膠膜菌屬真菌菌株及其在促進硬葉蘭種子萌發中的應用的製作方法

2023-10-07 09:50:14 2

膠膜菌屬真菌菌株及其在促進硬葉蘭種子萌發中的應用的製作方法
【專利摘要】一種膠膜菌屬(Tulasnella)真菌菌株（CGMCC?No.7553），其ITS序列已提交美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，其Genbank號為：KC796458.1及其在促進硬葉蘭種子萌發上的應用。本發明的膠膜菌(Tulasnella)菌株（CGMCC?No.7553）通過與原球莖形成共生關係，促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。實驗證實，接種從硬葉蘭原球莖中分離到的CGMCC?No.7553菌株的種子萌發率為74.72%±16%。
【專利說明】膠膜菌屬真菌菌株及其在促進硬葉蘭種子萌發中的應用【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種能與硬葉蘭(Cymbidium mannii)原球莖共生形成共生關係並促進種子萌發成原球莖進而長成幼苗的有效真菌菌株膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7553)，及其在促進硬葉蘭種子萌發上的應用，具體來說涉及一種能與硬葉蘭原球莖形成共生關係並促進其種子萌發生長至幼苗階段的有效真菌。
【背景技術】
[0002]蘭科植物的種子非常細小，僅有發育不完全的胚，在自然條件下種子萌發需要依靠特定的共生真菌來獲取營養物質。蘭科植物種子的萌發可以通過非共生萌發培養和共生萌發培養兩種方式。目前蘭科植物種子的萌發，多採用人工培養基在無菌條件下進行非共生萌發，萌發率雖高，但在進行瀕危種類野外回歸時，非共生萌發(無菌萌發)幼苗移植到自然環境中生長緩慢，抗病原微生物能力差，存活率較低，並且由於無法與自然界中的真菌建立共生關係從而導致後續生長嚴重受阻。而通過種子和真菌的共生萌發獲得的幼苗在回歸到自然生境後具有較好的環境適應性。因此獲得種子萌發的有效共生真菌是進行珍稀瀕危蘭科植物保護的第一步。利用種子遷地共生萌發技術誘導種子萌發成原球莖，分離原球莖中的共生真菌是獲取促進種子萌發有效菌株最直接最高效的方法。共生萌發培養技術是指在特定的基質(培養基)中同時播種植物種子和共生真菌，該方法可以提高種子的萌發率、幼苗的生長速度以及移植到自然環境後的幼苗存活率。由於蘭科植物種子與真菌的共生關係具有專一性，不同蘭科植物種子的共生真菌不同，確定能與硬葉蘭種子形成共生關係並促進其萌發的有效真菌是培育硬葉蘭幼苗的關鍵環節，是開展硬葉蘭原生境回歸工作的基礎。將硬葉蘭種子和分離得到的真菌在人工培養基上進行共生萌發實驗，篩選出能促進硬葉蘭種子萌發至幼苗的有效共生真菌，可為高效生產菌根化幼苗提供必要條件，為開展硬葉蘭的回歸奠定基礎。目前，現有技術中未見有膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7553)及其在促進硬葉蘭種子萌發生長成幼苗生長方面的用途和方法的報導。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在於提供膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7553)及其在促進硬葉蘭種子萌發生長成幼苗方面的用途和方法。本發明的菌株通過共生萌發實驗將硬葉蘭種子和不同的真菌及對照分別在燕麥培養基上培養，通過種子萌發率的比較，成功的獲得促進硬葉蘭種子萌發的有效菌株，從而為利用硬葉蘭種子和真菌共生萌發來高效培育種苗開闢了一條新的途徑。
[0004]為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:
[0005]一種膠膜菌屬(Tulasnella)真菌菌株(CGMCC N0.7553)。
[0006]如所述的菌株(CGMCCN0.7553)，該菌株(CGMCC N0.7553)的 nrDNA ITS 序列提交美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),序列號為KC796458.1。[0007]如所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7553)，所述菌株(CGMCCN0.7553)的生物學特徵為:菌株在PDA平板上培養7天其菌落白色，氣生菌絲髮達，圓周狀發散生長，略顯稀疏。光學顯微鏡下觀察，菌絲具隔膜，粗3.0 - 5.5 μ m，多數4 μ m至4.5 μ m分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠處形成隔膜；老菌絲細胞壁加厚現象明顯；培養2周後形成串珠狀的厚垣孢子。
[0008]所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7553)在促進硬葉蘭種子萌發上的應用。
[0009]如所述的應用，膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7553)通過與原球莖形成共生關係，促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
[0010]如所述的應用，通過將硬葉蘭種子與不同種類的真菌共同培養於燕麥培養基，在人工培養箱內25±2°c條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養，使菌株與原球莖形成共生關係，從而促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
[0011]所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7553)促進硬葉蘭種子萌發的方法，其特徵在於將膠膜菌(Tulasne lla)菌株(CGMCC N0.7553)與原球莖形成共生關係，促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
[0012]如所述的方法，通過將硬葉蘭種子與不同種類的真菌共同培養於燕麥培養基，在人工培養箱內25±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養，使菌株與原球莖形成共生關係，從而促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
[0013]為了實現本發明的目的，本發明提供的具體步驟為:
[0014]1、本發明菌種於2013年04月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號:CGMCC N0.7553。本發明菌株的ITS序列已提交美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),其 Genbank 號為:KC796458.1。
[0015]2、本發明上述編號為CGMCC N0.7553的膠膜菌株在PDA平板上培養7天其菌落白色，氣生菌絲髮達，圓周狀發散生長，略顯稀疏。光學顯微鏡下觀察，菌絲具隔膜，粗
3.0 - 5.5 μ m，多數4 μ m至4.5 μ m分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠處形成隔膜；老菌絲細胞壁加厚現象明顯；培養2周具串珠狀的厚垣孢子。
[0016]3、對本發明的硬葉蘭種子萌發有效共生真菌ITS片段序列在美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中進行BLAST比對分析，其與⑶166410.1Tulasnellacalospora相似性最高達98%。根據菌落、顯微形態特徵及分子生物學手段將本發明所涉及真菌鑑定為膠膜菌屬(Tulasnella)真菌。
[0017]4、硬葉蘭種子與膠膜菌屬真菌共生萌發實驗
[0018]利用種子與真菌在培養基內的共生萌發實驗來檢測分離到的真菌是否對種子萌發階段有促進效果以及對比不同真菌對種子萌發階段促進效果的差異。
[0019]4.1將保存於4°C試管斜面內的供試菌株取出，重新接種在PDA平板培養基上，置於人工氣候箱內25±2°C培養，進行活化。待真菌菌絲快長滿培養皿時(約10天)取出作為共生萌發材料。
[0020]4.2配製共生萌發培養基:所用培養基為燕麥瓊脂培養基(0MA，4g. 1燕麥粉+8g.L1瓊脂，ρΗ=5.6 - 5.8)。將配好的培養基倒在旋口瓶中，旋緊瓶蓋，滅菌(121。。，20min)後備用。
[0021]4.3種子滅菌:實驗前將儲存在_20°C中的種子取出，放在室溫下10個小時，使種子溫度恢復至室溫。將少量種子放在紙質的種子包內，用訂書釘將紙袋封好。將裝有種子的紙袋浸泡在蒸餾水中5 - 10分鐘，輕輕的擠壓出氣泡。用鑷子將紙袋轉移到盛有次氯酸鈉溶液(有效氯離子濃度為1%)及含一滴洗滌劑的燒杯中，輕輕攪拌或搖動燒杯。10分鐘後，將紙袋移至超淨工作檯，用無菌鑷子將紙袋轉移到盛有無菌蒸餾水的燒杯中，輕輕搖動。重複衝洗種子3 - 4次。輕輕擠壓出紙袋內多餘的水，用無菌剪刀剪開紙袋，即可獲得滅菌種子。[0022]4.4播種與培養:據文獻Dixon (1987)所用的方法稍作修改。將無菌種子與Ig *L_1無菌瓊脂溶液製作成無菌種子懸浮液。在OMA培養基表面平行放置兩片半徑為6cm的半圓形無菌尼龍布(孔徑為45 μ m)，用移液槍吸取150 μ I種子懸浮液均勻播種在每片尼龍布上。在培養基中間接種約0.5cm3 (I X 1X0.5cm)含有單一真菌純培養物的瓊脂塊，用封口膜將培養皿密封好。共分三組:一組接種從硬葉蘭原球莖中分離得到的編號為CGMCC N0.7553的菌株；另外2組設置為對照,其中一組接種從覽唇石斛(Dendrobiumaphyllum)原球莖內分離到的膠膜菌屬(Tulasnella)真菌(編號為FDaI7);另一組為空白對照組(CK)不接菌。每組重複14個培養皿,在人工培養箱內25±2°C下恆溫培養,每組各7個培養皿分別在有光條件(光周期為12/12hL/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養。
[0023]4.5檢測:播種後每周檢測種子萌發情況，記錄種子萌發及形成原球莖的時間。培養數周后當培養皿中產生大量處於發育初期階段的幼苗時將全部培養皿取出，在立體顯微鏡下觀察記錄種子萌發及原球莖發育情況。在文獻Stewart&Zettler (2002)對種子萌發和原球莖發育情況的分級標準基礎之上稍作調整，對種子萌發情況進行分級統計。統計光照和黑暗條件下接菌不同真菌的促種子萌發效果，對比篩選能顯著促進種子萌發並生長成幼苗的有效菌株。
[0024]上述步驟中，步驟I按照菌種保藏單位的要求提供三支試管斜面培養的菌種材料入庫獲取入冊登記編號；同時將測序所得的ITS鹼基序列上傳至Genbank提供的軟體並提交獲取Genbank號。
[0025]步驟2所述觀察菌株顯微形態特徵使用插片培養法，黴菌培養箱在25±2°C條件下培養7至10天，取插片按常規製片方法製片。根據觀察需要選擇不同生長時期的菌絲進行觀察測量如:位於插片底部的菌絲體生長時間較長可見串珠狀厚垣孢子，輔助顯微鏡測微標尺可對菌絲的粗細進行測量。
[0026]步驟3所述的分子鑑定中，採用CTAB法提取真菌DNA，PCR擴增所用引物為ITSl和 ITS4 ;PCR 反應體系(25 μ I)包括:2.5 μ 110 XPCR 緩衝液，0.4 μ I dNTP,l.5μ I Mg2+,
1.5μ I ITS1,1.5μ I ITS4,0.2μ I Taq 酶，15.4μ I ddH20, 2 μ I DNA 模板。擴增反應在 PCR儀Perkin Elmer上進行,如下PCR循環:94°C預變性3min,循環I次；94°C變性Imin, 5TC退火lmin，72°C延伸lmin，30次循環；最後72°C延伸lOmin。PCR擴增產物為上海生工生物工程有限公司進行測序。對所測序列提交美國國立生物技術信息中心資料庫進行比對，初步確認其分類學地位。
[0027]步驟4.4所述的150 μ I的懸浮液約含150粒硬葉蘭種子，所述的培養條件為:光照強度為 2000 - 3000Lx，溫度 25±2°C，光周期 12h/12h L/D。
[0028]步驟4.5所述的種子萌發和原球莖發育情況參照文獻Stewart&Zettler(2002)的方法對種子萌發和原球莖發育情況進行分級，分為5個階段:階段O描述為種胚透明，種皮完好，種子未萌發；階段I描述為種胚吸水膨脹；階段2描述為種胚繼續膨大，突破種皮，視為萌發；階段3描述為出現原生分生組織，即形成原球莖；階段4描述為長出第一片葉片；階段5描述為第一片葉片繼續生長，變長。
[0029]所述的培養數周要根據種子萌發情況確定，本項發明中選擇8至10周，因種子大部分已萌發且有些已達到幼苗階段。
[0030]參考文獻為:DixonK.1987.Modern orchid growing for pleasure andprofit, orchid club of south Australia:1nc., Adelaide.；McKendrick SL, LeakeJR,Taylor DL,Read DJ.2000.Symbiotic germination and development ofmyco-heterotrophic plants in nature:ontogeny of Corallorhiza trifida andcharacterization of its mycorrhizal fung1.New Phytologist145:523-537.；Stewart SL, Zettler Lff.2002.Symbiotic germination of three sem1-aquatic reinorchids(Habenaria repens, H-quinquiseta, H-macroceratitis)from Florida.AquaticBotany72:25-35.。
[0031]與現有技術相比，本發明具備如下顯著優益性:
[0032]蘭科植物種子的萌發可以通過非共生萌發培養和共生萌發培養兩種方式。雖然大多數蘭科植物可通過非共生萌發培養，且具有較高的萌發率，但是此方式獲得的幼苗移植到自然界中，生長緩慢，抗病原微生物能力差，存活率較低，同時由於很難與後接觸的真菌建立共生關係而導致後繼生長嚴重受阻。共生萌發培養技術是指在特定的基質(培養基)中同時播種植物種子和共生真菌，該方法可以提高種子的萌發率、幼苗的生長速度以及移植到自然環境後的幼苗存活率。由於蘭科植物種子與真菌的共生關係具有專一性，不同蘭科植物種子的共生真菌不同，確定能與硬葉蘭種子形成共生關係並促進其萌發的有效真菌是培育硬葉蘭幼苗的關鍵環節，是開展硬葉蘭原生境回歸工作的基礎。本發明的菌株通過共生萌發實驗將硬葉蘭種子和不同的真菌及對照分別在燕麥培養基上培養，通過種子萌發率的比較，成功的獲得促進硬葉蘭種子萌發的有效菌株，從而為利用硬葉蘭種子和真菌共生萌發來高效培育種苗開闢了一條新的途徑。
[0033]本發明從遷地共生萌發產生的原球莖中分離到的CGMCC N0.7553菌株， 即本發明收集硬葉蘭原生地植株周圍的枯枝落葉、樹皮、苔蘚和腐殖質等作為培養基質，和硬葉蘭的種子在實驗室進行遷地共生萌發，誘導種子萌發產生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌後在無菌條件下用人工培養基培養，誘導原球莖中的內生真菌生長，待長出菌絲時，進行真菌的純化，獲得純菌落，並進行真菌的分子鑑定和保存。此菌株不僅能顯著促進硬葉蘭種子萌發，且能顯著促進原球莖的形成以及顯著促進原球莖後續發育成幼苗。說明只有接種菌株CGMCC N0.7553在光照條件下才能有效促進硬葉蘭種子生長發育到幼苗階段。
【具體實施方式】
[0034]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下通過實施例及試驗數據，對本發明進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0035]實施例1:
[0036]利用種子與真菌在培養基內的共生萌發實驗來檢測分離到的真菌是否對種子萌發階段有促進效果以及對比不同真菌對種子萌發階段促進效果的差異: [0037]1、首先獲取膠膜菌菌株(保存編號=CGMCC N0.7553):
[0038]本發明從遷地共生萌發產生的原球莖中分離得到CGMCC N0.7553菌株:收集硬葉蘭原生地植株周圍的枯枝落葉、樹皮、苔蘚和腐殖質等作為培養基質，和硬葉蘭的種子在實驗室進行遷地共生萌發，誘導種子萌發產生原球莖，將獲得的原球莖表面滅菌後在無菌條件下用人工培養基培養，誘導原球莖中的內生真菌生長，待長出菌絲時，進行真菌的純化，獲得純菌落。
[0039]通過將硬葉蘭種子與不同的真菌種類共同培養於燕麥培養基，在人工培養箱內25±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養，結果顯示此菌株能與原球莖形成共生關係並顯著促進硬葉蘭種子萌發至幼苗生長；同時通過菌落、顯微形態學特徵和分子生物學手段確定此真菌的分類學地位並保存之。
[0040]真菌分類學地位的確定:
[0041]形態特徵觀察:本發明的編號為CGMCC N0.7553的膠膜菌株在PDA平板上培養7天其菌落白色略帶灰色，棉絮狀，圓周狀發散生長，氣生菌絲白色中等略顯稀疏；顯微形態特徵:分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠處形成隔膜，菌絲粗3.0 - 5.5 μ m ;培養兩周以上形成串珠狀的厚垣孢子。
[0042]分子生物學鑑定:取出保存的真菌菌株，在超淨工作檯上用無菌接種針挑取菌絲接入滅菌後的液體馬鈴薯葡萄糖O3DB)培養基中。放入震蕩搖床內25±2°C震蕩培養。培養時間視真菌的生長速度而定，一般為3 - 6天。抽濾約IOOmg的菌絲體，採用常規CTAB法提取DNA，選擇ITSl和ITS4為引物進行PCR擴增反應並對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對檢測含有目標片段的樣品進行測序。將得到的ITS片段序列提交美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),並進行BLAST對比分析，獲取GenBank號為:KC796458.1。所得到的ITS序列與登錄號為⑶166407.1的真菌Tulasnellacalospora最為相似,最大相似度達到98%,結合形態學分類特徵確定分離到的真菌為膠膜菌屬真菌。本發明上述菌種已採用試管斜面法於2013年04月28日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保存編號=CGMCC N0.7553 ;保存期限:30年。同時本實驗室內將菌株接種於若干支試管斜面，於25±2°C黴菌培養箱培養14d後置於4°C冰箱保藏備用。
[0043]2、共生萌發培養基
[0044]所用培養基為燕麥瓊脂培養基(OMA，4g -1燕麥粉+8g -1瓊脂，PH=5.6 - 5.8)。將配好的培養基倒在旋口瓶中，旋緊瓶蓋，滅菌(121°C，20min)後備用。
[0045]3、供試菌株重培養
[0046]將保存於4°C試管斜面內的供試菌株取出，重新接種在PDA培養基上，置於人工氣候箱內25±2°C條件下進行活化。待真菌菌絲快長滿培養皿時取出作為共生萌發材料。
[0047]4、種子滅菌
[0048]實驗前將儲存在_20°C中的種子取出，放在室溫下10個小時，使種子溫度恢復至室溫。將少量種子放在紙質的種子包內，用訂書釘將紙袋封好。將裝有種子的紙袋浸泡在蒸餾水中5 - 10分鐘，輕輕的擠壓出氣泡。用鑷子將紙袋轉移到盛有次氯酸鈉溶液(有效氯離子濃度為1%)及一滴洗滌劑的燒杯中，輕輕攪拌或搖動燒杯。10分鐘後，將紙袋移至超淨工作檯，用無菌鑷子將紙袋轉移到盛有無菌蒸餾水的燒杯中，輕輕搖動。重複衝洗種子3 - 4次。輕輕擠壓出紙袋內多餘的水，用無菌剪刀剪開紙袋，即可獲得滅菌種子。
[0049]5、播種與培養
[0050]在文獻Dixon (1987)所用方法的基礎上稍作修改。將無菌種子與Ig.L-1無菌瓊脂溶液製作成無菌種子懸浮液。在OMA培養基表面平行放置兩片半徑為6cm的半圓形無菌尼龍布(孔徑為45 μ m)，用移液槍吸取150 μ I種子懸浮液均勻播種在每片尼龍布上。在培養基中間接種約0.5cm3(lXlX0.5cm)含有單一真菌純培養物的瓊脂塊，用封口膜將培養皿密封好。一組接種從硬葉蘭原球莖中分離得到的編號為CGMCC N0.7553的菌株，一組接種從兜唇石斛原球莖內分離到的編號為FDaI7的菌株，對照組(CK)不接菌。每組重複14個培養皿，在人工培養箱內25±2°C下恆溫培養，每組各7個培養皿分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養。用封口膜密封后置於人工氣候箱中培養。培養條件為:光照強度為2000 - 3000Lx，溫度25±2°C，光周期12h/12h L/D。
[0051]6、檢測
[0052]播種後每周檢測種子萌發情況，記錄種子萌發及形成原球莖的時間。當有培養皿中產生大量處於發育初期階段的幼苗時將全部培養皿取出，在顯微鏡下觀察記錄種子萌發及原球莖發育情況。在Stewart&Zettler (2002)對種子萌發和原球莖發育情況的分級標準基礎之上稍作調整，對種子萌發情況進行分級，統計各處理下的種子萌發率(G)、形成原球莖比率(C)以及處於各萌發階段的種子、原球莖或幼苗的比率(K)。
[0053]培養5周後，接種從硬葉蘭原球莖中分離到的CGMCC N0.7553菌株和接種從兜唇石斛原球莖中分離到的FDaI7菌株的種子都萌發了(萌發率分別為74.72%±16%，69.82%土 12%)。但接種CGMCC N0.7553菌株的實驗組在階段3、階段4和階段5三個階段的種子數比率(分別為29.30%, 13.63%，12.04%)要高於接種FDaI7菌株實驗組的種子數比率(分別為13.51%，1.36%，1.67%)，且在階段4和階段5存在顯著性差異。說明CGMCC N0.7553菌株是對硬葉蘭種子萌發以及原球莖發育有效的共生真菌。
【權利要求】
1.一種膠膜菌屬(Tulasnella)真菌菌株(CGMCC N0.7553)。
2.如權利要求1所述的菌株(CGMCCN0.7553)，其特徵在於所述菌株(CGMCC N0.7553)的nrDNA ITS序列提交美國國立生物技術信息中心資料庫(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)，序列號為 KC796458.1。
3.如權利要求1所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7553)，其特徵在於所述菌株(CGMCC N0.7553)的生物學特徵為:菌株在PDA平板上培養7天其菌落白色，氣生菌絲髮達，圓周狀發散生長，略顯稀疏，菌絲具隔膜，粗3.0 - 5.5 μ m，多數4 μ m至4.5 μ m分枝近直角，分枝處縊縮，距分枝不遠處形成隔膜；老菌絲細胞壁加厚現象明顯；培養2周後形成串珠狀的厚垣孢子。
4.權利要求1所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7553)在促進硬葉蘭種子萌發上的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7553)通過與原球莖形成共生關係，促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
6.如權利要求4所 述的應用，其特徵在於通過將硬葉蘭種子與不同種類的真菌共同培養於燕麥培養基，在人工培養箱內25 ±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養，使菌株與原球莖形成共生關係，從而促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
7.權利要求1所述的膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCCN0.7553)促進硬葉蘭種子萌發的方法，其特徵在於膠膜菌(Tulasnella)菌株(CGMCC N0.7553)與原球莖形成共生關係，促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於通過硬葉蘭種子與不同種類的真菌共同培養於燕麥培養基，在人工培養箱內25 ±2°C條件下分別在有光條件(光周期為12/12h L/D)和黑暗條件(光周期為0/24h L/D)下培養，菌株與原球莖形成共生關係，進而促進硬葉蘭種子萌發並長成幼苗。
【文檔編號】C12N1/14GK103468587SQ201310424218
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】邵士成, 高江雲, 盛春玲 申請人:中國科學院西雙版納熱帶植物園