一種黃麴黴毒素B₁磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法

2023-08-03 05:28:06

專利名稱：一種黃麴黴毒素B1磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法
技術領域：
本發明屬於納米生物技術領域，具體涉及一種黃麴黴毒素B1免疫磁分離螢光定量 檢測試劑盒的製備方法。
背景技術：
黃麴黴毒素(Aflatoxin，簡寫AF)是主要由黃麴黴菌和寄生麴黴菌產生的次生代 謝產物，世界各地的玉米、小麥、高粱、甘薯、大豆、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶製品中均存在黃曲 黴毒素的汙染情況。目前發現的18種黃麴黴毒素中，黃麴黴毒是毒性最大的真菌毒素，其 毒性為砒霜的68倍，它誘發肝癌的能力是二甲基亞硝胺的75倍，它具有誘導突變、抑制免 疫和致癌的作用，是目前公認致癌性最強的物質之一。AFMpAFByAFG1次之。同時，AF十分 穩定，加熱至230°C才能被完全破壞，因此一般烹飪加工不易消除，並且它可以通過多種途 徑汙染食品，直接或間接進入人類食物鏈，威脅人類健康和生命安全。目前國際上對農產品中AF含量的檢測，已成為強制性貿易技術措施。其中薄層層 析法、高效液相色譜法和免疫化學法是受人們關注的幾個代表性方法。以上三種方法中，薄 層層析法是研究AF初期所使用的主要方法，主要是由於樣品前處理過程繁瑣、複雜，較適 合於定性檢測，不適於大批量樣品的快速檢測；高效液相色譜法具有快速、靈敏、準確等特 點，並且可以用於定性和定量檢測，但儀器價格昂貴，不便於操作；免疫分析法操作簡便、快 速，但也只能用來進行定性檢測。因此，開發快速、準確、簡便的檢測技術是當務之急。目前， 用納米材料實現快速檢測的方法是利用金標試紙進行檢測，該方法可以快速的檢測黃麴黴 毒素的含量達標與否，但不能進行定量檢測。本發明利用磁性分離和螢光納米材料檢測技 術相結合的方法，實現黃麴黴毒素B1的定量檢測。

發明內容
本發明的目的是提供一種黃麴黴毒素B1磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法， 主要用於檢測糧食、食品、飲料、酒類、飼料等中的黃麴黴毒素B1的含量。由於螢光粒子的激發譜在吸收閾值以上幾乎是連續的，利於多波長激發；高強度 的螢光發射，發光穩定性好，不容易被光分解和漂白，因此可以用於標記物的定量檢測。磁 性納米材料具有特殊的超順磁性，是被廣泛應用的快速磁分離材料。利用磁性材料將被檢 測物從待檢樣本中分離，並與螢光檢測試劑結合形成免疫夾心複合物，這樣可以利用螢光 粒子進行樣本的定量檢測。本發明的技術方案檢測原理是樣品中的黃麴黴毒素B1首先與磁性納米材料表面 的抗體(複合物(I))發生免疫反應，偶聯到磁性分離試劑一複合物(I)上，再加入偶聯有 全抗原的螢光粒子溶液(複合物(II))，複合物(II)中的黃麴黴毒素B1與複合物(I)上的 剩餘抗體發生免疫反應，形成複合物(ι)--複合物(II)的免疫夾心複合物(III)，這樣免疫 夾心複合物(III)的螢光強度就與黃麴黴毒素B1的量相關。在測試範圍內，可以看出樣品
3中黃麴黴毒素的濃度與最終被測溶液的螢光粒子溶液的螢光強度成反比，其具體的黃麴黴 毒素的含量需要從標準工作曲線上獲得。本發明所述的一種黃麴黴毒素B1磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法，其步驟 如下(1)磁性粒子的製備通過高溫分解法製備粒徑為5 ISnm的Fe3O4磁性粒子，再 利用細乳液法製備表面功能化的Fe3O4磁性粒子；(2)磁性分離試劑--複合物(I)的製備利用縮合劑EDC(EDC 乙基_(3_ 二甲 基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)，使Fe3O4磁性粒子與黃麴黴毒素B1抗體(兔源性多克隆抗 黃麴黴毒素B1抗體，購買於西格瑪奧德裡奇(上海)貿易有限公司)偶聯形成複合物(I)；(3)螢光粒子的製備通過有機相合成法製備CdSe螢光粒子，所製得的螢光粒子 的尺寸在2. 5 3. Onm (其它螢光納米材料如CdTe螢光粒子、具有核-殼結構的CdSe/ZnS 螢光粒子等也適用於本發明方法)，然後通過聚馬來酸使螢光粒子表面功能化並轉移到水 相，得到螢光粒子；(4)螢光檢測試劑一複合物(II)的製備利用縮合劑EDC，使螢光粒子與黃麴黴 毒素B1的全抗原(BSA-AFB1 連接黃麴黴毒素B1的牛血清白蛋白，購買於西格瑪奧德裡奇 (上海)貿易有限公司)偶聯形成複合物(II)；(5)標準工作曲線的繪製取6份磁性分離試劑一複合物(I)(每份200uL)分 別放入試管中，再依次分別加入不同濃度的黃麴黴毒素B1標準溶液20uL(黃麴黴毒素B1 標準溶液配製黃麴黴毒素B1首先溶解在甲醇溶液中，配製成lmg/mL甲醇溶液，然後用含 10%甲醇(體積含量)的磷酸緩衝溶液(pH 7.4、0.01mol/L)稀釋一定倍數，即得到黃曲 黴毒素B1標準溶液，黃麴黴毒素B1標準溶液的濃度分別為0ng/mL、0. lng/mL,0. 5ng/mL、 1. 0ng/mL、2· 0ng/mL、5· Ong/mL。)，在37°C下孵育20分鐘後，在磁場中沉澱；然後倒去上 清液，再分別加入50uL螢光檢測試劑複合物(II)溶液，在37°C下孵育20分鐘，在磁場中 沉澱，倒去上清液，得到免疫夾心複合物(III)。再分別加入200uL的磷酸緩衝溶液(pH = 7. 4,0. Olmol/L)，測定每個試管內溶液的螢光光譜，記錄其最大螢光強度(螢光分光光度 計一島津RF5301)；然後以螢光強度與黃麴黴毒素標準溶液的濃度為坐標繪製標準工作曲 線。(6)在實際檢測中，首先繪製標準工作曲線，再測定(重複第5步中的操作過程) 樣品的螢光強度，通過工作曲線讀取樣品中AFB1的濃度。免疫磁分離螢光定量檢測試劑盒用於黃麴黴毒素B1的檢測，其檢測限為0. 1 5ng/mL。


圖1 以螢光強度與黃麴黴毒素標準溶液的濃度為坐標繪製的標準工作曲線。
具體實施例方式1.磁性粒子的製備(1)參照文獻 J.Am· Chem. Soc.，2004，126，273-279，通過高溫分解方法合成 Fe3O4 磁性粒子。向N2保護的三頸瓶內加入乙醯丙酮鐵[Fe(acac)3] (0. 3532g)，1，2-十二二元醇 (1.0117g)，油酸(1.0220mL)，油胺(0. 99mL)混合，苄醚(IOmL)，磁力攪拌。混合物加熱至 200°C，2h ；然後停止通入氮氣，再加熱至約30(TC，Ih，停止加熱，終止反應，冷卻至室溫。冷
4卻後向三頸瓶中加入20mL乙醇，14000rpm離心20min，棄上清；將沉澱分散於25uL油酸、 25uL油胺和5mL正己烷混合溶液中；6000rpm離心IOmin ；棄沉澱，向上清加入IOmL乙醇， IOOOOrpm離心20min，棄上清，即得到Fe3O4磁性粒子，粒徑為5 18nm，沉澱分散於正己烷
中保存。(2)表面功能化的 Fe3O4 磁性粒子，參照文獻 J. Nanopart. Res.，2009，11, 289-296 首先超聲將0. 218g Fe3O4磁性粒子分散在ImL苯乙烯和0. ImL環己烷的溶液中形成油相， 再將0. 08g十二烷基硫酸鈉(SDS)和0. Olg NaHCO3溶解於30mL水中形成水相；將油相和 水相在冰水浴的條件下混合超聲10分鐘形成穩定的細乳液，然後將細乳液轉入到加熱的 四頸瓶中，當溫度到達70°C時，加入0. ImL的丙烯酸，然後再加入0. 5mL含有0. 015g過硫酸 鉀(KPS)的水溶液引發聚合反應，在通冷凝水、氮氣保護、300rpm攪拌的條件下反應12小 時，即得到表面功能化的Fe3O4磁性粒子的溶液(濃度約為5. Omg/mL)。2.磁性分離試劑一複合物(I)的製備取上述步驟(2)製備的表面功能化的Fe3O4磁性粒子溶液10uL，加入0. Olmol/L、 PH = 7. 4的磷酸緩衝溶液140uL。再依次加入50 μ LEDC(2mg/mL, 1-乙基_ (3- 二甲基氨基 丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和IuL抗體溶液(6.7mg/mL，兔源性多克隆抗黃麴黴毒素B1 抗體)，在氣浴恆溫振蕩儀中，37°C條件下反應4h。反應結束後用磁鐵將磁性粒子富集在離 心管底部，吸出上清液。將離心管底部的磁性粒子用0. 01mol/L、pH =7.4的磷酸緩衝溶液 200 μ L充分溶解，於4°C保存；即得複合物(I)的溶液。3.螢光粒子的製備(1)儲備液的製備①儲備液a :氧化鎘(0. 0154g)、油酸(0. IOlg)、5mL十八烯溶 解在25mL三頸瓶中，在氮氣的保護下加熱到240°C得到無色澄清的溶液；②儲備液b 硒粉 (0. 188g)、油酸(1. 94g)、18mL十八烯加入到氮氣保護的50mL三頸瓶中，加熱到100°C反應 20分鐘，然後在220°C加熱3小時，最終變為黃色溶液；(2)螢光粒子的合成儲備液a(25mL)在氮氣保護下加熱到280°C，加入2mL儲備 液b，反應30min，得到亮紅色溶液，通過甲醇萃取，沉澱溶於氯仿，即得到CdSe螢光粒子的 氯仿溶液，粒徑為2. 5 3. Onm。(3)表面功能化的螢光粒子0. 72g的聚馬來酸十六烷醇酯(PMAH)溶解在IOOmL 高純水中，用NaOH調節pH值到8 10，然後加入IOmL螢光粒子的氯仿溶液(2. OxlO^mol/ L)，常溫攪拌24小時，螢光粒子即轉移到水相中。將水相溶液再過0. 22um的濾膜，除去大的 顆粒，產物再經過離心純化，得到表面功能化的CdSe螢光粒子溶液(濃度約為0. 5mg/mL)。4.螢光檢測試劑一複合物(II)的製備取螢光粒子溶液100 μ L，加入0. Olmol/L、pH = 7. 4的磷酸緩衝溶液50uL。再依 次加入50uL EDC(2mg/mL, 1-乙基_ (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和2. 5uL 抗體溶液(5mg/mL，兔源性多克隆抗黃麴黴毒素B1抗體)，在氣浴恆溫振蕩儀中，37°C條件 下反應4h。反應結束後12000rpm離心lOmin，吸出上清液。將離心管底部的螢光粒子用 0. Olmol/L、pH = 7. 4的磷酸緩衝溶液200uL充分溶解，於4°C保存；即得複合物(II)的溶 液。5.標準工作曲線的繪製取6份磁分離試劑一複合物⑴(每份200uL)，分別加入黃麴黴毒素標準溶液20uL(黃麴黴毒素Bl標準溶液的濃度分別為0ng/mL、0. lng/mL,0. 5ng/mL、l. Ong/mL、 2. Ong/mL,5. Ong/mL)，在37°C下孵育20分鐘後，在磁場中沉澱；然後倒去上清液，再加入 50uL螢光檢測試劑複合物(II)溶液，在37°C下孵育20分鐘，在磁場中沉澱；倒去上清液， 再加入200uL的磷酸緩衝溶液(pH= 7. 4,0. Olmol/L)，測定該溶液的螢光光譜，記錄其最大 螢光強度。然後再以螢光強度與黃麴黴毒素標準溶液的濃度為坐標繪製標準工作曲線，測 量數據見表1，繪製的標準曲線如圖1。表1 黃麴黴毒素標準工作曲線數據表 6.樣品的定量檢測首先配製樣品液(樣品1、樣品2、樣品3，其黃麴黴毒素Bl的已知含量分別為 0. 2ng/mL、0. 8ng/mL和3ng/mL)。然後通過步驟5所述的方法和步驟測定樣品1、2、3的熒 光值如下樣品1 =645. Icps ；樣品2 605. Icps和樣品3 564. 4cps，則通過步驟5繪製的標 準工作曲線讀取的對應的黃麴黴毒素B1的含量分別為0. 21ng/mL、0. 83ng/mL和3. 02ng/ mL，與已知含量相符合得很好，充分表明本發明所製備的試劑盒能夠用於黃麴黴毒素B1的 定量檢測，而且準確率高。
權利要求
一種黃麴黴毒素B1磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法，其步驟如下(1)磁性粒子的製備通過高溫分解法製備粒徑為5～18nm的Fe3O4磁性粒子，再利用細乳液法製備表面功能化的Fe3O4磁性粒子；(2)磁性分離試劑 複合物(I)的製備利用縮合劑1 乙基 (3 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，使Fe3O4磁性粒子與黃麴黴毒素B1抗體偶聯形成複合物(I)；(3)螢光粒子的製備通過有機相合成法製備螢光粒子，然後通過聚馬來酸使螢光粒子表面功能化並轉移到水相，得到螢光粒子；(4)螢光檢測試劑 複合物(II)的製備利用縮合劑1 乙基 (3 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，使螢光粒子與黃麴黴毒素B1的全抗原偶聯形成複合物(II)；(5)標準工作曲線的繪製取6份體積均為200uL的磁性分離試劑 複合物(I)分別放入試管中，再依次分別加入不同濃度的黃麴黴毒素B1標準溶液20uL，在37℃下孵育20分鐘後，在磁場中沉澱；然後倒去上清液，分別加入50uL螢光檢測試劑複合物(II)溶液，在37℃下孵育20分鐘，在磁場中沉澱；倒去上清液，再分別加入200uL、pH＝7.4、濃度為0.01mol/L的磷酸緩衝溶液，然後測定每個試管內溶液的螢光光譜，記錄其最大螢光強度；再以螢光強度與黃麴黴毒素標準溶液的濃度為坐標繪製標準工作曲線；(6)對未知濃度的黃麴黴毒素B1溶液重複步驟(5)中的操作過程，得到樣品的最大螢光強度，然後通過步驟(5)繪製的標準工作曲線讀取樣品中黃麴黴毒素B1的濃度。
2.如權利要求1所述的一種黃麴黴毒素B1磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法，其 特徵在於黃麴黴毒素B1的檢測限為0. 1 5ng/mL。
3.如權利要求1所述的一種黃麴黴毒素B1磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法，其 特徵在於螢光粒子為CdSe螢光粒子、CdTe螢光粒子或具有核_殼結構的CdSe/ZnS螢光 粒子。
4.如權利要求1所述的一種黃麴黴毒素B1磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法，其 特徵在於黃麴黴毒素B1標準溶液的配製是將黃麴黴毒素B1首先溶解在甲醇溶液中，配製 成lmg/mL甲醇溶液，然後用體積含量10%甲醇的磷酸緩衝溶液稀釋，稀釋後黃麴黴毒素B1 溶液的濃度分別為 0ng/mL、0. lng/mL、0. 5ng/mL、l. 0ng/mL、2. Ong/mL 和 5. Ong/mL。
全文摘要
本發明屬於納米生物技術領域，具體涉及一種黃麴黴毒素B1免疫磁分離螢光定量檢測試劑盒的製備方法。本發明為免疫檢測系統與磁性納米材料的快速分離技術、螢光納米材料的發光特性相結合的一種測定方法，其先是製備磁性分離試劑——複合物(I)，然後使黃麴黴毒素B1偶聯到複合物(I)上，再加入偶聯有全抗原的螢光粒子溶液(複合物(II))，複合物(II)中的黃麴黴毒素B1與複合物(I)上的剩餘抗體發生免疫反應，形成複合物(I)-複合物(II)的免疫夾心複合物(III)，這樣黃麴黴毒素的濃度與最終被測溶液的螢光粒子溶液的螢光強度成反比，本發明的優點是檢測快速、準確、明顯、靈敏度高等。
文檔編號G01N21/64GK101923089SQ201010228290
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者呂紹武, 張代輝, 張學忠, 徐力, 郭軼 申請人:吉林大學