究和轉基因育種提供了新
4方法。


以下結合附圖和具體實施方式
來進一步說明本發明。圖 1 是 pTgf2_zf3 -actin-eGFP 質粒圖譜。圖2是pTgf2-zfKrt8_eGFP轉基因供體質粒圖譜。圖3是pCS2-CMV_gfTP載體質粒圖譜。圖4是pCS2_zf β -actin-gfTP轉座酶輔助質粒圖譜。圖 5 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉基因供體質粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質粒的斑馬魚36hpf胚胎的可見光透射照片。圖 6 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉基因供體質粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質粒的斑馬魚36hpf胚胎的螢光照片。圖 7 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉基因供體質粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質粒的草魚58hpf胚胎的可見光透射照片。圖 8 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉基因供體質粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質粒的草魚58hpf胚胎的螢光照片。
具體實施例方式為了使本發明的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合具 體圖示，進一步闡述本發明。下面結合具體實施案例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發 明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規 條件，未詳細說明的技術為常規技術。實施例1、轉基因供體質粒PTgf2-zfKrt8-eGFP的構建剪取斑馬魚(Danio rerio，上海海洋大學水產與生命學院C202)尾鰭，提取基因 組DNA，於-20°C保存備用。設計引物SEQ ID No :5 (帶BamHI酶切位點)和SEQ ID No:6(帶 XhoI酶切位點)在斑馬魚基因組進行PCR擴增，擴增反應程序為94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 150s，35個循環；72°C延長5min。擴增產物經1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩 衝液，在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回收目的片段，將回收產物分別連接至pMD-19T 載體(TaKaRa)中，並轉入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，接種到氨苄青黴素含量為50 μ g/ mL的液體LB培養基中，37°C振蕩過夜培養，取200 μ L菌液甘油保存，並送往上海生工生物 工程有限公司進行測序。序列正確的陽性克隆質粒，進行BamHI和XhoI雙酶切，酶切產物 經1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩衝液，在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回收目的片段， 獲得斑馬魚zfKrt8啟動子雙酶切DNA產物。對包含金魚Tgf2轉座子左、右臂序列和綠色螢光蛋白eGFP基因的 pTgf2-zfi3 -actin-eGFP質粒(圖1)進行BamHI、XhoI雙酶切，酶切產物經1. 2%瓊脂糖凝 膠，以TBE為緩衝液，在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回收目的片段，獲得pTgf2_eGFP 質粒雙酶切產物，然後再與斑馬魚ZfKrtS啟動子雙酶切DNA產物用T4連接酶連接，並轉 入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，進行測序驗證獲得PTgf2-ZfKrt8-eGFP轉基因供體質粒(圖 2)。實施例2、Tgf2轉座酶(gfTP)輔助質粒的構建根據已獲得信息，Tgf2轉座子編碼的轉座酶(gfTP)在金魚(琉金金魚 Carassius auratus var.)成熟的卵巢中表達量最高，因此，取琉金金魚成熟卵巢，利用 TRIZOL (Invitrogen 公司)試劑提取總 RNA，用 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3. O 中的逆 轉錄酶反轉為3，端單鏈cDNA，於-20°C保存備用。以正反引物SEQ ID No :1(帶XhoI酶切 位點)和SEQ ID No :2 (帶XbaI酶切位點)PCR擴增Tgf2轉座酶編碼區1734bp全長，擴增 產物經1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩衝液，在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回收目的片 段，將回收產物連接至PMD-19T載體(TaKaRa公司)中，並轉入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克 隆，接種到氨苄青黴素含量為50μ g/mL的液體LB培養基中，37°C振蕩過夜培養，取200 μ 1 菌液甘油保存，並送往上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結果與預期一致後，取回 收質粒進行XhoI、XbaI雙酶切，酶切產物經1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩衝液，在5V/cm的 電壓下電泳分離後，割膠回收目的片段，即獲得gfTP閱讀框DNA雙酶切產物，並於_20°C保 存備用。對pCS2+載體質粒(由美國密西根大學段存明教授惠贈)進行Xhol、XbaI雙酶 切，酶切產物經1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩衝液，在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回 收目的片段，溶於無菌雙蒸水中。將回收載體片段與gfTP閱讀框DNA雙酶切連接，並轉入 大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，取200 μ 1菌液甘油保存，並送往上海生工生物工程有限公 司進行測序驗證。挑取陽性克隆接種到氨苄青黴素含量為50 μ g/mL的液體LB培養基中， 37°C振蕩過夜培養，用質粒小抽試劑盒(北京天根公司)提取質粒，即獲得pCS2-CMV-gfTP 載體質粒(圖3)。設計引物SEQ ID No :3 (帶BamHI酶切位點)和SEQ ID No :4 (帶XboI酶切位 點)在斑馬魚基因組DNA中進行擴增，PCR反應程序為94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72 °C 150s, 35個循環；72°C延長5min。擴增產物經1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩衝液， 在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回收目的片段，將回收產物分別連接至PMD-19T載體 (TaKaRa)中，並轉入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，接種到氨苄青黴素含量為50 μ g/mL的 液體LB培養基中，37°C振蕩過夜培養，取200 μ L菌液甘油保存，並送往上海生工生物工程 有限公司進行測序。測序結果與預期一致後，取回收質粒進行BamHI、XhoI雙酶切，酶切產 物經1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩衝液，在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回收目的片 段，即獲得zf β -actin啟動子DNA雙酶切產物，並於_20°C保存備用。對？052義1^飛^ 載體進行8膽!1^1101雙酶切，酶切產物經1. 2%瓊脂糖凝膠，以 TBE為緩衝液，在5V/cm的電壓下電泳分離後，割膠回收目的片段，溶於無菌雙蒸水中。將回 收的載體雙酶切產物與zf β -actin啟動子DNA雙酶切產物連接，並轉入大腸桿菌DH5 α，挑 取陽性克隆，接種到氨苄青黴素含量為50 μ g/mL的液體LB培養基中，37°C振蕩過夜培養， 取200 μ L菌液甘油保存，並送往上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。分別挑取陽性 克隆接種到氨苄青黴素含量為50 μ g/mL的液體LB培養基中，37°C振蕩過夜培養，用質粒小 抽試劑盒(北京天根公司)提取質粒，即完成pCS2-zf β -actin-gfTP轉座酶輔助質粒(參 見圖4)的構建。實施例3、Tgf2轉基因元件和輔助質粒在斑馬魚中的轉基因效果
斑馬魚的飼養實驗用斑馬魚飼養於循環水族箱中，雌雄分開暫養，每日飼餵兩 次，一次為滷蟲，一次餵人工飼料，培養溫度約為28°C，光照14h，黑暗10h。產卵前一晚將雌 魚與雄魚轉入產卵缸中，雌與雄用透明擋板隔開。實驗當天早上抽去擋板，讓其自然產卵。顯微注射取PTgf2-zfKrt8-eGFP (參見圖2)轉基因供體質粒和Tgf2轉座子編碼 的 Tgf2 轉座酶輔助質粒 pCS2-zf β -actin-gfTP (參見圖 4)，用 0. 3 XDanieau buffer (含 0. 酚紅)配製終濃度各為50ng/y L的混合溶液。將轉基因質粒溶液與輔助質粒的混合 溶液添加到顯微注射針中，採用美國WPI公司的PV830PneumatiC Pico Pump型號的顯微 注射儀進行顯微注射操作。注射位點為斑馬魚1 2細胞期胚胎的卵黃(靠近細胞部位) 中，每個胚胎注射lnlTgf2 mRNA溶液，轉基因供體質粒和Tgf2轉座酶mRNA的注射劑量各 約為50pg。注射完畢後，將受精卵放置於28°C的胚胎培養液中正常發育，在螢光顯微鏡下 觀察不同時期胚胎的螢光表達情況和轉基因效果。結果顯示參見圖5和圖6，共同注射 PTgf2-zfKrt8-eGFP轉基因供體質粒和pCS2_zf β -actin-gfTP輔助質粒的胚胎36小時存 活358顆，有綠色螢光191顆(參見圖6)，螢光率為53. 4% ；6天後存活有螢光的斑馬魚仔 魚有172條(共348顆)，整合率為49. 4%。實施例4、輔助質粒介導轉基因供體質粒在草魚中的轉基因效果實驗所用草魚(Ctenopharyngodon idellus)親魚取自上海海洋大學青浦魚類育 種試驗站。挑選發育良好的5齡以上親魚雌32尾，雄32尾。上午10點，給草魚雌親魚打 催產針，每kg魚體重注射促黃體素釋放激素類似物(LRH-A) 4 μ g，雄魚劑量減半。草魚雌雄 親魚放於產卵池中，流水刺激。10小時後，雌雄親魚開始發情，並開始追逐產卵，在產卵池收 卵口收集剛受精的草魚受精卵備用，在草魚發情後，草魚受精卵也可進行人工授精獲得。用 大口吸管吸取草魚受精卵約200顆，置於直徑為IOcm的塑料培養皿中，使受精卵平鋪在皿 底上，然後用吸管把皿中的水吸乾，便可對受精卵進行顯微注射。顯微注射儀系統2套，由2 位熟練操作人員進行注射。注射位點為草魚受精卵1 2細胞期胚胎，具體位置為靠近細胞 部位的卵黃中，每個受精卵約注射Inl溶液，包含轉基因供體質粒(PTgf2-ZfKrt8-eGFP，參 見圖2)和Tgf2轉座酶輔助質粒(pCS2-zf β -actin-gfTP，參見圖4)劑量各約為50pg。注 射完畢後，在注射培養皿側面寫好注射質粒、時間和劑量。每4小時用吸管換水和挑死卵， 直至出苗。將受精卵放置室溫下正常發育，定期(每隔6小時)在螢光顯微鏡下觀察螢光 表達情況。結果一參見圖7-圖8，注射草魚胚胎組58小時存活454顆，有綠色螢光450顆 (參見圖8)，螢光率為99. 1 %，8天後有螢光的草魚仔魚有245條，整合率為53.9%。結果 二 在另一注射草魚胚胎組58小時存活621顆，有綠色螢光603顆，螢光率為97. ;8天 後有螢光的斑馬魚仔魚有306條，整合率為49. 3%。以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術 人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其 等同物界定。
權利要求
一種基於Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體，其特徵在於，包括Tgf2轉座子轉基因供體質粒和表達Tgf2轉座酶的輔助質粒。
2.根據權利要求1所述的魚類基因轉移載體，其特徵在於，所述Tgf2轉座子轉基因供 體質粒包括Tgf2轉座子包含反向重複序列的左右臂序列和魚類特異性表達蛋白的調控 元件。
3.根據權利要求1所述的魚類基因轉移載體，其特徵在於，所述輔助質粒在魚類特異 性表達蛋白的調控元件指導下表達Tgf2轉座酶。
4.根據權利要求2或3所述的魚類基因轉移載體，其特徵在於，所述Tgf2轉座子的左 右臂序列及轉座酶選自金魚。
5.根據權利要求2所述的魚類基因轉移載體，其特徵在於，所述供體質粒的魚類特異 性表達蛋白的調控元件為斑馬魚krt8啟動子序列。
6.根據權利要求3所述的魚類基因轉移載體，其特徵在於，所述輔助質粒的魚類特異 性表達蛋白的調控元件為斑馬魚β -actin啟動子序列。
7.—種如權利要求1基於Tgf2轉座子的魚類基因轉移載體的製備方法，包括以下步驟(1)魚類Tgf2轉座子轉基因供體質粒的構建運用PCR技術，分別克隆斑馬魚krt8啟 動子序列；構建目的基因表達盒；通過基因克隆技術將上述構建的包含啟動子和目的基因 表達盒克隆入Tgf2轉座子的左右臂序列所包含反向重複序列之間，構建魚類Tgf2轉座子 轉基因供體質粒；(2)魚類Tgf2轉座酶輔助質粒的構建將斑馬魚β-actin啟動子序列和Tgf2轉座酶 編碼基因連接，構建能表達轉座酶的輔助質粒。
全文摘要
本發明公開了一種源於魚類Tgf2轉座子的簡便、高效轉基因元件及製備方法。由轉基因供體質粒和輔助質粒組成。轉基因供體質粒由魚類啟動子序列，如斑馬魚Krt8啟動子、目的基因、以及金魚Tgf2轉座子左右臂序列構建。輔助質粒由斑馬魚β-actin啟動子序列和金魚Tgf2轉座酶編碼基因構建。本發明與現有技術相比，具有操作簡單、轉化效率高和低成本特點，為進行魚類轉基因研究提供了新方法。
文檔編號C12N15/66GK101962659SQ20101022317
公開日2011年2月2日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者杜雪地, 沈睿傑, 蔣霞雲, 袁劍, 鄒曙明 申請人:上海海洋大學