癌基因治療藥物的製作方法

2023-07-04 20:56:21 2

專利名稱：癌基因治療藥物的製作方法
技術領域：
本發明涉及癌基因治療藥物、以及使用該治療藥物的癌基因治療方法。
背景技術：
近年來，關於癌治療，基因治療引人注目，到目前為止提出了各種各樣的基因治療法，並進行了臨床試驗。其中，對於使用載體細胞的基因治療，由Freeman等人進行了臨床試驗。該基因治療使用通過逆轉錄病毒導入了HSV-tk基因的卵巢癌細胞PA-1作為載體細胞，進行了用於卵巢癌治療、以及惡性間皮瘤治療目的的臨床試驗(參照下面的非專利文獻1、2)。另外，Culver等人使用小鼠NIH-3T3細胞作為載體細胞，對腦腫瘤進行了臨床試驗(參照下面的非專利文獻3)。然而，如果考慮到對人適用的癌治療，作為載體細胞要求使用來自人的細胞。
還有Coukos等人進行了使用卵巢癌細胞PA-1作為載體細胞的基因治療(參照下面非專利文獻4)。該基因治療構建了在腫瘤細胞中進行特異增殖的溶瘤病毒(oncolytic virus)，使該病毒感染載體細胞(產毒細胞)，然後將該載體細胞注射到腫瘤部位。作為溶瘤病毒使用單純皰疹病毒1型(HSV-1)，對於裸鼠的卵巢癌腹腔內播散性轉移模型，進行注射到腹腔內的動物實驗(參照下面的專利文獻1、2)。
然而，上述的卵巢癌細胞PA-1雖然是增殖能力高、操作容易的細胞，但細胞質小、容易破壞。因此，即使通過逆轉錄病毒導入HSV-tk基因，HSV-tk基因在腫瘤部位的表達少，所以在Freeman等人的臨床試驗中，對卵巢癌和惡性間皮瘤沒有獲得充分的抗腫瘤效果。
在使用溶瘤病毒HSV-1的癌基因治療中，作為載體細胞使用PA-1時，與單獨溶瘤病毒HSV-1療法相比也沒有獲得明顯的抗腫瘤效果。利用病毒進行癌基因治療的問題在於由於血中的中和抗體的原因而不能多次給予病毒。可以認為使用PA-1時，由於細胞脆弱，病毒產生量也少，因此在通過細胞間相互作用(cell to cellinteraction)感染靶腫瘤細胞之前，細胞被破壞掉，進而病毒直接被中和抗體滅活，不能獲得抗腫瘤效果。
另外在細胞性免疫基因治療的臨床試驗中，作為載體細胞有時使用患者自身的癌細胞或成纖維細胞(fibroblast)，這種情況下，由於直至獲得穩定的細胞系需要時間，手術困難，以及基因導入因個體不同而存在差異，不穩定，所以很難獲得穩定的效果。
非專利文獻1HumanGeneTherapy，6，927-939，1995非專利文獻2Human GeneTherapy，9，2641-2649，1998非專利文獻3Science，256，1550-1552，1992非專利文獻4Clinical Cancer Research，5，1523-1537，1999專利文獻1國際公開第99/45783號論文專利文獻2國際公開第01/23004號論文發明內容發明要解決的課題本發明正是要解決這樣的以往問題而進行的，所以本發明的目的在於挑選出在使用溶瘤病毒的癌基因治療中能夠獲得強力抗腫瘤效果的新的載體細胞，以及確立使用所得到的載體細胞等可獲得顯著抗腫瘤效果的新的癌基因治療法以及提供在該治療法中使用的新的癌基因治療藥物。
用於解決課題的手段本發明者鑑於上述課題進行了不斷研究，結果發現(1)通過使用特定的細胞株作為載體細胞，與以往的載體細胞相比，可獲得強力的抗腫瘤效果，以及(2)預先給予病毒實施免疫處理後，通過給予感染了溶瘤病毒的載體細胞，誘導·引起生物體的CTL反應，可在體內獲得顯著的抗腫瘤效果等，至此完成了本發明。
即，本發明的癌基因治療藥物含有用溶瘤病毒感染並使該病毒作用於腫瘤細胞的載體細胞，該載體細胞從以下(1)～(4)的細胞中選擇。
(1)A549細胞(2)293細胞(3)SW626細胞(4)HT-3(HT-III細胞)如下面所敘述的那樣，在上述4種細胞中，A549細胞的使用特別理想。
溶瘤病毒最好是從腺病毒、皰疹病毒、HIV病毒等慢病毒、逆轉錄病毒、呼腸病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、或其它的溶瘤病毒中選擇。其中由於使用腺病毒可獲得如下面所述那樣的良好結果，所以特別理想。
另外，本發明的溶瘤病毒最好是根據治療對象癌的種類等而含有1A1.3B啟動子(IAI.3B啟動子)、中期因子啟動子、β-HCG啟動子、SCCA1啟動子、cox-2啟動子、PSA啟動子、或其它腫瘤特異性啟動子。而在本發明中溶瘤病毒只要是能感染靶腫瘤細胞、能夠增殖的就可以，例如腺病毒，在其範疇內包括野生型腺病毒。其它溶瘤病毒，如ONYX公司的E1B基因缺失型的溶瘤腺病毒、或UAB大學的E1A基因部分缺損型的Ad5-Δ24腺病毒等不含有腫瘤特異性啟動子的也可以。
將本發明的癌基因治療藥物做成癌治療用藥劑試劑盒的構成，優選進一步含有為誘導生物體對載體細胞的給予所產生的CTL反應而給予的免疫處理用病毒的構成。對於免疫處理用病毒最好使用與溶瘤病毒同種類的病毒。另外對於免疫處理用病毒最好是使用非增殖型的病毒和/或經紫外線等滅活的病毒。通過用紫外線等滅活，可以將從免疫處理用病毒給予至載體細胞給予的期間縮短。
本發明的癌基因治療藥物作為癌治療用藥劑試劑盒，除了含有載體細胞、或載體細胞與溶瘤病毒的配合(或再加上免疫處理用病毒的3者的配合)外，另外還可含有下面(1)～(4)的物質中的1或2種以上物質。
(1)端膠原(atelocollagen)(2)在給予前，使載體細胞感染的GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor粒細胞·巨噬細胞集落刺激因子)表達載體(3)鐵劑(4)卟啉化合物(例如，5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinicacidALA))另外，在給予免疫處理用病毒的同時、或在給予前後，最好是給予用於腫瘤免疫的來自患者腫瘤細胞或認為對與它類似的抗原進行提示的一般可獲得的經放射線照射的腫瘤細胞，本發明的癌基因治療藥物也可以含有用於腫瘤免疫的這樣的經放射線照射的腫瘤細胞。
使用本發明癌基因藥的合適的治療方法是為了誘導生物體對載體細胞的給予所產生的CTL反應，向人給予免疫處理用病毒，經過規定期間後，至少給予人一次用溶瘤病毒感染並使該病毒作用於腫瘤細胞的載體細胞。
在上述癌治療方法中，最好是將從給予免疫處理用病毒至給予載體細胞的期間大致定在2周～13周(更優選3周～4周)。另外最好是(1)免疫處理用病毒的給予量為對於對該病毒呈抗體陰性的患者定在大約105病毒粒子～1011病毒粒子，而另一方面對於對該病毒呈抗體陽性的患者定在大約102病毒粒子～107病毒粒子(因場合不同，也可以給予102病毒粒子或不給予)，(2)通過載體細胞給予溶瘤病毒的1次給予量大約定在109病毒粒子～1014病毒粒子，(3)溶瘤病毒對載體細胞的感染量大約定在0.1病毒粒子/細胞(viral particle/cell以下稱為「vp/cell」)～2000vp/cell(優選5vp/cell～500vp/cell)。
另外，在上述癌基因治療方法中，最好採用下述(1)～(5)的方法。
(1)通過腫瘤內給予方式給予載體細胞。
(2)與載體細胞一起給予端膠原。
(3)給予用溶瘤病毒和GM-CSF表達載體感染的載體細胞。
(4)與載體細胞一起給予鐵劑和/或卟啉化合物(例如5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acidALA))。
(5)在給予免疫處理用病毒的同時、或在其前後，給予用於腫瘤免疫的腫瘤細胞。
發明的效果本發明的癌基因治療藥物由於使用經篩選結果確認在體外(in vitro)和體內(in vivo)都有高的抗腫瘤效果的A549細胞等細胞株作為載體細胞，所以可獲得比以往的載體細胞更強力的抗腫瘤效果。
另外，做成配合了預先給予的免疫處理用病毒和之後給予的載體細胞這2種藥劑的構成時，通過預先給予腺病毒等病毒來實施免疫處理，然後給予用溶瘤病毒感染的載體細胞，從而使該病毒感染靶腫瘤細胞而產生直接的抗腫瘤效果，進一步誘導生物體對感染靶細胞的CTL反應，在體內可獲得顯著的抗腫瘤效果。


圖1是表示通過IC50的細胞數對使用各種細胞株作為載體細胞時對卵巢癌細胞HEY的增殖抑制效果進行研究的結果的圖表。
圖2是表示在單獨使用溶瘤病毒的情況和使用載體細胞的情況下，在病毒抗體存在下，通過IC50的抗腺病毒抗體的抗體效價對卵巢癌細胞HEY的增殖抑制效果進行研究的結果的圖表。
圖3表示對於溶瘤腺病毒感染293細胞等，在病毒抗體存在下，通過IC50的抗腺病毒抗體的抗體效價對卵巢癌細胞HEY的增殖抑制效果進行研究的結果的圖表。
圖4對於293細胞、A549細胞、SW626細胞、HT-3細胞的各載體細胞，通過細胞數對其在病毒抗體存在下對卵巢癌細胞HEY的增殖抑制效果進行研究的結果的圖表。
圖5表示使用將人卵巢癌細胞RMG-1移植到裸鼠皮下形成的10-15mm巨大腫瘤模型，對本發明的癌基因治療藥物的體內抗腫瘤效果進行研究的結果的圖表。
圖6表示使用將人卵巢癌細胞PA-1移植到裸鼠皮下形成的10-15mm巨大腫瘤模型，對本發明的癌基因治療藥物的體內抗腫瘤效果進行研究的結果的圖表。
圖7是表示使用免疫功能正常的皮下腫瘤模型小鼠((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)對本發明的癌基因治療藥物的體內抗腫瘤效果進行研究的結果的圖表。
圖8是通過顯微鏡對腺病毒所的給予所引起的A549細胞的細胞融合進行觀察的圖。
圖9是通過顯微鏡對作為對照沒有給予腺病毒的A549細胞進行觀察的圖。
圖10(a)是通過RT-PCR對1～21個的人手術標本中的中期因子(MK)mRNA表達進行研究的結果，(b)是用同樣的方法通過RT-PCR對中期因子mRNA在惡性神經膠質瘤的4個細胞株中的表達進行研究的結果，(c)是通過免疫印跡法解析對中期因子在上述各細胞株中的表達進行研究的結果。
圖11是表示使用長度不同的2個中期因子啟動子，對啟動子在上述各細胞株中的活性進行比較的結果的圖表。
圖12(a)是表示此次設計的含有中期因子啟動子的溶瘤腺病毒的構造的模式圖，(b)是用3種腺病毒感染上述各細胞株，通過免疫印跡法解析對E1A蛋白在各個細胞株中的表達進行研究的結果。
圖13(a)是對3種腺病毒引起的癌細胞增殖抑制效果進行比較研究的結果，(b)是對腺病毒的E3區對增殖抑制效果的影響進行研究的結果，(c)是對腺病毒在直徑5mm裸鼠皮下移植模型中的抗腫瘤效果進行研究的結果。
圖14是表示用含有中期因子啟動子的溶瘤病毒感染載體細胞，製備本發明的癌基因治療藥物，將該治療藥物對直徑10-15mm巨大腫瘤的抗腫瘤效果與單獨給予病毒時的情況進行比較的結果的圖表。
圖15是表示對Fe對腺病毒AdE3-1A1.3B對於卵巢癌細胞PA-1增殖抑制效果的影響進行研究的結果的圖表。
圖16是表示對ALA對腺病毒AdE3-1A1.3B對於卵巢癌細胞PA-1增殖抑制效果的影響進行研究的結果的圖表。
圖17是表示對Fe和ALA都存在下對腺病毒AdE3-1A1.3B對於卵巢癌細胞PA-1增殖抑制效果的影響進行研究的結果的圖表。
圖18(a)是用免疫功能正常的皮下腫瘤模型小鼠((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)，研究本發明的癌基因治療藥物(免疫處理用病毒沒有用UV處理的場合)的體內抗腫瘤效果的結果，(b)是表示對供該實驗使用的各小鼠的存活率進行長期觀察的結果的圖表。
圖19是對於從給予免疫處理用病毒至給予載體細胞的給予間隔進行研究的結果，(a)是對各小鼠的腫瘤體積進行觀察的結果，(b)是對各組小鼠的存活率進行觀察的結果。
圖20是表示對通過使用經UV滅活處理的腺病毒UV-Ad-β-gal作為免疫處理用病毒能否縮短上述給予間隔進行研究的結果的圖表(存活曲線)。
圖21是表示對使用上述UV-Ad-β-gal作為免疫處理用病毒時的該病毒的給予量進行研究的結果的圖表(腫瘤生長曲線)。
圖22是對腫瘤免疫的效果進行研究的結果，(a)是對各小鼠的腫瘤體積進行觀察的結果，(b)是對各組小鼠的存活率進行觀察的結果。各組小鼠數為n＝5。圖中，對照「SCC7」「OVHM」是沒有進行腫瘤免疫，而將1×106個扁平上皮癌細胞SCC7或卵巢癌細胞OVHM進行皮下移植，給予AdE3-1A1.3B感染載體細胞A549的小鼠的結果。「OVHM-RT+Ad-β-gal→SCC7，OVHM」是在用放射線照射過的OVHM進行腫瘤免疫和通過Ad-β-gal誘導對腺病毒的CTL後，做成SCC7或OVHM的皮下腫瘤，給予AdE3-1A1.3B感染載體細胞A549的小鼠的結果。
圖23是表示對用非小細胞性肺癌細胞A549細胞進行腫瘤免疫的效果進行研究的結果的圖表(存活曲線)。各組小鼠數為n＝10。圖中，對照「OVHM」是不進行腫瘤免疫，而將1×106個卵巢癌細胞OVHM進行皮下移植，給予AdE3-1A1.3B感染載體細胞A549的小鼠的結果。圖中「AdE3-IAI.3B-感染A549→OVHM」是將感染AdE3-1A1.3B並經放射線照射的A549細胞106個進行皮下免疫，將1×106個卵巢癌細胞OVHM進行皮下移植，給予AdE3-1A1.3B感染載體細胞A549的小鼠的結果。
圖24是表示將端膠原與載體細胞一起給予時，研究是否可改善由副作用所導致的死亡率的結果的圖表。圖中括弧內的N表示小鼠數。
圖25是給予1-3次沒有經UV滅活處理的腺病毒Ad-β-gal，對在抗腺病毒抗體存在下的抗腫瘤效果進行研究的結果，(a)是對各小鼠的腫瘤體積進行觀察的結果、(b)是對各組小鼠的存活率進行觀察的結果。作為載體細胞使用A549細胞和293細胞的混合物。各組小鼠數為n＝5。
圖26是給予1-3次沒有經UV滅活處理的腺病毒Ad-β-gal，對在抗腺病毒抗體存在下的抗腫瘤效果進行研究的結果，(a)是對各小鼠的腫瘤體積進行觀察的結果、(b)是對各組小鼠的存活率進行觀察的結果。作為載體細胞只使用A549細胞。各組小鼠數為n＝5。
圖27是給予用腺病毒AdE3-1A1.3B和GM-CSF表達載體感染的載體細胞(A549細胞)，並且與該載體細胞一起給予端膠原時，對體內抗腫瘤效果進行研究的結果，(a)是對各小鼠的腫瘤體積進行觀察的結果、(b)是對各組小鼠的存活率進行觀察的結果。圖中「Ad-β-gal」前的「×1」「×2」「×3」分別表示給予1次、2次、3次腺病毒Ad-β-gal。各組小鼠數為n＝5。
圖28是對於在給予載體細胞時向腹腔內注射鐵劑的情況下的體內抗腫瘤效果進行研究的結果，(a)是對各小鼠的腫瘤體積進行觀察的結果、(b)是對各組小鼠的存活率進行觀察的結果。圖中「Ad-β-gal」前的「×1」「×2」「×3」分別表示給予1次、2次、3次腺病毒Ad-β-gal。各組小鼠數為n＝5。
圖29是表示在對載體細胞A549進行的放射線處理中，使用裸鼠對照射的放射線量進行研究的結果的圖表。
圖30是表示在對(C57BL/6×C3/He)F1小鼠進行OVHM皮下移植的實驗中，對於用不同的放射線量對載體細胞A549進行放射線處理時的抗腫瘤效果進行研究的結果的圖表。
圖31是表示對於溶瘤病毒對載體細胞A549的感染量進行研究的結果的圖表。
圖32是對利用卵巢癌細胞OVHM進行腫瘤免疫的效果進行研究的結果，(a)是對各小鼠的腫瘤體積進行觀察的結果、(b)是對各組小鼠的存活率進行觀察的結果。圖中「A549」是不進行腫瘤免疫，給予3次AdE3-1A1.3B感染載體細胞A549的小鼠、「OVHM-RT→A549」是通過經放射線照射的OVHM進行腫瘤免疫後，給予3次AdE3-1A1.3B感染載體細胞A549的小鼠、各組小鼠數為n＝5。
具體實施例方式
以下就本發明的一個實施方式進行說明。
〔1〕本發明的癌基因治療藥物本發明癌基因治療藥物含有用溶瘤病毒感染並使該病毒作用於腫瘤細胞的載體細胞，該載體細胞可以從例如以下(1)～(4)的細胞中選擇。
(1)A549細胞(2)293細胞(3)SW626細胞(4)HT-3細胞(HT-III細胞)圖1是表示本發明者為了找出可在癌基因治療藥物使用的有效的載體細胞，進行載體細胞篩選的結果，更具體講，是表示製備用溶瘤病毒感染各種候選細胞株的癌基因治療藥物，研究各個癌細胞增殖抑制效果的結果的圖表。溶瘤病毒使用腺病毒AdE3-1A1.3B(IAI.3B)。該腺病毒AdE3-1A1.3B是含有E1A基因和E3基因、而且在E1A基因上遊含有作為腫瘤特異性啟動子的卵巢癌特異性1A1.3B啟動子(IAI.3B啟動子)的腺病毒。使該腺病毒AdE3-1A1.3B以500vp/cell對各種候選細胞株感染2天後，將各細胞添加到培養到第2天的卵巢癌細胞HEY中，研究該癌細胞HEY在培養第5天的增殖抑制效果。
圖1的圖表縱軸表示各種候選細胞株得到50％增殖抑制效果(IC50)時的細胞數，細胞數越少的細胞株，增殖抑制效果越高。如該圖表示的那樣，在此次調查的癌細胞株中，293細胞、A549細胞、SW626細胞、HT-3細胞(HT-III細胞)依次表現出很高的增殖抑制效果。293細胞、A549細胞和SW626細胞與以往作為載體細胞使用的PA-1細胞相比，大約表現出高出100倍左右的增殖抑制效果。HT-3細胞也表現出與SW626細胞同等程度的高的增殖抑制效果。
另外，製備用溶瘤腺病毒感染上述的293細胞、A549細胞、SW626細胞和HT-3細胞的癌基因治療藥物，對於各治療藥物在足量的抗腺病毒中和抗體存在下(Ab(+))的癌細胞增殖抑制效果進行研究。結果如圖4表示的那樣，表明即使在抗體存在下，使用上述4種細胞作為載體細胞的癌基因治療藥物無論那一個都表現出強的癌細胞增殖抑制效果。以往利用病毒進行癌基因治療的難點是由於抗體的產生導致不能多次給予，而使用上述4種細胞作為載體細胞時，即便有抗體存在，也可在體外獲得強力的增殖抑制效果。另外，如圖4所示的那樣，使用上述4種細胞中的A549細胞作為載體細胞時，表現出最強的增殖抑制效果。即，在足量抗腺病毒中和抗體存在下給予腺病毒感染A549細胞時，即便在抗體存在下，靶癌細胞的增殖也幾乎完全被抑制。
另外，在使用直徑10-15mm的巨大裸鼠皮下腫瘤模型的體內實驗中，作為載體細胞使用上述的A549細胞、293細胞和SW626細胞時，也表現出強力的抗腫瘤效果(參照圖5和圖6)。而有關這些實驗的詳細情況在下面的實施例中進行說明。
如上所述，在用溶瘤病毒感染載體細胞而得到的癌基因治療藥物中，通過使用A549細胞、293細胞、SW626細胞、HT-3細胞中的任一個作為載體細胞，都可以獲得很高的抗腫瘤效果。
對上述4種細胞進行說明，A549細胞是非小細胞性肺癌細胞株，有關其詳細情況在例如論文Giard，D.J.，Aaronson，S.A.，Todaro，G.J.，Arnstein，P.，Kersey，J.H.，Dosik，H.，and Parks，W.P. Invitro cultivation of human tumorsestablishment of cell lines derivedfrom a series of solid tumors，J.Natl.Cancer Inst.，511417-1423，1973.等中有記載。293細胞是來自人胎兒腎的細胞，是在試驗研究中經常被用作腺病毒產生細胞的細胞株。有關293細胞在例如論文Xie QW，et al.Complementation analysis of mutants of nitric oxidesynthase reveals that the active site requires two hemes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 934891-4896，1996.等中有說明。SW626細胞是大腸癌卵巢轉移株，有關其詳細資料在例如論文Fogh J，et al.Absence of HeLa cell contamination in 169 cell lines derived fromhuman tumors.J.Natl.Cancer Inst.58209-214，1977.等有記載。HT-3細胞是子宮頸部扁平上皮癌細胞，有關其詳細情況在例如論文Fogh J，et al.Absence of HeLa cell contamination in 169 cell linesderived from human tumors.J.Natl.Cancer Inst.58209-214，1977.中有記載。這4種細胞株無論那一個都可從ATCC(American TypeCulture Collection)等細胞保存機構獲得，此外也可以使用市售的產品。
A549細胞作為載體細胞使用時具有很多優點，如(1)可產生高效力的溶瘤腺病毒，是非常堅韌的細胞，容易操作，(2)在抗腺病毒抗體存在下，最強力抑制癌細胞的增殖，(3)A549細胞由於原本是II型的肺胞上皮細胞，所以一感染腺病毒等病毒就放出分泌顆粒，該性質被認為在癌治療中起到有利作用，(4)感染腺病毒後，A549細胞也難以受到CTL產生的殺細胞效果等。因此，在上述4種細胞中使用A549細胞特別理想。
另外作為載體細胞也可以並用多種細胞。在下面的實施例中，通過作為載體細胞並用A549細胞和293細胞，證實了強力的癌治療效果。如上所述，當並用多種細胞時，可以在癌治療中利用各細胞的特徵、優點，很理想。例如，SW626細胞由於粘連(adhere)需要比較長的時間，所以一注射到腹腔內，不只是停留在局部，而是向整個周圍擴散，認為非常適合卵巢癌等的腹腔內治療。另外，SW626細胞，其病毒產生量的峰值比A549細胞或293細胞等更遲，所以具有作用時間比較長的特徵。
在本發明的癌基因治療藥物中，作為使上述載體細胞感染的溶瘤病毒，可以使用以往用於基因導入的病毒載體，例如腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒1型(HSV-1)、單純皰疹病毒2型(HSV-2)、HIV病毒(愛滋病毒)等慢病毒或小鼠白血病病毒等逆轉錄病毒、呼腸病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等，其它的溶瘤病毒也可以。溶瘤病毒只要是增殖型病毒載體、並能夠在靶腫瘤細胞或腫瘤組織中特異增殖、具有改變病毒基因、融解·殺傷靶細胞的細胞溶菌作用的病毒就可以，例如腺病毒的情況下，只要是含有對於其增殖所必需的E1A或E1B區的病毒就可以。
本發明的癌基因治療藥物幾乎可以適用於所有惡性腫瘤，可成為治療對象癌的種類可舉例如卵巢癌、扁平上皮癌(子宮頸部癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌等)、消化器官癌(大腸癌、胰癌、肝癌、胃癌等)、成神經細胞瘤、腦腫瘤、乳癌、精巢癌、前列腺癌等。另外通過使用腺病毒34，35型等可感染血液細胞的病毒，本發明的癌基因治療藥物也適用於血液性惡性腫瘤。
可以根據治療對象癌的種類選擇導入溶瘤病毒的腫瘤特異性啟動子的種類。例如，對於卵巢癌可以使用1A1.3B啟動子、對於腦腫瘤、惡性神經膠質瘤等可以使用中期因子啟動子、對於精巢癌可使用β-HCG啟動子、對於扁平上皮癌可使用SCCA1啟動子和SCCA2啟動子、對於大腸癌可使用CEA啟動子、對於前列腺癌可使用PSA啟動子、對於肝癌可使用AFP啟動子。當然，也可以使用其它的眾所周知的腫瘤特異性啟動子，例如，對各種惡性腫瘤發揮啟動子活性並具有很寬作用譜的cox-2啟動予以及其它骨鈣素啟動子等各種癌特異性啟動子。上述中期因子啟動子對於除了腦腫瘤、惡性神經膠質瘤之外的各種惡性腫瘤都可以使用，在這點上具有與cox-2啟動子同樣寬的作用譜。
關於所使用的各啟動子序列的長度等，只要可獲得腫瘤特異性啟動子活性，就沒有特別限定。上述1A1.3B啟動子根據國際公開第03/025190號論文和文獻Cancer Research 63，2506-2512，2003記載設計·製備，可以插入到病毒基因組。上述的中期因子啟動子、β-HCG啟動子、SCCA1啟動子分別根據國際公開第02/10368號論文、國際公開第01/90344號論文、國際公開第00/60068號論文的記載進行設計·製備，可以插入到病毒基因組。
關於上述SCCA1啟動子在論文Biochimica et Biophysica Acta91522(2001)1-8，Molecular cloning of human squamous cellcarcinoma antigen 1 gene and characterization of its promoter，Katsuyuki Hamada，Hiroto Shinomiya，Yoshihiro Asano，ToshimasaKihana，Mari Iwamoto，Yasushi Hanakawa，Koji Hashimoto，SusumuHirose，Satoru Kyo，Masaharu Ito中進行了詳細的說明。
例如，製作溶瘤腺病毒時，可以通過在作為腺病毒增殖必需基因的初期基因E1A或E1B的上遊插入腫瘤特異性啟動子或與初期基因E1A或E1B啟動子置換而構建。在使用HSV-1、HSV-2、逆轉錄病毒、呼腸病毒、水泡性口炎病毒(VSV)等腺病毒以外的病毒時，同樣可以通過在病毒增殖必需基因的上遊插入腫瘤特異性啟動子或與該基因的啟動子置換而構建。
當然，溶瘤病毒只要是在靶腫瘤細胞或腫瘤組織中具有特異增殖的性質，就並不一定必須含有腫瘤特異性啟動子。例如，也可以使用ONYX公司的E1B基因缺失型溶瘤腺病毒，或UAB大學的E1A基因部分缺損型的Ad5-Δ24腺病毒等不含有腫瘤特異性啟動子的溶瘤病毒。另外作為溶瘤病毒也可以使用野生型腺病毒，或其一部分基因缺失後的病毒。
用溶瘤病毒感染載體細胞的方法可以按照常規方法進行，並沒有特別限定，例如將載體細胞加到平皿中，然後添加可使所有細胞都感染的量的溶瘤病毒，於95％O2、5％CO2、37℃、胎牛血清FCS(-)、RPMI培養基的條件下培養6小時至36小時左右使其感染的方法比較簡便。在下面的實施例中，A549細胞、SW626細胞、HT-3細胞用這種方法培養從而感染溶瘤病毒，對於293細胞，則在FCS(+)10％、DM EM培養基的條件下進行培養，從而感染溶瘤病毒。另外，胎牛血清FCS在感染3-6小時時用FCS(-)條件，當感染時間在上述時間以上時，置於FCS(-)狀態3-6小時，之後加FCS10％為好。
溶瘤病毒對載體細胞的感染量和感染時間可以根據治療對象的腫瘤大小·種類、載體細胞的種類·給予量、所使用的溶瘤病毒的種類、本基因治療藥物的給予方法等選擇最適的量和時間。雖然沒有特別限定，不過，作為一個例子，當載體細胞使用A549細胞時，腹腔內給予時設定為約5-250vp/cell、大約6-24小時，腫瘤內給予時設定為約5-500vp/cell、大約12-24小時，當為SW626細胞時，腹腔內給予時設定為約250-2000vp/cell、大約6-24小時，腫瘤內給予時設定為約100-500vp/cell、大約12-24小時，當使用293細胞時，腫瘤內給予時設定為約5-50vp/cell、大約12-24小時，腹腔內給予時設定為約0.1-10vp/cell、大約6-24小時。這樣，根據載體細胞的種類、給予方法不同，相應的感染量·感染時間也不同，在上述例子中，腹腔內給予時，可以在約0.1-2000vp/cell、大約6-24小時的範圍，當腫瘤內給予時，可以在約5-500vp/cell、大約12-24小時的範圍分別設定感染量·感染時間。
用溶瘤病毒感染載體細胞、製備本發明的癌基因治療藥物時，也可以在使用之前以不感染溶瘤病毒的狀態保存載體細胞。另一方面在將用溶瘤病毒感染、並經放射線照射的載體細胞冷凍，在醫療現場將它解凍後做成使用的製品形態時，最好保存用病毒感染的載體細胞。載體細胞的保存例如可以在液氮中或-150℃左右的溫度下保存。另外，溶瘤病毒可以在例如-80℃左右的溫度下保存。
使用時，通過上述方法使溶瘤病毒感染載體細胞，將得到的病毒感染載體細胞直接或與慣用醫藥製劑載體做成本發明的癌基因治療藥物，給予人(或小鼠、大鼠等實驗動物)。如下面敘述的那樣，給予載體細胞時，最好是配合端膠原、鐵劑、卟啉化合物中的1或2個以上化合物後與載體細胞同時給予。另外，為了提高CTL反應，最好給予不僅使溶瘤病毒感染、也使GM-CSF表達載體感染的載體細胞，譬如用病毒載體雙重感染的載體細胞。
將本發明的癌基因治療藥物與下面提到的免疫處理用病毒配合構成時，在給予免疫處理用病毒後，經過規定期間後給予載體細胞。載體細胞使用癌細胞時，最好是在病毒感染前或感染後進行放射線照射。在下面的實施例中，載體細胞使用A549細胞、SW626細胞、HT-3細胞時，在將這些細胞給予裸鼠前，分別於120-400Gy、20-40Gy、20-40Gy下進行放射線照射。對A549細胞的放射線照射量研究的結果表明如果是120Gy或其以上，就沒有觀察到細胞增殖(圖29)，所以照射量最好設定為120Gy～600Gy(更優選150Gy～400Gy)左右。
本發明的癌基因治療藥物最好是作為非口服劑給予，但也可以作為口服劑使用。以非口服劑給予可以是體內法、間接體內法中的任一種。運用體內法時，要根據腫瘤的大小·種類、症狀的程度、患者的年齡、體重等調整用量(換言之，病毒感染載體細胞的給予量)，例如，可以通過靜脈注射、點滴靜脈注射、腫瘤內注射、腹腔注射那樣的腔內注射等來給予，載體細胞最好是通過腫瘤內注射的方法給予。這樣的注射劑可以按照常規方法製造，作為稀釋劑一般使用生理鹽水、細胞培養液等。還可根據需要，加入殺菌劑、防腐劑、穩定劑、等滲劑、止痛劑等。這些製劑中的病毒感染載體細胞的配合量沒有特別限定，可以任意設定。
當然，上述的病毒感染載體細胞也可以經數次給予患者，或分為多個療程，對於每一個療程的給予次數、給予間隔等可以任意設定。
如上述那樣，病毒感染載體細胞的給予量可以根據腫瘤的大小·種類、症狀的程度、患者的年齡、體重等決定，通常情況下，可以將1次載體細胞的給予量設定為大約107細胞數～1010細胞數，將通過載體細胞給予溶瘤病毒的1次給予量設定在大約109病毒粒子～1014病毒粒子。
載體細胞的種類可以根據治療對象癌的種類等適當選擇。另外也可以通過基因重組技術改變載體細胞，例如變得容易與靶腫瘤細胞結合那樣地，在載體細胞的細胞表面人為地使特定蛋白質等表達，也可以進行使仙臺病毒感染載體細胞等處理。
溶瘤病毒通過細胞間相互作用(cell to cell interatcion)，由載體細胞到靶腫瘤細胞進行感染，可以在腫瘤細胞內進行特異增殖，發揮融解·殺傷腫瘤細胞的細胞溶菌作用。利用病毒的癌基因治療難點在於由於抗體的產生導致不能多次給予，而使用載體細胞由於通過細胞間相互作用可以做到直接感染靶腫瘤細胞，所以可多次給予，預期有強力的抗腫瘤效果。
〔2〕將本發明的癌基因治療藥物與下面提到的免疫處理用病毒配合構成的情形及其合適的使用例如以下說明的那樣，最好是將本發明的癌基因治療藥物與免疫處理用病毒配合構成。
與免疫處理用病毒配合時，本發明的癌基因治療藥物是配合了為了誘導生物體對載體細胞的給予所產生的CTL反應而給予的免疫處理用病毒、和用溶瘤病毒感染並使該病毒作用於生物體腫瘤細胞的載體細胞的藥物，即，配合了預先給予的免疫處理用病毒和之後給予的載體細胞這2種藥劑的藥物，通過預先給予腺病毒等病毒來實施免疫處理(預先免疫(immunization))後，給予用溶瘤病毒感染的載體細胞，可誘導·引起生物體的CTL反應，在體內可獲得顯著的抗腫瘤效果。
實際上在使用免疫功能正常的同系的模型小鼠的實驗中，本發明的癌基因治療藥物表現出顯著的抗腫瘤效果。下面將進行詳細敘述，將卵巢癌細胞OVHM向(C57BL/6×C3/He)F1、鼠進行皮下移植，然後局部注射用導入了卵巢癌特異性啟動子的溶瘤腺病毒感染的載體細胞(A549細胞)，在3個月前預先用腺病毒(Ad-β-gal)實施免疫處理的小鼠中，在給予開始後3-4日就表現出明顯的抗腫瘤效果，9日後腫瘤完全消失，淋巴節轉移也消失(參照以下圖7和圖18)。
因此，儘管有抗體產生，在有了免疫力的小鼠中獲得更強力而且顯著的抗腫瘤效果，可以認為這是由於免疫處理用腺病毒的給予誘導·引起了生物體的CTL反應(通過細胞損傷性T細胞的細胞損傷活性)的緣故。即，以往的利用病毒的癌基因治療難點在於由於抗體產生而不能多次給予，而本發明的癌基因治療藥物通過利用生物體的免疫機構，攻擊感染病毒的靶腫瘤細胞，可以說是將它變成了武器。
免疫處理用病毒和溶瘤病毒最好是使用同種類病毒。對於免疫處理用病毒最好使用非增殖型病毒和/或滅活的病毒，對非增殖型病毒再通過紫外線照射等破壞DNA進行滅活就更好。例如，免疫處理用病毒使用腺病毒時，可以使用E1區缺失的病毒和/或經紫外線照射破壞DNA滅活的病毒。如此，對於免疫處理用病毒也可以使用將增殖型病毒經紫外線照射等滅活後的病毒。
在下面的實施例中，作為免疫處理用病毒，使用E1區缺失，整合了在巨細胞病毒(CMV)啟動子的調控下編碼β-半乳糖苷酶(β-gal)的LacZ基因的腺病毒(Ad-β-gal)。顯然，作為免疫處理用病毒並不受此限定，也可以是增殖型腺病毒經紫外線(UV)滅活的病毒，最好是對沒有整合LacZ基因以及其它任何基因、只有PolyA序列的非增殖型腺病毒(Ad-PolyA)進行紫外線照射滅活後使用。
在本發明的癌基因治療藥物中，免疫處理用病毒的給予量雖然可以根據患者的抗病毒抗體效價、腫瘤的大小·種類、症狀程度、患者年齡、體重等適當選擇，但最好是根據抗病毒抗體為陽性，還是陰性來改變給予量。例如，作為免疫處理用病毒和溶瘤病毒使用5型腺病毒時，對於對該腺病毒為抗體陰性(-)的患者，免疫處理用病毒的給予量大約定在105病毒粒子～1011病毒粒子，而對於對該腺病毒為抗體陽性(+)的患者，免疫處理用病毒的給予量大約定在102病毒粒子～107病毒粒子(根據情況，也可以給予少於102病毒粒子或不給於)。免疫處理用病毒的給予方法雖然沒有特別限定，但最好是通過皮內注射或皮下注射的方法給予。
另外，在實驗等中，對小鼠、大鼠等動物給予本發明的癌基因治療藥物時，考慮體重差別後，可以按照給予人時的大約1000分之一的量設定各藥劑的給予量。
從給予免疫處理用病毒至給予載體細胞的期間大約設定在2周～3個月，希望儘可能縮短期間。在下面的實施例中，通過對免疫處理用病毒(腺病毒)進行紫外線照射滅活，已經可以將上述期間縮短到3周～4周左右。
有關病毒感染載體細胞的給予量等前面已敘述過，可將通過載體細胞一次給予溶瘤病毒的給予量大約設定在109病毒粒子～1014病毒粒子，將溶瘤病毒對載體細胞的感染量大約設定在0.1vp/cell～2000vp/cell(優選5vp/cell～500vp/cell、更優選150vp/cell～400vp/cell)。
在給予免疫處理用病毒的同時、或在其前後，最好給予用於腫瘤免疫的腫瘤細胞(癌細胞)。即，在通過免疫處理用病毒進行免疫的同時、或在其前後，最好利用腫瘤細胞進行接種(疫苗)(通過給予預先進行了放射線、乙醇、甲醛等處理的腫瘤細胞，可做到提高生物體對治療對象腫瘤細胞的免疫應答)。
作為上述接種(疫苗)(腫瘤免疫)中使用的腫瘤細胞，希望使用來自患者的腫瘤細胞，也可以使用被認為對與此細胞類似的抗原進行提示的一般可獲得的腫瘤細胞。在下面的實施例中，在研究對卵巢癌(OVHM)治療效果的實驗中，腫瘤免疫中使用與治療對象腫瘤細胞種類不同的腫瘤細胞(扁平上皮癌細胞SCC7或肺癌細胞A549細胞)時也證實了良好的癌治療效果。
在上述接種(疫苗)(腫瘤免疫)中，腫瘤細胞的給予量沒有特別限定，例如，可以設定在大約105細胞數～1010細胞數。對腫瘤細胞的放射線照射量最好設定在120Gy～600Gy(更優選200Gy～500Gy)左右，腫瘤細胞的給予方法最好是使用皮內注射或皮下注射的方法給予。
另外，為了提高在治療對象癌中的病毒產生量，可以給予鐵劑和/或給予卟啉化合物。作為卟啉化合物如5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acidALA)、血卟啉(hematoporphyrin)、光卟啉(photofrin)等。作為鐵劑，口服劑如硫酸亞鐵(FeSO4)、檸檬酸亞鐵、靜脈注射用鐵劑如硫酸軟骨素鐵、含糖氧化鐵。給予方法沒有特別限定，最好是與本發明的癌基因治療藥物一起以注射劑或口服劑形式給予。
實際上通過給予鐵劑(Fe)和/或5-氨基酮戊酸(ALA)，可以顯著亢進溶瘤腺病毒AdE3-1A1.3B的癌細胞增殖抑制效果(參照圖15-17和圖28)。
最好是與載體細胞一起給予端膠原(通過用胃蛋白酶處理等只將膠原的末端肽鍵切斷，使分子量變小，成為水溶性蛋白)。如下面的實施例給出的那樣，當將端膠原與載體細胞同時給予時，由副作用所導致的死亡率銳減(圖24)。這可認為是在溶瘤腺病毒的擴散被端膠原抑制的同時，發生了對抗腺病毒抗體的封閉的緣故。
因此，通過將端膠原與載體細胞同時給予，可抑制副作用，溶瘤病毒的高給予成為可能。端膠原可以使用市售品(例如，株式會社高研的製品)，或使用膠原經胃蛋白酶處理等製造的產品。端膠原最好是與載體細胞一起混在注射液中給予，藥液中濃度為0.01-3.0％(w/v)左右被認為可充分發揮效果(在下面的實施例中，即使藥液中為0.1-0.2％的低濃度也充分證實了效果)。
另外，如上所述，為了提高免疫反應，最好給予不僅使溶瘤病毒、而且還使GM-CSF表達載體感染載體細胞，譬如用病毒載體雙重感染的載體細胞(或也可以採用同時給予使兩載體分別感染的載體細胞的方法)。
對於GM-CSF表達載體最好使用與溶瘤病毒同種類的病毒載體。例如，使用腺病毒作為溶瘤病毒時，對於GM-CSF表達載體可以使用E1區缺失、整合了編碼GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor粒細胞·巨噬細胞集落刺激因子)的GM-CSF基因的腺病毒。
因此當使病毒載體感染載體細胞時，將溶瘤病毒和GM-CSF表達載體兩者合起來的感染量大約定為5病毒粒子/細胞～2000病毒粒子/細胞。
實際上通過使用GM-CSF表達載體證實了非常好的癌治療效果(圖27)。
另外，也可考慮取代使用GM-CSF表達載體，使用將GM-CSF蛋白與載體細胞一起混在注射液或經靜脈全身給予的方法。
本發明的癌基因治療藥物的使用方法顯然並不限定於上述的方法，可以考慮各種各樣的使用例子。例如，為了提高溶瘤病毒的感染力，也可以將本發明的癌基因治療藥物與其它的抗癌劑或放射線照射等並用。
關於本發明的癌基因治療藥物的較佳使用例，分為(1)對於免疫處理用病毒的抗體為陰性的患者情況，(2)該抗體為陽性的患者情況進行說明。
上述(1)的情況，對於免疫處理用病毒，例如，將上述的非增殖型腺病毒經紫外線照射滅活後使用。給予量大約定為105vp至1011vp左右。在給予免疫處理用病毒的同時，給予大約105個至1010個用於腫瘤免疫的用200Gy左右進行放射線處理的來自患者的腫瘤細胞(癌細胞)。免疫處理用病毒和腫瘤細胞的給予方法採用皮內注射或皮下注射。
在給予免疫處理用病毒和腫瘤細胞後大約3-4周後，通過腫瘤內注射給予載體細胞。載體細胞的給予量定為例如每1次1×107個-1×1010個左右。使用A549細胞作為載體細胞，經150Gy至400Gy左右放射線處理後給予。溶瘤病毒和GM-CSF表達載體使用腺病毒，分別以250vp/cell左右、5-20vp/cell左右使載體細胞感染。注射液中按照液中濃度大約為0.1-0.2％那樣混合端膠原後注射。另外同時將鐵(Fe)按照40-100mg左右進行靜脈注射。或同時將ALA按照2-2000mg給予到腫瘤內。
將以上操作作為1次，給予1-6次載體細胞等。當多次給予時，可以連日或每隔2、3日注射。
患者為抗體陽性的上述(2)的情況，除了將免疫處理用病毒的給予量定為大約105vp或其以下以外，與上述(1)同樣，給予本發明的癌基因治療藥物。
作為本發明的癌基因治療藥物的具體例子，可舉例如(1)特定的載體細胞，(2)再配合使載體細胞感染的溶瘤病毒，(3)在上述(1)或(2)的配合中再配合免疫處理用病毒，(4)在上述(1)～(3)的配合中再配合端膠原，(5)在上述(1)～(4)的配合中再配合GM-CSF表達載體，(6)在上述(1)～(5)的配合中再配合用於提高病毒產生量的鐵劑和/或卟啉化合物，(7)在上述(1)～(6)的配合中再配合用於腫瘤免疫而給予的腫瘤細胞，(8)在上述(1)～(7)的配合中再配合保存、感染·培養、醫藥製劑的製備等中所需的化合物(試劑、緩衝液、酶等)、或容器(反應用、感染·培養用、保存用等)等。
實施例以下參照附圖，對本發明的實施例進行說明，但本發明並不限定於這些實施例。
〔實施例1載體細胞的篩選以及在抗體存在下的抗腫瘤效果〕為了在已有的癌細胞株中篩選作為載體細胞發揮強力的癌細胞增殖抑制效果的細胞株，進行以下實驗。
作為使載體細胞感染的溶瘤病毒使用腺病毒AdE3-1A1.3B(IAI.3B)。該腺病毒AdE3-1A1.3B含有E1A基因和E3基因，而且是在E1A基因上遊含有作為腫瘤特異性啟動子的卵巢癌特異性1A1.3B啟動子(IAI.3B啟動子)的腺病毒。使該腺病毒AdE3-1A1.3B對各種載體細胞按照500vp/cell感染2日後，將該載體細胞加到培養到第2天的卵巢癌細胞株HEY中，在培養第5天調查該細胞株HEY的體外增殖抑制效果。
上述實驗結果如圖1所示。圖1的圖表縱軸表示得到的有關各種候選細胞株的50％增殖抑制效果(IC50)的細胞數，細胞數越少的細胞株，其增殖抑制效果越高。如該圖表示的那樣，在此次研究的癌細胞株中，293細胞、A549細胞、SW626細胞、HT-3細胞(HT-III細胞)依次表現出很高的增殖抑制效果。293細胞、A549細胞和SW626細胞與以往作為載體細胞使用的PA-1細胞相比，表現出高出大約100倍左右的增殖抑制效果。HT-3細胞也表現出與SW626細胞同等程度的高的增殖抑制效果。
然後，在單獨溶瘤病毒的場合下和使用載體細胞的場合下，對在病毒抗體存在下增殖抑制效果怎樣變化進行了研究。載體細胞使用293細胞，使上述腺病毒AdE3-1A1.3B感染該293細胞2日，將得到的腺病毒AdE3-1A1.3B感染293細胞和其細胞上清(AdE3-1A13B 293 cell+SUPT)在抗腺病毒抗體存在下加到12孔板中。各孔中前一天加有5萬個左右的卵巢癌細胞株HEY。對於抗腺病毒抗體，將具有600倍抗體效價的抗體稀釋為各種各樣的抗體效價後使用。同樣，作為單獨溶瘤病毒的場合，將腺病毒AdE3-1A1.3B在抗腺病毒抗體存在下按照1孔1000vp/cell加到12孔板中。然後對於在各個場合下培養到第5天的癌細胞(HEY細胞)的增殖抑制效果進行研究。
上述實驗結果如圖2所示。該圖表的縱軸表示得到50％的增殖抑制效果(IC50)時的抗腺病毒抗體的稀釋度。即，使用293細胞時，即使稀釋5倍左右(120倍的抗體效價)也可獲得50％的增殖抑制效果，單獨腺病毒的場合通過稀釋600倍左右(1倍的抗體效價)可獲得50％的增殖抑制效果。因此使用載體細胞時顯示出即使在抗體效價高的條件下也能發揮增殖抑制效果。
同樣在抗腺病毒抗體存在下，研究在(1)腺病毒感染293細胞的上清和細胞成分(AdE3-1A13B 293cell+SUPT)、(2)含有腺病毒的細胞上清(AdE3-1A13B，SUPT)、(3)含有腺病毒的細胞上清經0.2μm過濾膜處理(AdE3-1A13B，SUPT，filter)、(4)單獨腺病毒(AdE3-1A13B)等各個場合下對HEY細胞的增殖抑制效果。研究結果如圖3所示。該圖表的縱軸表示獲得50％增殖抑制效果(IC50)時的抗腺病毒抗體的稀釋度。如該圖表示的那樣，使用載體細胞(293細胞)的場合與其它場合比可獲得更強力的抗腫瘤效果。
另外在與上述同樣的實驗中，對於293細胞、A549細胞、SW626細胞、HT-3細胞的各載體細胞，在具有600倍抗體效價的抗腺病毒抗體存在下(Ab(+))、或不存在下(Ab(-))研究對癌細胞株HEY細胞的增殖抑制效果。其結果如圖4所示。該圖表的縱軸表示培養第5天的癌細胞數。如該圖所示那樣，在上述4種細胞中，使用A549細胞作為載體細胞時，表現出最強力的增殖抑制效果。即在足量的抗腺病毒中和抗體存在下給予腺病毒感染A549細胞，靶癌細胞的增殖儘管在抗體存在下也幾乎完全被抑制。至於另外3種細胞在抗體存在下也獲得了充分的增殖抑制效果。
利用病毒進行癌基因治療難點在於由於抗病毒的中和抗體產生而不能多次給予，通過使用載體細胞，利用細胞間相互作用可以直接做到感染靶癌細胞，從而可以多次給予。另外，通過使用上述4種細胞作為載體細胞，可以獲得強力的抗腫瘤效果。
〔實施例2裸鼠皮下腫瘤模型中的體內抗腫瘤效果〕以下，使用裸鼠皮下腫瘤模型，對本發明的癌基因治療藥物的體內抗腫瘤效果進行研究。在實驗中，將人卵巢癌細胞RMG-1移植到出生後5周的裸鼠皮下，4周後、對於變成直徑約10-15mm的巨大腫瘤，向腫瘤內注射6次本發明的癌基因治療藥物，觀察腫瘤體積的變化。觀察的結果如圖5的圖表所示。圖表中、黑方塊的「對照」是腫瘤內注射6次PBS緩衝液的結果、黑圓的「AdE3-1A1.3B」是按照1隻小鼠1×1010病毒粒子給予上述腺病毒AdE3-1A1.3B的結果、黑三角是按照1隻小鼠1×107個給予用腺病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的SW626細胞的結果、黑菱形是按照1隻小鼠1×107個給予用腺病毒AdE3-1A1.3B以25vp/cell感染的293細胞的結果、白方塊是按照1隻小鼠1×107個給予用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549細胞的結果。如該圖表示的那樣，使用293細胞和A549細胞作為載體細胞時，給予後經過50天，直徑約10-15mm的巨大腫瘤完全消退。SW626細胞表現出98％的增殖抑制效果。
將人卵巢癌細胞PA-1移植到出生後5周的裸鼠皮下進行與上述同樣的實驗。其結果如圖6所示。如該圖所示那樣，使用293細胞和A549細胞作為載體細胞，直徑約10-15mm的巨大腫瘤完全消退。SW626細胞使得5隻小鼠中的4隻的腫瘤完全消失。
〔實施例3在具有免疫力的皮下腫瘤模型小鼠中的體內抗腫瘤效果〕以下，使用免疫功能正常的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠對本發明的癌基因治療藥物的體內抗腫瘤效果進行了研究。在本實驗中，對有關如下場合的抗腫瘤效果進行研究(1)對同系的模型小鼠皮下移植同種卵巢癌細胞OVHM，對移植10日後形成的5-10mm皮下腫瘤，向腫瘤內給予6次用上述腺病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的放射線處理(放射線治療)後的A549細胞的場合，(2)通過給予作為免疫處理用病毒的腺病毒，對出生後7周的同系的模型小鼠進行預先免疫，3個月後，與上述(1)的場合同樣地，皮下移植卵巢癌細胞OVHM，移植10日後、向腫瘤內給予6次用上述腺病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的放射線處理後的A549細胞的場合，(3)作為對照，向腫瘤內給予6次PBS緩衝液的場合等。
圖7的圖表給出了上述實驗結果。圖表中，黑方塊的「對照」是上述(3)對照的結果，黑圓的「Ad(-)→A549」是上述(1)的沒有給予免疫處理用腺病毒時的結果，黑三角的「Ad(+)→A549」是上述(2)的給予免疫處理用腺病毒時的結果。另外，免疫處理用腺病毒使用不含有E1基因的非增殖型腺病毒，更具體講使用在CMV啟動子的下遊插入了LacZ基因的腺病毒。如該圖表示的那樣，在預先沒有用腺病毒免疫的上述(1)的情況下，與對照相比表現出20％的抗腫瘤效果，反之在用腺病毒實施免疫處理的上述(2)的情況下，在注射開始後3-4日表現出明顯抗腫瘤效果，9日後腫瘤完全消失，淋巴節轉移也消失。因此，儘管有抗體產生，在有了免疫力的小鼠中獲得了更強力而且顯著的抗腫瘤效果，這可以認為是由於免疫處理用腺病毒的給予誘導·引起生物體的CTL反應的緣故。
溶瘤病毒通過細胞間相互作用，由載體細胞到靶腫瘤細胞進行感染，可以在腫瘤細胞內進行特異增殖，發揮融解·殺傷腫瘤細胞的細胞溶菌作用，在本發明的癌基因治療藥物中，認為通過預先給予免疫處理用腺病毒，誘導生物體排除感染了溶瘤腺病毒的靶腫瘤細胞的強的CTL反應，可誘導腺病毒感染腫瘤細胞的完全自然排除。
作為腺病毒感染靶腫瘤細胞的感染方法之一，可以考慮腺病毒引起的細胞融合。圖8給出了向加入了A549細胞的孔中按照每1細胞10000病毒粒子加入經紫外線照射滅活的腺病毒，培養過夜後通過顯微鏡觀察的結果。如該圖箭頭表示的那樣，通過加入腺病毒引起細胞融合，在各處看到多核細胞。在沒有給予腺病毒的A549細胞中沒有觀察到這樣的變化(參照圖9)。
除了細胞融合以外，作為可考慮的感染方法，認為通過載體細胞附著靶細胞，再通過局部的腺病毒的猝發或通過含有腺病毒的載體細胞片段可做到使腺病毒感染靶腫瘤細胞。無論那一種方法，在感染了病毒的靶腫瘤細胞中，含有腫瘤特異性啟動子的腺病毒增加，成為強力的免疫原(或通過對感染了腺病毒的靶腫瘤細胞所含有的癌特異性肽進行二次抗原識別)，認為通過CTL反應可以排除腫瘤細胞。
〔實施例4使用中期因子啟動子時的抗腫瘤效果〕接下來對使用中期因子啟動子時的抗腫瘤效果進行研究。圖10(a)是通過RT-PCR對中期因子(MK)mRNA在1～21個人手術標本中的表達進行研究的結果。如該圖表示的那樣，證實中期因子mRNA在成神經膠質細胞瘤(glioblastoma)、稱為未分化星形細胞瘤(anaplastic astrocytoma)的惡性神經膠質瘤(malignantglioma)和彌散性星形細胞瘤(diffuse astrocytoma)中過量表達。因此，確認中期因子在腦腫瘤等很多癌中過量表達。
圖10(b)是用與上述同樣的方法，通過RT-PCR對中期因子mRNA在惡性神經膠質瘤的4個細胞株中的表達進行研究的結果。如該圖表示的那樣，證實在4個細胞株中，在U87MG中沒有表達，在U251MG、LN319、U373MG中中期因子mRNA過量表達。
圖10(c)是通過免疫印跡法解析對中期因子蛋白在上述各細胞株中的表達進行研究的結果，被證實與mRNA同樣在U87MG沒有表達，中期因子蛋白在U251MG、LN 319、U373MG中過量表達。
然後進行中期因子的啟動子分析。在實驗中，比較了長度不同的2個中期因子啟動子(600個鹼基與2300個鹼基)的活性。將在各個啟動子的下遊插入了蟲螢光素酶基因的質粒(pGL3-MK600和pGL3-MK2300)導入上述各細胞株，通過研究各個細胞株的蟲螢光素酶活性來評價啟動子活性。其結果如圖11表示的那樣，在惡性神經膠質瘤細胞株中，長度為600個鹼基的啟動子表現出比長度為2300個鹼基的啟動子更高的啟動子活性。
圖12(a)是表示此次設計的含有中期因子啟動子的溶瘤(細胞溶菌型)腺病毒構造的模式圖。長度為600個鹼基或2300個鹼基的中期因子啟動子被導入到552bp的位置。
圖12(b)是使3種腺病毒感染上述各細胞株，通過免疫印跡法解析對E1A蛋白在各個細胞株中的表達進行研究的結果。如該圖表示的那樣，用含有長度為600個鹼基的中期因子啟動子的腺病毒(AdMK600)感染時，只在表達中期因子的U251MG、LN319、U373MG中觀察到腺病毒的E1A蛋白的表達。與此相反，使用野生型的腺病毒(AdWild)時，在包括正常腦細胞在內的所有細胞中都可觀察到E1A蛋白的表達，使用對照病毒AdLacZ時，無論在那一個細胞中都沒有觀察到E1A蛋白的表達。
圖13(a)是對3種腺病毒產生的癌細胞增殖抑制效果進行比較研究的結果。使用野生型的腺病毒(AdWild)時，在所有細胞中都表現出強的增殖抑制效果，而使用含有中期因子啟動子的腺病毒(AdMK600和AdMK2300)時，只在表達中期因子的U251MG、LN319、U373MG中表現出增殖抑制效果，這些值與中期因子mRNA的表達量、啟動子活性密切相關。另外，與含有長度為2300個鹼基的中期因子啟動子的腺病毒AdMK2300相比，AdMK600表現出強的增殖抑制效果。
圖13(b)是研究腺病毒的E3區對增殖抑制效果的影響的結果，如該圖表示的那樣，含有E3區的AdMK600表現出比沒有E3區的腺病毒(AdMK600-ΔE3)強10倍左右的增殖抑制效果。
圖13(c)是對腺病毒在腫瘤直徑5-10mm左右大小的裸鼠皮下移植模型中的抗腫瘤效果進行研究的結果。圖中，黑菱形是給予野生型腺病毒AdWild的結果，黑方塊是給予含有中期因子啟動子的腺病毒AdMK600的結果，黑三角是給予插入了LacZ基因的腺病毒Ad-β-gal的結果，黑圓是只給予PBS緩衝液的結果。如該圖表示的那樣，在不表達中期因子的U87MG中只有野生型腺病毒表現出抗腫瘤效果，而在表達中期因子的U373MG中，AdMK600和AdWild都帶來腫瘤的完全消失，在只注射了PBS緩衝液的對照和注射AdLacZ的模型之間沒有看到大的差異。
另外，使含有上述中期因子啟動子的腺病毒(Ad-MK600)感染載體細胞，將該病毒感染載體細胞的抗腫瘤效果與單獨給予Ad-MK600的場合進行了比較。實驗中使用293細胞和A549細胞作為載體細胞。將上述U373MG細胞移植到5周齡裸鼠中，3周後獲得10-15mm的巨大腫瘤後，給予病毒感染載體細胞或只給予Ad-MK600，給予4周後比較腫瘤體積的大小。結果如圖14所示。圖中，「Ad-MK600」是單獨給予Ad-MK600的結果、「293」「A549」是分別給予使用293細胞、A549細胞作為載體細胞的病毒感染載體細胞的結果。如該圖表示的那樣，給予病毒感染載體細胞時腫瘤完全消失了。另外單獨給予Ad-MK600時與對照(control)之間幾乎看不到差別。
由到此為止的實驗結果可以證實通過使用A549細胞、293細胞等作為載體細胞，使用含有1A1.3B啟動子或中期因子啟動子的腺病毒作為溶瘤病毒，實際上對卵巢癌、惡性神經膠質瘤表現出良好的治療效果。中期因子啟動子對除了惡性神經膠質瘤之外的各種惡性腫瘤都可以使用，可以認為對除了惡性神經膠質瘤以外的癌治療都有效。
〔實施例5Fe和ALA對腺病毒AdE3-1A1.3B的增殖抑制效果的影響〕將卵巢癌細胞HEY按照10000/well加到12孔平皿後，次日按照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各濃度加入FeSO4，向所有孔中加細胞損傷型腺病毒AdE3-1A1.3B，5日後以IC50對腺病毒的增殖抑制效果進行評價。評價結果如圖15所示。圖中縱軸相對地表示各場合下的IC50的病毒給予量(vp/cell)。如該圖表示的那樣，在並用50μg/ml的FeSO4和腺病毒時，比單獨腺病毒表現出約20倍的增殖抑制效果，當並用5μg/ml的FeSO4和腺病毒時比單獨腺病毒表現出約8倍的增殖抑制效果。
接下來將卵巢癌細胞HEY按照10000/well加到12孔平皿後，次日按照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各濃度加入5-氨基酮戊酸(ALA)，向所有孔中加入細胞損傷型腺病毒AdE3-1A1.3B，5日後以IC50對腺病毒的增殖抑制效果進行評價。評價結果如圖16所示。圖中縱軸相對地表示各場合下的IC50的病毒給予量(vp/cell)。如該圖表示的那樣，在並用50μg/ml的ALA和腺病毒時，比單獨腺病毒表現出約100倍的增殖抑制效果。
另外將卵巢癌細胞H EY按照10000/well加到12孔平皿後，次日按照50μg/ml、5μg/ml、0.5μg/ml、0μg/ml的各濃度加FeSO4，向所有孔中加入細胞損傷型腺病毒AdE3-1A1.3B和5-氨基酮戊酸(ALA)50μg/ml、或作為對照單獨加入腺病毒，5日後以IC50對腺病毒的增殖抑制效果進行評價。評價結果如圖17所示。圖中縱軸相對地表示各場合下的IC50的病毒給予量(vp/cell)。如該圖表示的那樣，在並用FeSO450μg/ml、ALA 50μg/ml和腺病毒時，比單獨腺病毒表現出約1000倍的增殖抑制效果，當並用FeSO45μg/ml、ALA 50μg/ml和腺病毒時比單獨腺病毒表現出約700倍的增殖抑制效果，當並用FeSO40.5μg/ml、ALA 50μg/ml和腺病毒時比單獨使用腺病毒表現出約200倍的增殖抑制效果。
如上所述，顯然ALA和Fe對溶瘤腺病毒AdE3-1A1.3B的增殖抑制效果具有顯著的亢進。其理由在於，通過β-gal分析表明提高腺病毒的感染能力，通過PFU分析表明腺病毒的產生量增加，顯然ALA和Fe可提高腺病毒的感染力、使產生量增加，即隨著腺病毒對癌細胞內的感染力的增加和在細胞內的產生量增加，顯著提高了抗腫瘤效果。
以前就知道ALA是卟啉代謝物，被整合到癌細胞中，作為其代謝物的原卟啉IX容易蓄積，由於該代謝物具有光敏作用，與準分子染料雷射器(excimer dye laser)並用，一直用於表面性癌的PDT治療(photodynamic therapy)。
上述原卟啉IX通過與Fe結合形成血紅素，在細胞內形成細胞色素等血紅素蛋白。該血紅素蛋白在細胞內線粒體參與呼吸系統，在ATP產生中起作用，參與蛋白合成。因此，血紅素蛋白由於參與用於腺病毒感染時產生腺病毒的蛋白合成，所以認為這些卟啉代謝亢進與腺病毒產生增加有關的可能性很大。
因此，在本發明的癌基因治療藥物、癌基因治療方法中，通過並用這些Fe和/或ALA等卟啉化合物，預期可進一步提高治療效果。即，通過並用Fe和/或ALA等卟啉化合物，可直接增加抗腫瘤效果、甚至在抗體存在下的感染抑制狀態下，通過靶細胞的腺病毒產生的增加所導致的CTL反應的亢進，在同系的小鼠模型中抗腫瘤效果提高，認為在人中也會呈現出同樣的良好的抗腫瘤效果。
另外在使用溶瘤病毒的癌基因治療中，即使不使用載體細胞的場合，預期通過並用Fe和/或ALA等卟啉化合物，也可提高治療效果。
〔實施例6使用本發明的癌基因治療藥物的癌治療法最優化的研究〕為了謀求將使用本發明的癌基因治療藥物的癌治療法的最優化，進行了以下一系列實驗。
首先與圖7所示實驗同樣地，使用免疫功能正常的皮下腫瘤模型小鼠((C57BL/6×C3/He)F1小鼠)，對本發明的癌基因治療藥物的體內抗腫瘤效果進行了研究。在本實驗中，通過給予免疫處理用病毒預先對出生後5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠進行免疫處理，免疫12周後，按照1隻小鼠1×106個皮下移植卵巢癌細胞OVHM，形成5-10mm的腫瘤後，向腫瘤內給予用上述腺病毒AdE3-1A1.3B以250vp/cell感染的A549細胞(Ad-A549)。作為免疫處理用病毒使用不含有E1基因的非增殖型的腺病毒，更具體講，使用在CMV啟動子的下遊插入了LacZ基因且未經紫外線等滅活處理的腺病毒Ad-β-gal，將該Ad-β-gal按照每隻小鼠11×1010vp進行皮內給予。另外，載體細胞A549細胞經用200Gy進行放射線處理後，按照1隻小鼠1次5×106個向腫瘤內共計給予6次。
圖18(a)、(b)給出了上述實驗結果。各圖表中，「Ad-β-gal→Ad-A549」是上述實驗結果，「Ad-A549」是只給予載體細胞的結果，「Ad-β-gal」是沒有給予免疫處理用病毒，作為治療只給予Ad-β-gal的結果，「對照」是給予PBS緩衝液的結果。各組小鼠數為n＝5。(a)的圖表是在比較短期觀察各小鼠的腫瘤體積的結果，(b)的圖表是長期觀察各組小鼠存活率的結果。如這些圖表示的那樣，確認「Ad-β-gal→Ad-A549」具有強力的體內抗腫瘤效果。
然後對從免疫處理用腺病毒給予至載體細胞給予的給予間隔進行研究。本實驗除了對該給予間隔進行各種各樣的改變以及用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染載體細胞A549細胞以外，其它與圖18所示實驗同樣地進行。
圖19(a)、(b)給出了上述實驗結果。各圖表中「2-4w」、「5-9w」、「10-15w」、「16-22w」為分別將上述給予間隔設定為2-4周、5-9周、10-15周、16-22周的間隔的實驗結果，各組小鼠數為n＝5。如這些圖表示的那樣，將上述給予間隔設定為10-15周時可獲得最好的抗腫瘤效果。像本實驗那樣，當作為免疫處理用病毒使用未經滅活處理的腺病毒Ad-β-gal時，在給予該病毒後大約10-15周，認為由T細胞引起的CTL反應與由中和抗體引起的感染抑制相比處於優勢。
如果考慮臨床應用，上述給予間隔希望是較短期間。因此，通過使用滅活處理的腺病毒Ad-β-gal作為免疫處理用病毒，研究能否將上述給予間隔縮短。研究結果如圖20所示那樣，可知當作為免疫處理用病毒使用紫外線(UV)照射滅活處理的腺病毒UV-Ad-β-gal時，將上述給予間隔設定在4周或3周時可獲得良好的抗腫瘤效果，即，通過對免疫處理用病毒進行滅活處理，可以將上述給予間隔縮短到3-4周左右。
上述實驗除了將滅活處理的腺病毒UV-Ad-β-gal作為免疫處理用病毒使用、將上述UV-Ad-β-gal按照每隻小鼠1×107vp進行皮內給予、將上述給予間隔設定為3周、4周、5周或6周以及使腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染載體細胞A549細胞以外，其它與圖18所示實驗同樣地進行。各組小鼠數為n＝10。
圖21是對將上述UV-Ad-β-gal作為免疫處理用病毒使用時的該病毒的給予量進行研究的結果。在該實驗中，在1×106vp至1×1011vp範圍內改變上述UV-Ad-β-gal的給予量。另外，除了上述給予間隔設定為6周以外，其它與圖20所示實驗同樣地進行。其結果表明UV-Ad-β-gal給予量為1×107vp時可獲得最好的抗腫瘤效果(根據該結果，在圖20所示的實驗中，將UV-Ad-β-gal的給予量設定為1×107vp)。
圖22(a)、(b)是對腫瘤免疫(tumor vaccination)效果進行研究的結果。將上述UV-Ad-β-gal按照每隻小鼠1×107vp進行皮內給予，給予10日後將用於腫瘤免疫的經放射線照射的卵巢癌細胞OVHM1×106個進行皮下移植。同時將扁平上皮癌細胞SCC7或卵巢癌細胞OVHM1×106個進行皮下移植，向形成了5-10mm腫瘤的小鼠腫瘤內給予6次每次5×106個AdE3-1A1.3B感染A549細胞的小鼠(圖中，「OVHM-RT+Ad-β-gal→SCC7」、「OVHM-RT+Ad-β-gal→OVHM」)與對照(圖中，不進行腫瘤免疫而對SCC7腫瘤進行載體細胞治療的「SCC7」、不進行腫瘤免疫而對OVHM腫瘤進行載體細胞治療的「OVHM」)相比，腫瘤的成長·增殖被顯著抑制，特別是對使用經放射線照射的OVHM進行腫瘤免疫、形成OVHM腫瘤的小鼠使用載體細胞進行治療時，所有小鼠中腫瘤都消失，沒有看到復發。
圖23是對使用非小細胞性肺癌細胞A549細胞進行的腫瘤免疫效果進行研究的結果。在該實驗中，將用腺病毒AdE3-1A1.3B以100vp/cell感染的經放射線處理後的A549細胞按照每隻小鼠1×106個進行皮下移植，移植40日後皮下移植1×106個卵巢癌細胞OVHM。在該小鼠(圖中，「AdE3-1A1.3B-感染A549→OVHM」)與對照(圖中，沒有進行腫瘤免疫，形成OVHM腫瘤，通過載體細胞進行治療的「OVHM」)相比，腫瘤的成長·增殖被顯著抑制，存活率大大改善。
由以上結果可知即使用不同種類的癌細胞進行腫瘤免疫，也有抗腫瘤效果。
接下來對將載體細胞和端膠原一起給予時的效果進行研究。在該實驗中，將用腺病毒AdE3-1A1.3B以規定量感染的A549細胞5×106個給予出生後5-10周的(C57BL/6×C3/He)F1鼠，此時混合注入端膠原使其最終濃度達到0.1％，研究是否可改善由於腺病毒的給予所帶來的副作用引起的死亡率。研究結果如圖24所示。圖中右側條是將端膠原與用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell或250vp/cell感染的A549細胞一起給予的結果，左側和中央條分別是給予用腺病毒AdE3-1A1.3B分別以5vp/cell、50vp/cell感染的A549細胞的結果(沒有混合注入端膠原)。如該圖表示的那樣，同時給予端膠原時，由副作用引起的死亡率銳減，還可增加給予量。這可認為是端膠原抑制腺病毒的擴散，並發生了對抗腺病毒中和抗體的封閉的緣故。
由以上結果可知通過同時給予端膠原與載體細胞，可以抑制副作用，可給予高容量的腺病毒。
然後，對給予1次、2次、3次滅活處理的上述腺病毒Ad-β-gal、由於猝發效果使得各個血中抗腺病毒抗體增加的小鼠中的抗腫瘤效果進行了研究。在該實驗中，給予出生後5周的(C57BL/6×C3/He)F1鼠1次、2次或3次腺病毒Ad-β-gal(各次每隔3周，1次給予1×1010vp)，然後，按照1隻小鼠1×106個皮下移植卵巢癌細胞OVHM，形成5-10mm腫瘤後，將放射線處理後的載體細胞給予到腫瘤內。作為載體細胞單獨使用A549細胞、或將A549細胞和293細胞混合後使用。
A549細胞與293細胞的混合物，對每隻小鼠向腫瘤內注射用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549細胞3.75×106個，和用腺病毒AdE3-1A1.3B以10vp/cell感染的293細胞3.75×106個，此為一次，共計向腫瘤內注射6次。結果如圖25(a)、(b)所示。而單獨A549細胞的場合，每隻小鼠向腫瘤內注射用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549細胞7.5×106個，此為一次，共計向腫瘤內給予6次。其結果如圖26(a)、(b)所示。在圖25和圖26中，「×1」「×2」「×3」分別是給予1次、2次、3次腺病毒Ad-β-gal的結果。如這些圖表示的那樣，通過多次給予腺病毒Ad-β-gal，即使在抗腺病毒抗體陽性的小鼠中，也可確認載體細胞產生的抗腫瘤效果。另外在此次實驗中，與單獨A549細胞相比，將A549細胞和293細胞混合後作為載體細胞使用成績更好。
圖27(a)、(b)是對給予不僅用腺病毒AdE3-1A1.3B，而且用GM-CSF表達載體感染的載體細胞(A549細胞)，並且與該載體細胞一起給予端膠原時的體內抗腫瘤效果進行研究的結果。在該實驗中，與圖26所示實驗同樣，向出生後5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠注射1次、2次或3次(各次每隔3周，1次注射1×1010vp)腺病毒Ad-β-gal，然後，按照1隻小鼠1×106個皮下移植卵巢癌細胞OVHM，形成5-10mm腫瘤後，將放射線處理後的載體細胞給予到腫瘤內。其中，載體細胞(A549細胞)在用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的同時，還用GM-CSF表達載體(在缺失了腺病毒的E1基因的部位的CMV啟動子下遊插入了GM-CSF基因的載體)以10vp/cell感染。將這樣製備的經放射線處理後的A549細胞按照1次7.5×106個與端膠原(濃度0.1％)一起給予到腫瘤內，向腫瘤內共計注射3次(×3)。
圖27(a)、(b)中，「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+GMCSF」是上述實驗結果，「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B」是按照1次7.5×106個給予只用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的載體細胞(A549細胞)，向腫瘤內共計給予6次(×6)的結果。如該圖表示的那樣，使用「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+GMCSF」是，儘管給予3次，但與給予6次「AdE3-1A1.3B」相比，給予腺病毒Ad-β-gal 1次、2次、3次的任一場合都可看到非常強的體內抗腫瘤效果。
由以上結果可知對載體細胞不僅感染溶瘤腺病毒，而且還感染GM-CSF表達載體，對癌治療是非常有效的。
圖28(a)、(b)是對在給予載體細胞時還向腹腔內給予鐵劑時的效果進行研究的結果。在該實驗中，與圖27所示實驗同樣，向出生後5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠注射1次、2次或3次(各次每隔3周，1次注射1×1010vp)腺病毒Ad-β-gal，然後，按照1隻小鼠1×106個皮下移植卵巢癌細胞OVHM，形成5-10mm腫瘤後，將放射線處理後的載體細胞給予到腫瘤內。其中，在給予載體細胞時，向腹腔內給予作為鐵劑的鐵葡聚糖(Fe-Dextran)0.01mg。載體細胞使用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/ceU感染的A549細胞，1次7.5×106個向腫瘤內共計給予3次(×3)(每次還給予鐵劑)。
圖28(a)、(b)中，「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+Fe」是上述實驗結果，「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B」是按照1次7.5×106個給予用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的載體細胞(A549細胞)，向腫瘤內共計給予6次(×6)的結果。如該圖表示的那樣，使用「Ad-β-gal→AdE3-1A1.3B+Fe」，儘管只是3次，但給予1次、2次、3次腺病毒Ad-β-gal的任一情況下的利用載體細胞的治療與使用AdE3-1A1.3B感染載體細胞6次的治療相比，可確認非常強的體內抗腫瘤效果。
由以上結果可知在給予載體細胞時一起給予鐵劑對癌治療是非常有效的。
接下來在載體細胞給予前對載體細胞進行的放射線處理中，對照射的放射線量進行了研究。實驗中使用出生後5周的裸鼠，對A549細胞用不同的放射線量進行放射線處理後，按照每隻小鼠1×107個進行皮下移植，觀察腫瘤的形成·成長。其結果如圖29所示。如該圖表示的那樣，通過將照射的放射線量定在120Gy或其以上，可抑制腫瘤的形成·成長。
圖30給出了在使用(C57BL/6×C3/He)F1小鼠的實驗中，用不同的放射線量對載體細胞(A549細胞)進行放射線處理時的抗腫瘤效果的研究結果。在該實驗中，向出生後5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠給予1×1010vp腺病毒UV-Ad-β-gal，注射5周後、按照每隻小鼠1×106個皮下移植卵巢癌細胞OVHM，形成5-10mm的腫瘤後，向腫瘤內給予以放射線量50Gy、100Gy、200Gy或400Gy進行放射線處理的載體細胞。載體細胞使用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549細胞，每1次7.5×106個、共計向腫瘤內給予6次。其結果表明在放射線處理中照射的放射線量400Gy可獲得比200Gy更良好的結果。
圖31給出了有關溶瘤病毒對載體細胞的感染量的研究結果。在該實驗中，將腺病毒Ad-β-gal按照1×1010vp給予到出生後5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠，給予4周後，按照1隻小鼠1×106個皮下移植卵巢癌細胞OVHM，形成5-10mm腫瘤後，向腫瘤內給予以放射線量250Gy進行放射線處理的載體細胞。另外，腺病毒AdE3-1A1.3B對載體細胞(A549細胞)的感染量定在100vp/cell、250vp/cell或500vp/cell中的任一個，1次給予7.5×106個載體細胞，向腫瘤內共計給予6次。進一步，在給予載體細胞時，同時向腫瘤內給予端膠原(濃度0.1％)。其結果可知上述感染量為250vp/cell時可獲得最好結果，如果設定在150-400vp/cell左右效果也很好。
圖32(a)、(b)是在與圖31所示實驗同樣的實驗中對腫瘤免疫效果進行研究的結果。在該實驗中，將腺病毒Ad-β-gal按照1×1010vp給予到出生後5周的(C57BL/6×C3/He)F1小鼠中，給予4周後，按照1隻小鼠1×106個皮下移植為了腫瘤免疫而以放射線量80Gy進行放射線處理的卵巢癌細胞OVHM-RT。然後再皮下移植1×106個卵巢癌細胞OVHM，形成5-10mm腫瘤後，向腫瘤內給予以放射線量250Gy進行放射線處理的載體細胞。載體細胞使用用腺病毒AdE3-1A1.3B以50vp/cell感染的A549細胞，1次7.5×106個，共計腫瘤內給予3次。另外，在給予載體細胞時，一併向腫瘤內給予端膠原(濃度0.1％)。其結果表明進行腫瘤免疫的小鼠(圖中，「OVHM-RT→A549」)與沒有進行腫瘤免疫的小鼠(圖中，「A549」)相比，腫瘤的成長·增殖被顯著抑制，存活率大大改善。
由以上結果可知，在使用本發明癌基因治療藥物時，通過並用腫瘤免疫，可以獲得良好的抗腫瘤效果。
產業上可利用性如上所述，本發明的癌基因治療藥物幾乎可以適用於所有的惡性腫瘤，預期對卵巢癌、扁平上皮癌(子宮頸部癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌等)、消化器官癌(大腸癌、胰癌、肝癌、胃癌等)、成神經細胞瘤、腦腫瘤、乳癌、精巢癌、前列腺癌等各種癌具有強力的抗腫瘤效果。
權利要求
1.一種癌基因治療藥物，該藥物含有以溶瘤病毒感染、並用於使該病毒作用於腫瘤細胞的載體細胞，該載體細胞選自下述(1)～(4)的細胞(1)A549細胞(2)293細胞(3)SW626細胞(4)HT-3細胞。
2.根據權利要求1所述的癌基因治療藥物，按照治療對象的癌的種類等，上述使載體細胞感染的溶瘤病毒含有1A1.3B啟動子、中期因子啟動子、β-HCG啟動子、SCCA1啟動子、cox-2啟動子、PSA啟動子、或其它的腫瘤特異性啟動子。
3.根據權利要求1或2所述的癌基因治療藥物，上述溶瘤病毒選自腺病毒、皰疹病毒、HIV病毒等慢病毒、逆轉錄病毒、呼腸病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、或其它溶瘤病毒。
4.根據權利要求1所述的癌基因治療藥物，還包含為了誘導生物體對載體細胞的給予所產生的CTL反應而給予的免疫處理用病毒。
5.根據權利要求1所述的癌基因治療藥物，還包含端膠原。
6.根據權利要求1所述的癌基因治療藥物，還包含在給予前使載體細胞感染的GM-CSF表達載體。
7.根據權利要求1所述的癌基因治療藥物，還包含鐵劑和/或卟啉化合物。
8.根據權利要求1所述的癌基因治療藥物，還包含為了腫瘤免疫而給予的腫瘤細胞。
全文摘要
本發明的癌基因治療藥物含有以溶瘤病毒感染並用於使該病毒作用於腫瘤細胞的載體細胞，該載體細胞可以使用已被確認具有強力抗腫瘤效果的A549細胞、293細胞、SW626細胞、HT－3細胞中的任一個。本發明由於使用已被確認在體外和體內都有高的抗腫瘤效果的細胞作為載體細胞，所以可獲得比以往的載體細胞更強力的抗腫瘤效果。
文檔編號A61K35/76GK1867362SQ20048003031
公開日2006年11月22日 申請日期2004年10月15日 優先權日2003年10月15日
發明者濱田雄行, 後藤章暢, 白川利朗 申請人:財團法人新產業創造研究機構