睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑑定奶牛胚胎性別的方法
2023-07-04 19:46:06 1
專利名稱:睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑑定奶牛胚胎性別的方法
技術領域：
本發明涉及睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑑定奶牛胚胎性別的方法。
背景技術：
一直以來，人們就渴望控制家畜的性別，特別是對於有經濟價值的家畜，如牛、羊、豬等。對早期胚胎尤其是附植前胚胎進行性別鑑定，再進行移植，在畜牧生產中具有重要的科學研究價值和商業應用價值。鑑定胚胎性別的方法主要有細胞遺傳學分析、X染色體關聯酶活性的測定、胚胎發育率差異性分析、雄性特異性抗原的探測以及Y染色體特異性DNA探針的應用。雖然使用流式細胞分類儀已成功分離了X、Y精子，並且有商品化的精液出售，但兩種限制因素依然存在，即分選的速度(可用性和價格)和受精率。一時還很難像常規精液一樣在實際生產中大面積推廣。胚胎移植技術的廣泛應用為控制家畜性別創造了另一條新途徑。如果一個胚胎在移植之前能夠確定性別，移植那些理想性別的胚胎，就可以達到性別控制的目的。隨著胚胎移植技術的產業化推廣，早期胚胎的性別鑑定技術日益發展成熟，對奶牛早期胚胎進行性別鑑定也是奶牛性別控制的有效途徑之一。
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction。以下簡稱PCR)技術的出現，為性別鑑定提供了新的思路。PCR法因其特異性強、靈敏度高、快速、簡便、經濟等優點，在家畜早期胚胎的性別鑑定中佔有越來越重要的位置，其實質就是Y-染色體特異性片段或Y-染色體上的性別決定基因的檢測技術。Herr等利用PCR技術，通過擴增牛胚胎的性別決定基因(SRY)鑑定胚胎性別(Herr CM，Theriogenology，1990，33247-248)。我國的曾溢淘等採用兩對引物兩次擴增牛的雄性單拷貝基因SRY基因鑑定了胚胎性別(曾溢淘，科學通報，1992，37479-480)。但由於SRY基因是單拷貝基因，其靈敏度較低，需擴增2次，而且擴增產物均採用凝膠電泳進行檢測，一般的應用單位不具備條件，所需時間也比較長。Bredbacka針對牛Y染色體高度重複序列區btDYZ-1設計出能擴增出數千kb產物的引物，不用凝膠電泳的方法鑑定胚胎性別，但是無組內對照，易出現假陰性，引起誤判(Bredbacka P，Theriogenology，1995，44167-176)。陳從英等採用嵌套式引物鑑定牛早期胚胎性別(畜牧獸醫學報，2003，34(3)209～212)，但巢式PCR法擴增雄性特異基因並採用電泳的方法檢測產物，擴增過程中需2次加入引物，花費的時間較長。奶牛胚胎性別鑑定技術是否成功，取決於其靈敏度和穩定性。由於從胚胎取得的細胞樣品細胞數目較少，其靈敏度如何至關重要。由於SRY、ZFY(鋅指結構蛋白基因)等為單拷貝基因，國內外多採取相同引物對兩次擴增法或套式PCR法。我國已利用牛的SRY基因和ZFY基因等建立了牛胚胎性別鑑定的PCR技術，但在該技術產業化方面的工作還比較薄弱。
發明內容本發明的技術任務是提供一種睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑑定奶牛胚胎性別的方法。
本發明的技術任務是按以下方式實現的，該序列引物為5』-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3』5』-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3』。
以及所述的睪丸特異蛋白基因序列引物在奶牛胚胎性別鑑定中的應用。
非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，該方法如下步驟先對胚胎分割取樣，然後，採用鹼處理法提取樣品中胚胎細胞DNA模板，將胚胎細胞DNA模板分別放入兩個PCR反應管中；之後，其中一管加入睪丸特異蛋白基因序列引物和反應溶液，另一管加入雌雄共有序列引物和反應溶液，在相同PCR反應程序下進行PCR擴增，PCR反應結束後直接將PCR反應管置於紫外燈下激發檢測，觀察管內螢光，根據螢光的有無或強弱來判斷睪丸特異蛋白基因片段是否成功擴增，即該胚胎是公牛還是母牛；如果，兩管同時出現螢光，則判斷胚胎為公牛；如果只有雌雄共有序列引物反應管出現螢光，則判斷為母牛；如果兩管均無螢光，則表明胚胎取樣失敗。
所述的鹼處理法的步驟先將分割的胚胎樣品轉入預先加入5μl鹼性裂解液的PCR反應管中，50-70℃，5-15min，其中鹼性裂解液包含50mM二硫蘇糖醇和200mM的氫氧化鉀；然後，再加入5μl中和液，中和液包含900mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH8.3，300mM氯化鉀，200mM鹽酸；這樣便獲得了胚胎細胞DNA模板。
所述的反應溶液其中含胚胎樣品溶液5μl，10倍的緩衝溶液，1.5mM氯化鎂，100mM脫氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0-1μl溴化乙錠，ddH2O。
本發明的睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測鑑定奶牛胚胎性別的方法，提高了反應的靈敏度，縮短了性別鑑定所需的時間，不容易產生汙染，而且適合在胚胎移植現場操作，便於在生產實際中推廣應用。
附圖為非電泳檢測鑑定奶牛胚胎性別的方法的流程框圖；具體實施方式
實施例1在培養皿中放3-4滴(每個液滴200μl)磷酸鹽緩衝溶液(PBS)，在體視顯微鏡(SZX7-3121，OLYMPUS)下用MN-151金屬刀片割取胚胎。切割桑椹胚內細胞團的10％左右或囊胚營養外胚層的10％左右樣進行活組織檢查，切割後的胚胎待移植。每切割一枚胚胎需用70％的酒精和滅菌的超純水清洗刀片。將6枚胚胎按上述方法分別進行分割取樣。
將分割後的6個胚胎樣品分別用磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗3次，用移液槍(規格0.5-10μl)分別吸取分割的胚胎樣品(總體積約2μl)，轉入0.2mlPCR反應管中(6個)，每個PCR反應管中預先放入5μl鹼性裂解液(ALB)(ALB的組成50mM DTT和200mM KOH，即50mM二硫蘇糖醇和200mM的氫氧化鉀)，65℃，10min。然後加入5μl中和液(900mM三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，PH8.3，300mM氯化鉀，200mM鹽酸)。這樣便獲得了胚胎細胞的DNA模板溶液約12μl。每份胚胎樣品製備的上述溶液又分別加入雄性特異PCR反應管和雌雄共有PCR反應管中，各加入5μl作為PCR反應模板。其中雄性特異PCR反應管含睪丸特異蛋白基因序列引物(5』-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3』和5』-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3』)。雌雄共有PCR反應管含雌雄共有序列引物(5』-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3』和5』-TCGTGAAAACCGCACACTG-3』)。
反應終體積為50μl。其中含胚胎樣品溶液5.5μl，10倍的緩衝溶液，1.5mM氯化鎂，100mM脫氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0或1μl溴化乙錠，ddH2O。反應程序為95℃4min；94℃1.5min，Tm 1min，72℃30s.35個循環；4℃保存。PCR反應在PTC-200(MJ Research)上進行。產物採用非凝膠電泳法檢測，它是在反應體系中加入溴化乙錠(10μg/ml)後再進行PCR反應，PCR擴增後直接在紫外燈下(302nm)觀察管內螢光，採用數位相機記錄結果。結果第一行得M為雄性對照，含睪丸特異蛋白基因序列引物的雄性特異PCR反應管1，3，6出現紅色螢光；2，4，5無紅色螢光。第二行為含雌雄共有序列引物的雌雄共有PCR反應管M為空白對照(無基因組DNA)，1-6均有螢光，則判定1，3，6為雄性奶牛胚胎，2，4，5為雌性奶牛胚胎。
權利要求
1.睪丸特異蛋白基因序列引物，其特徵在於該序列引物為5』-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3』5』-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3』。
2.權利要求
1所述的睪丸特異蛋白基因序列引物在奶牛胚胎性別鑑定中的應用。
3.非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，其特徵在於該方法如下步驟先對胚胎分割取樣，然後，採用鹼處理法提取樣品中胚胎細胞DNA模板，將胚胎細胞DNA模板分別放入兩個PCR反應管中；之後，其中一管加入睪丸特異蛋白基因序列引物和反應溶液，另一管加入雌雄共有序列引物和反應溶液，在相同PCR反應程序下進行PCR擴增，PCR反應結束後直接將PCR反應管置於紫外燈下觀察管內螢光，根據螢光的有無或強弱來判斷睪丸特異蛋白基因片段是否成功擴增，即該胚胎是公奶牛還是母奶牛；如果，兩管同時出現螢光，則判斷胚胎為公奶牛；如果只有雌雄共有序列引物反應管出現螢光，則判斷胚胎為母奶牛；如果兩管均無螢光，則表明胚胎取樣失敗。
4.根據權利要求
3所述的非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，其特徵在於所述的鹼處理法的步驟先將分割的胚胎樣品轉入預先加入5μl鹼性裂解液的PCR反應管中，50-70℃，5-15min，其中鹼性裂解液包含50mM二硫蘇糖醇和200mM的氫氧化鉀；然後，再加入5μl中和液，中和液包含900mM三羥甲基氨基甲烷—鹽酸，PH8.3，300mM氯化鉀，200mM鹽酸；這樣便獲得了胚胎細胞DNA模板。
5.根據權利要求
3所述的非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，其特徵在於所述的反應溶液其中含胚胎樣品溶液5-6μl，10倍的緩衝溶液，1.5-4mM氯化鎂，100mM脫氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0-1μl溴化乙錠，ddH2O。
專利摘要
本發明雄開了一種睪丸特異蛋白基因序列引物，該序列引物為5』－CCGCCATTACGCCCCCGACTTG－3』5』－GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT－3』。以及用常規PCR方法和非凝膠電泳法來鑑定奶牛早期胚胎性別的方法。本發明的睪丸特異蛋白基因序列引物和非電泳檢測奶牛胚胎性別的方法，提高了反應的靈敏度，縮短了性別鑑定所需的時間，不容易產生汙染，而且適合在胚胎移植現場操作，便於在生產實際中推廣應用。
文檔編號C12N15/11GK1995391SQ200610146220
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月13日
發明者黃金明, 劉玉慶, 遊偉, 張俊功, 譚秀文, 吳乃科, 朱榮生, 柳堯波, 武英, 張秀美 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan