一種可注射型生物活性人工骨材料及製備方法和應用的製作方法

2023-07-05 01:36:51 1

一種可注射型生物活性人工骨材料及製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種可注射型生物活性人工骨材料及製備方法，屬於醫藥【技術領域】。本發明中的可注射型生物活性人工骨材料由固相和液相兩部分按固液比（0.8～1.2）g：1ml調和配製；其中所述的固相包括磷酸鹽混合物和碳二亞胺；所述的磷酸鹽混合物和縮合劑的質量比為10:1；所述的磷酸鹽混合物為摩爾比1:2混合的磷酸四鈣和磷酸氫鈣。所述的液相包括水、殼聚糖和檸檬酸，其中水：殼聚糖：檸檬酸的質量比為100：（1～2）：（4～5）。本發明採用碳二亞胺型縮合試劑來實現生物活性分子與殼聚糖衍生物的共價偶聯。上述可注射型生物活性人工骨材料在製備人工骨中廣泛應用。
【專利說明】一種可注射型生物活性人工骨材料及製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥【技術領域】，具體涉及一種可注射型生物活性人工骨材料及製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]磷酸鈣骨水泥是目前採用最多的可注射性骨修復材料，但作為組織工程支架，磷酸鈣骨水泥的最大缺陷是孔隙小，不利於細胞長入，且固化速度較慢。由於固化後，顆粒狀的鈣磷鹽易流失、移位，固化後強度低。另一種自固化骨水泥PMMA，存在固化過程放熱，生物惰性，與自體骨結合差，殘餘單體對人體有害等缺陷，其在臨床的使用已受到置疑。
[0003]目前可注射骨組織工程支架材料的研究和開發多集中在軟骨方面，在骨組織工程的研究和開發較少。為數不多的可注射型組織工程支架材料是可注射藻酸鈣、纖維蛋白凝膠等生物材料。注入體內後多為凝膠狀，易於流失，並且不具備一定的力學強度，對於要求有一定強度的骨缺損修復而言，顯然是不適宜的。但可注射組織工程支架材料注射前是流態，易於種子細胞的負載和複合生長因子。注射後根據骨缺損形狀自由塑型固化，操作簡單，固化後的強度可達到或超過自體松質骨，便於臨床使用。故新型可注射組織工程支架的研究將發揮組織工程技術和微創外科技術的優勢，更好地為廣大患者服務。

【發明內容】

[0004]針對現有技術的缺陷和不足，本發明的首要目的在於提供一種可注射型生物活性人工骨材料。
[0005]本發明的另一目的在於提供上述可注射型生物活性人工骨材料的製備方法。
[0006]本發明的再一目的在於提供上述可注射型生物活性人工骨材料的應用。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:一種可注射型生物活性人工骨材料，由固相和液相兩部分按固液比(0.8~1.2) g:lml調和配製；
[0008]所述的固相包括磷酸鹽混合物和縮合劑；所述的磷酸鹽混合物和縮合劑的質量比優選為10:1 ；
[0009]所述的液相包括水、殼聚糖和檸檬酸，其中水:殼聚糖:檸檬酸的質量比為100:(1 ~2):(4 ~5);
[0010]所述的磷酸鹽混合物為摩爾比1: 2混合的磷酸四鈣和磷酸氫鈣；
[0011]所述的縮合劑優選為碳二亞胺；
[0012]本發明的可注射型生物活性人工骨材料的製備方法，包括下列步驟:
[0013](1)將磷酸四鈣與磷酸氫鈣按照摩爾比1:2混合，在無水乙醇介質中球磨混合，在80°C下烘乾，製得磷酸鹽混合物；
[0014](2)將步驟(1)製得的磷酸鹽混合物與碳二亞胺按質量比10:1混合均勻，製得固相；
[0015](3)將殼聚糖、檸檬酸和水按照質量比(1~2): (4~5):100的比值進行混合，並充分攪拌，製得液相；
[0016](4)將步驟(2)中製備的固相與步驟(3)中製備的液相按固液比(0.8~1.2) g:1ml調和配製，製得可注射型生物活性人工骨材料。
[0017]步驟(3)中所述的殼聚糖的脫乙醯度為70~100%，重均分子量為2000~100萬。
[0018]上述可注射型生物活性人工骨材料在製備人工骨中應用。
[0019]本發明採用碳二亞胺型縮合試劑來實現生物活性分子與殼聚糖衍生物的共價偶聯。
[0020]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:
[0021]1.本發明採用磷酸四鈣與磷酸氫鈣按照摩爾比1:2混合製備獲得的磷酸鈣鹽的複合配方，使材料體系具有適宜的固化速度。
[0022]2.本發明中採用生物降解交聯劑碳二亞胺，共價交聯殼聚糖；採用天然產物氫鍵交聯殼聚糖，使形成的高分子框架結構較好"固定"鈣磷鹽，防止體液衝蝕。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0024]實施例1
[0025](1)將磷酸四鈣與磷酸氫鈣按照摩爾比1: 2混合，在無水乙醇介質中球磨混合，在80°C下烘乾，製得磷酸鹽混合物；
[0026](2)將步驟(1)製得的磷酸鹽混合物與碳二亞胺按質量比10:1混合均勻，製得固相；
[0027](3)將殼聚糖、檸檬酸和水按照質量比1:4:100的比值進行混合，並充分攪拌，製得液相；
[0028](4)將步驟(2)中製備的固相與步驟(3)中製備的液相按固液比0.8g:1ml調和配製，製得可注射型生物活性人工骨材料。
[0029]實施例2
[0030](1)將磷酸四鈣與磷酸氫鈣按照摩爾比1: 2混合，在無水乙醇介質中球磨混合，在80°C下烘乾，製得磷酸鹽混合物；
[0031](2)將步驟(1)製得的磷酸鹽混合物與碳二亞胺按質量比10:1混合均勻，製得固相；
[0032](3)將殼聚糖、檸檬酸和水按照質量比2:5:100的比值進行混合，並充分攪拌，製得液相；
[0033](4)將步驟(2)中製備的固相與步驟(3)中製備的液相按固液比Ig:lml調和配製，製得可注射型生物活性人工骨材料。
[0034]實施例3
[0035](1)將磷酸四鈣與磷酸氫鈣按照摩爾比1: 2混合，在無水乙醇介質中球磨混合，在80°C下烘乾，製得磷酸鹽混合物；
[0036](2)將步驟(1)製得的磷酸鹽混合物與碳二亞胺按質量比10:1混合均勻，製得固相；
[0037](3)將殼聚糖、檸檬酸和水按照質量比1:5:100的比值進行混合，並充分攪拌，製得液相；
[0038](4)將步驟(2)中製備的固相與步驟(3)中製備的液相按固液比1.2g:1ml調和配製，製得可注射型生物活性人工骨材料。
[0039]實施例4人臍帶間充質幹細胞的提取、培養及誘導
[0040](I)健康臍帶的獲得:委託暨南大學附屬第一醫院婦產科建立產婦體檢健康檔案，徵得本人及家屬同意後籤訂合約，對計劃生產的產婦提前半年定期提供包括血常規、生化，HIV、梅毒、各型肝炎病毒等傳染性疾病，腫瘤標誌物等檢測，篩選健康的產婦，在其分娩後取得臍帶，臍帶及新生兒建檔，建立供者隨訪制度。
[0041](2)幹細胞的提取:剝離臍帶上的動靜脈，經緩衝液衝洗後剪碎，先後經質量分數為0.1%的膠原酶I1、質量分數為0.25%的胰酶消化10~20min，收集懸浮細胞，接種於含有F-12完全培養液的塑料培養瓶中，置於37°C，體積分數5%C02培養箱培養，定期換液。
[0042](3)生物反應器裡的培養:觀察細胞80%融合時，質量分數0.25%胰酶消化衝洗。取一定數量的細胞與預先水化的Cytodex-3型微載體按比例混合於F-12完全培養基，置於生物反應器內，起始培養體積佔反應器容積的一半，細胞貼壁後，培養體積逐漸增加至反應器容積。脈衝動力隨培養體積增加，直至恆定。其後定期換液、添加微載體實行連續培養。期間可取樣幹細胞標記物檢測。
[0043](4)幹細胞的成骨誘導:取樣觀察微載體上的細胞多數融合後，改用含地塞米松IX 10-8mol/L、β -甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C50ug/ml的成骨誘導的F-12培養液，連續培養8-10天後，獲得成骨細胞，即可與材料複合使用。期間取樣做成骨細胞標記物檢測。
[0044]實施例5動物試驗
[0045]取3~4月齡同種紐西蘭兔,在胚骨上端作骨缺損模型,缺損約IOX 5X 5mm,去骨皮質，深達骨髓腔，不衝洗，在實施例1中製備的可注射型生物活性人工骨材料固化前加入實施例4誘導製備的成骨細胞一併注入(兩者比例為質量比10:1)缺損內，材料不超出正常骨皮質，縫合傷口，進行動物飼養；分別於手術後1、2、4、6、8、12、18、24個月進行X線，ECT檢測和骨密度測定，組織學檢測、病理學檢測、骨成分檢測。結果發現手術後的24月內缺損的脛骨上端的得到了恢復 ，並且人工骨沒有出現變形等問題。
[0046]實施例6動物試驗
[0047]取3~4月齡同種紐西蘭兔，建立兔腰椎椎間融合模型，取出椎間盤組織，刮除上下椎板，以骨質微滲血為度，在實施例1中製備的可注射型生物活性人工骨材料固化前加入實施例4誘導製備的成骨細胞一併注入(兩者比例為質量比10:1)椎體間隙，使材料局限於間隙內，待材料完全固化堅硬後縫合傷口，進行動物飼養；分別於手術後1、2、4、6、8、12、18、24個月進行X線，ECT檢測和骨密度測定，組織學檢測、病理學檢測、骨成分檢測。結果發現術後的24月內兔腰椎椎間融合。
[0048]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種可注射型生物活性人工骨材料，其特徵在於由固相和液相兩部分按固液比(0.8~1.2) g:lml調和配製； 所述的固相包括磷酸鹽混合物和縮合劑；所述的磷酸鹽混合物和縮合劑的質量比為.10:1 ； 所述的液相包括水、殼聚糖和檸檬酸，其中水:殼聚糖:檸檬酸的質量比為100: (I~.2):(4 ~5)。
2.根據權利要求1所述的可注射型生物活性人工骨材料，其特徵在於:所述的磷酸鹽混合物為摩爾比1:2混合的磷酸四鈣和磷酸氫鈣。
3.根據權利要求1所述的注射型生物活性人工骨材料，其特徵在於:所述的縮合劑為碳二亞胺。
4.權利要求1~3任一項所述的可注射型生物活性人工骨材料的製備方法，其特徵在於包括下列步驟: (1)將磷酸四鈣與磷酸氫鈣按照摩爾比1:2混合，在無水乙醇介質中球磨混合，在80°C下烘乾，製得磷酸鹽混合物； (2)將步驟(1)製得的磷酸鹽混合物與碳二亞胺按質量比10:1混合均勻，製得固相； (3)將殼聚糖、檸檬酸和水按照質量比(I~2):(4~5):100的比值進行混合，並充分攪拌，製得液相； (4)將步驟(2)中製備的固相與步驟(3)中製備的液相按固液比(0.8~1.2)g:lml調和配製，製得可注射型生物活性人工骨材料。
5.根據權利要求4所述的可注射型生物活性人工骨材料的製備方法，其特徵在於:步驟(3)中所述的殼聚糖的脫乙醯度為70~100%，重均分子量為2000~100萬。
6.權利要求1~3任一項所述的可注射型生物活性人工骨材料在製備人工骨中應用。
【文檔編號】A61L27/00GK103736149SQ201310729315
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】李志忠, 孫國棟, 焦延鵬 申請人:暨南大學