群體感應信號分子抑制劑產生菌的鑑別方法及應用的製作方法

2023-07-05 00:17:26 1

專利名稱：群體感應信號分子抑制劑產生菌的鑑別方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及一種鑑別產生群體感應信號分子抑制劑的微生物 的方法，本發明還涉及該方法在製備預防人和畜禽等動物疾病的益生素(微生態製劑)中 的應用。
背景技術：
群體感應(Quorum Sensing，QS)是細菌根據自身細胞密度變化進行自我協調的 一種群體行為。許多細菌能產生並釋放一種被稱為自誘導物(Auto Inducer，Al)的信號 分子，隨著細菌密度的增加，信號分子積累到一定濃度時則會與胞漿受體蛋白結合，調控細 菌相關基因的表達，使細菌形成一種群體行為來有效地抵禦環境壓力、攻擊宿主等。在一些 致病菌(如銅綠假單胞菌、粘質沙雷氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌等)中，群 體感應系統調控相關致病因子的產生，如促進毒素、蛋白酶的產生、黏附、生物膜(Biofilm) 的形成等。大量文獻表明缺失了群體感應系統的菌株其致病能力大大降低，因此細菌群體 感應系統可作為抗感染藥物研發的新靶標。益生素(Probiotic)又稱微生態製劑或活菌製劑，是一類活性微生物添加劑。一 方面，益生素被動物採食後能在消化道特別是腸道內發育、繁殖並起有益作用，能促進動物 生長發育，提高飼料利用率，降低幼畜幼禽死亡率，防止消化道疾病，提高機體免疫力；另一 方面，相對使用抗生素引起的藥物殘留、耐藥菌株產生等問題，作為新型綠色添加劑的益生 素，由於其無殘留、無汙染以及不產生耐藥性等特點，有其獨特的優越之處，因而益生素已 成為在畜禽飼料中很有前途的新型飼料添加劑。通過篩選能產生群體感應抑制劑的微生物作為微生態製劑的出發菌是一個既發 揮了群體感應信號分子抑制劑的作用，抑制病原菌產生群體感應信號分子，抑制其致病因 子的產生，又能發揮微生態製劑特性的途徑，從而為人及動物疾病的預防提供更好的方法。

發明內容
本發明的目的是針對上述技術問題提供一種鑑別產生群體感應分子抑制劑的微 生物的方法。本發明的另一個目的是提供採用上述方法得到的微生物所製備的微生物在製備 預防人或動物疾病的益生素中的應用。本發明的目的是通過下列技術措施實現的一種鑑別產生群體感應信號分子抑制劑的微生物的方法，包括下列步驟a、將含微生物的樣品用無菌生理鹽水稀釋，取100 μ 1接種於IOml含有500 μ g/L 群體感應信號分子(acyl-homoserine lact0ne，AHLs，N-醯基高絲氨酸內酯)的KG液體培 養基中，28-37°C，200rpm搖床培養24h，轉接到相同培養基中，連續3次後將獲得的增菌液 稀釋塗布於LB瓊脂平板上，獲得單個菌落；b、挑取獲得的單個菌落做一字型接種於LB瓊脂平板中央，28-37°C培養12_24h ；
C、將 5ml 含有 106CFU/ml 指示菌紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum) ATCC12472 或者農桿菌(Agrobacterium tumfaciens) KYC6 的 45_50°C保溫的 0. 5% LB 瓊脂 傾倒於步驟b所獲得的平板上，24-48h培養，在平板中央分離菌周圍未產生紫色或者藍色 色素的，說明該菌能產生群體感應信號分子抑制劑。所述的方法，其中步驟a所用KG液體培養基每升含有氯化鈉l.Og，氯化 鉀0. 5g，氯化鎂0. 4，氯化鈣0. Ig,硫酸鈉0. 15g，磷酸二氫鉀5. Og, 2-(N-morpholino) ethanesulfonicacid (MES，2_嗎啉乙磺酸)1. Og,另含Img氯化鐵，0. Ig氯化錳，0. 46g氯化 鋅以及500yg C4_14-HSL，其餘為水。所述的方法，其中LB瓊脂平板是在LB液體培養基中加入1. 5襯％的瓊脂，LB液體 培養基每升含有胰蛋白腖10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化鈉10. 0g，其餘為水，PH為7. 0-7. 5。採用上述鑑別方法得到的能產生群體感應信號分子抑制劑的微生物在製備預防 人或動物疾病的益生素中的應用。運用該方法製備益生素(微生態製劑)，能夠有效的抑制致病菌群體感應分子的 活性，從而抑制致病菌的致病性。進一步，運用該技術製備益生素預防人及畜禽疾病。本發明技術方案的分析，在第一步中，微生物產生群體感應信號分子 (acyl-homoserine lactone，AHLs，N-醯基高絲氨酸內酯)抑制劑能夠降解C4_14_HSL (是群 體感應信號分子中的一種)，從而利用C4_14-HSL提供的C源、N源進行生長，而且不產生群 體感應信號分子抑制劑的微生物則不能生長。第二步LB瓊脂培養基可適合微生物生長；第三步確認該微生物能夠群體感應信號分子抑制劑，因為抑制劑能抑制指示菌紫 色色桿菌ATCC12472產生紫色(以農桿菌KYC6為指示菌則為藍色)，培養皿中央可見有菌 落線(說明微生物能夠生長)，周圍呈現紫色，說明指示菌也能生長。但中間不顯示紫色，說 明存在能抑制指示菌產生紫色的抑制劑。本發明可用於鑑別的微生物包括細菌、真菌、放線菌等。本發明的有益效果1、本方法簡單易得，不需要昂貴的設備，檢測目標明確。2、本方法成本低廉，可迅速獲得能產生群體感應抑制劑的微生物，可大規模篩選 能產生群體感應抑制劑的微生物。3、能夠產生細菌群體感應信號分子抑制劑，可抑制致病菌群體感應信號分子的活 性，從而抑制致病菌致病因子相關基因的表達，從而有效地控制致病菌的感染。4、該方法篩選的菌作為微生態製劑的出發菌，能夠促進人和動物正常菌群的平 衡，有效刺激腸道黏膜免疫，提高飼料率用率。


圖1是產群體感應信號分子抑制劑菌篩選示意圖。圖2是群體感應信號分子產生菌抑制色素產生的照片。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述，其中採用的菌種僅為了使本領域普通技術人員理解本發明而舉例用，不可理解為本發明的方法僅能用於這幾個具體的菌篩選。實施例中所用的菌種購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)。C6-HSL (N-hexanoyl-L-homoserinelactone，購自 Sigma 公司)指含有 6 個 C 原子 數的側鏈，C4 C14都可以。實施例1產群體感應信號分子抑制劑芽孢菌的篩選，具體操作如下1、取含有微生物的土樣Ig置於IOml無菌生理鹽水中100°C水浴lOmin，2、取100 μ 1上述樣品液接種於IOml含有500 μ g/L群體感應信號分子 (acyl-homoserinelactone，AHLs，N-醯基高絲氨酸內酯)的KG液體培養基中(250ml的三 角燒瓶)，30°C，200rpm搖床培養24h。3、取100 μ 1轉接到KG液體培養基中，連續3次後將獲得的增菌液稀釋塗布於LB 瓊脂平板上，獲得單個菌落。(KG液體培養基每升含有氯化鈉1.(^，氯化鉀0.58，氯化鎂0.4，氯化鈣0. lg，硫 酸鈉 0. 15g，磷酸二氫鉀 5. Og, 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid(MES，2-嗎啉乙磺 酸)1.0g，另含Img氯化鐵，0. Ig氯化錳，0. 46g氯化鋅以及500yg C6-HSL，其餘為水。LB 瓊脂平板是在LB液體培養基中加入1. 5襯％的瓊脂，LB液體培養基每升含有胰蛋白腖 10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化鈉10. 0g，其餘為水，pH為7. 0-7. 5。)4、挑取獲得的單個菌落做一字型接種於LB瓊脂平板中央，30°C培養24_48h ；5、將5ml含有106CFU/ml指示菌紫色色桿菌ATCC12472的45_50°C保溫的0. 5% LB瓊脂傾倒於步驟4所獲得的平板上，24-48h培養，在平板中央分離菌周圍未產生紫色色 素，說明該菌能產生群體感應信號分子抑制劑(圖2)。圖2中可見培養皿中央可見有菌落線，說明分離的微生物能夠生長，周圍呈現紫 色，說明指示菌也能生長，但中間不顯示紫色，說明中央菌落線的微生物產生了能夠抑制指 示菌紫色色桿菌ATCC12472產生紫色的抑制劑。該分離的微生物可用於製備預防人或動物疾病的益生素。製備益生素的方法為本 領域技術人員熟知的技術。實施例2 操作過程如實施例1，所不同的是指示菌採用農桿菌(Agrobacterium tumfaCiens)KYC6，培養皿周圍呈現藍色，中央菌落線周圍不顯色。 該分離的微生物可用於製備預防人或動物疾病的益生素。製備益生素的方法為本 領域技術人員熟知的技術。
權利要求
一種鑑別產生群體感應信號分子抑制劑的微生物的方法，其特徵在於包括下列步驟a、將含微生物的樣品用無菌生理鹽水稀釋，取100μl接種於10ml含有500μg/L群體感應信號分子N 醯基高絲氨酸內酯的KG液體培養基中，28 37℃，200rpm搖床培養24h，轉接到相同培養基中，連續3次後將獲得的增菌液稀釋塗布於LB瓊脂平板上，獲得單個菌落；b、挑取獲得的單個菌落做一字型接種於LB瓊脂平板中央，28 37℃培養12 24h；c、將5ml含有106CFU/ml指示菌紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)ATCC12472或者農桿菌(Agrobacterium tumfaciens)KYC6的45 50℃保溫的0.5％LB瓊脂傾倒於步驟b所獲得的平板上，24 48h培養，在平板中央分離菌周圍未產生紫色或者藍色色素的，說明該菌能產生群體感應信號分子抑制劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其中步驟a所用KG液體培養基每升含有氯化鈉 1. Og,氯化鉀0. 5g，氯化鎂0. 4，氯化鈣0. Ig,硫酸鈉0. 15g，磷酸二氫鉀5. Og, 2-嗎啉乙磺 酸1. 0g，另含Img氯化鐵，0. Ig氯化錳，0. 46g氯化鋅以及500 μ g C4_14_HSL，其餘為水。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於LB瓊脂平板是在LB液體培養基中加入 1. 5襯％的瓊脂，LB液體培養基每升含有胰蛋白腖10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化鈉10. 0g，其餘 為水，pH 為 7. 0-7. 5。
4.採用權利要求1所述鑑別方法得到的能產生群體感應信號分子抑制劑的微生物在 製備預防人或動物疾病的益生素中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，公開了群體感應信號分子抑制劑產生菌的鑑別方法及應用。該方法通過將含有微生物的樣品接種於含有N-醯基高絲氨酸內酯的KG培養基中進行增菌後接種在LB平板上獲得單個菌落，採用指示菌紫色色桿菌或農桿菌進行檢測，分離菌周圍不產生色素表明該菌能夠產生群體感應信號分子抑制劑。該技術可用於人和動物上作為疾病預防的益生素的篩選及應用。該技術具有方法簡單，能有效控制致病菌致病因子的產生，同時又提高動物黏膜免疫功能，提高飼料利用率的特點。
文檔編號C12Q1/04GK101914607SQ20101023670
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月26日 優先權日2010年7月26日
發明者儲衛華 申請人:儲衛華;江蘇星海動物藥業科技有限公司