去除含有非所需核酸的溶液的汙染的方法

2023-12-10 07:56:27 2

專利名稱：：去除含有非所需核酸的溶液的汙染的方法去除含有非所需核酸的溶液的汙染的方法
技術領域：
：本發明涉及對含有非所需核酸的溶液去除汙染的方法。本發明還涉及這種處理過的溶液的用途。分子生物學的進步使得有可能對核酸進行操作。擴增方法由此變成了必不可少的工具，這意味著更大量的核酸可以在相對短的時間內從極少量的核酸產生。這類技術的主要缺陷在於在臨床檢測中會擴增非所需的核酸，產生不正確的結果或者甚至產生假陽性。這被稱為汙染。這樣的汙染可有多種來源實驗臺的清潔差，人員，環境，設備及吸量管裝置，或未滅菌的樣本。已開發了一定數量的旨在限制這類汙染的推薦方法。其都是預防性方法，包括例如操作樣本(特別是滅菌技術)或實驗室設備(物理限定的工作區域，通風櫥的使用，外部與內部的壓力梯度，從而氣流可以所需方向恆定抽空等等)。汙染還可來自由預先擴增產生的擴增子或者樣本之間的交叉汙染。其他不可忽視的汙染來源存在於用於擴增反應的起始材料(酶，試劑)。因此，Corless等人討論了在實時PCR反應中由汙染的taq聚合酶引起的對測定16SRNA的敏感性問題(JClinMicrobio1，38(5)，1747-1752(2000))。對擴增所必需的酶汙染進行糾正的第一種方式在於酶去除汙染方法。因此，專利US-A-5418149描述了使用能夠降解來自酶生產細胞的核酸的尿嘧啶-DNA-糖基化酶的方法。該技術應用了所需蛋白的過表達，在這種情況下，其是在尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)和脫氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)缺陷的大腸桿菌細胞中的聚合酶。由於UNG缺乏，所述細胞不能夠清除摻入的脫氧尿嘧啶鹼基。由於dUTPase的缺乏，細胞增加了其脫氧尿苷庫。因此，所述培養介質可以允許產生所需的蛋白(聚合酶)並將脫氧尿苷摻入所述核酸。然後使用標準純化技術對所述合成蛋白進行純化並採用能夠將殘留核酸的尿嘧啶殘基片段化的尿嘧啶-DNA-糖基化酶處理。所述糖基化酶隨後通過加熱滅活以防止在擴增反應中對靶DNA的破壞。該方法特異於製備重組蛋白，其主要不足在於該方法的用途。此外，去除汙染局限於含有尿嘧啶的核酸。再者，其他可能的不足在於加熱處理僅誘導部分尿嘧啶-DNA-糖基化酶失活。與所述蛋白接觸的靶DNA因此有可能被破壞。由Ashkenas等人所述的其他酶學方法(Biotechniques;Jul2005;39(1):69-73)包括對含有擴增所必需的全部元件的溶液去除汙染。在這種情況下，限制酶的混合物被用於RT-PCR。那些酶降解存在於含有被擴增靶RNA的所述擴增反應介質中的雙鏈DNA。當逆轉錄發生時，其隨後通過加熱而失活。也描述了該方法用於PCR應用的替代方法，即在雙鏈耙DNA存在的情況，但僅限於使用一類限制酶(II型RE)。然而，限制酶的使用使得其不足在於僅切割雙鏈核酸，還必需具有識別位點。出於這一原因，以單鏈和/或具有少數或沒有此類位點的形式存在的汙染物就不能被清除。其他的酶學去除汙染方法包括在與靶核酸進行接觸之前就從溶液中清除非所需的核酸。專利申請WO-A-99/07887描述了在與所述靶核酸接觸之前在反應介質中含有的能降解雙鏈核酸的不耐熱DNAse的應用。該酶隨後通過加熱失活。該技術的主要不足在於這樣的酶不能降解以RNA、單鏈DNA或RNA/DNA異源雙鏈形式存在的汙染物。此外，在反應介質中通過加熱使酶失活也需使用熱穩定的聚合酶。現有技術還描述了非酶學方法。因此，Mohammadi等人(JClinMicrobiol,Oct2003;41(10):4796-8)描述了包含對提取試劑進行柱過濾以及任選在擴增之前由限制酶Sau3AI消化PCR試劑的技術。過濾技術的不足在於事實上這樣的技術還不能夠在不改變濃度或性質的條件下應用於複雜介質。此外，這樣的補充過濾步驟有可能本身就成為汙染源。專利申請WO-A-94/12515描述了由光反應化合物處理含有Taq聚合酶以及潛在汙染核酸的溶液的方法。所述光反應化合物例如呋喃香豆素衍生物是通過暴露於紫外線照射而活化的。除了難以使用，該技術的主要不足在於照射對蛋白造成的有害影響。此外，該方法保持了低效率，因為所述核酸的隨機降解有可能產生也可被擴增的片段。由Chang等人(RNA，May2005;11(5):831-6)描述的其他非酶學方法使用鈷絡合物來抑制翻譯。該絡合物能夠水解DNA和RNA的磷酸二酯鍵。該技術的主要不足在於核酸的不完全降解以及緩慢的去除汙染反應(24小時)。為了純化被核酸汙染的生物分子，在專利申請WO-A-2006/034009中還描述了金屬絡合物。因此，由與銅原子結合的兩個菲咯啉分子(雙(i,io-菲咯啉/Cu)所構成的片段化絡合物可用於純化含有taq聚合酶的溶液。為了去除汙染核酸和/或片段化分子可使用標準層析技術隨後純化所述溶液。該方法的主要不足在於存在純化步驟，使得其應用困難並增加了新汙染的風險。專利EP-B-0646180描述了使用金屬螯合物失活核苷酸序列的方法。片段化絡合物如雙(l，lO-菲咯啉)/Cu被用於在擴增步驟之後對含有全部存在的核酸的溶液去除汙染。這可以預防由之前擴增反應所產生的擴增子引起的新樣本的汙染。該文件還描述了使用片段化分子來去除生物產物製品的汙染。在第一種使用的情況下，該方法的主要不足在於其不能降解全部的汙染核酸，僅能夠降解由之前擴增反應所產生的擴增子。在第二種情況下，其主要不足在於存在純化步驟(超濾，沉澱，層析)，使得其應用困難並增加了新汙染的風險。考慮到現有技術的不足，本發明人提出了新的方法，該方法可簡單快速地對含有非所需核酸的溶液去除汙染。在此，本發明在第一方面提供了去除溶液中存在的任意核酸的汙染的方法，所述方法包括以下步驟*將所述溶液與稱作片段化分子的具有通過片段化降解核酸的性質的至少一類分子作用充分的時間，直到所述稱作汙染核酸的核酸完全降解；*終止所述片段化分子的活性。本發明的一個優勢在於這種去除汙染方法不需要純化步驟清除片段化分子。被處理的核酸是以單鏈或雙鏈形式存在的RNA或DNA以及RNA/DNA異源雙鏈。這一方法對汙染起始材料例如來自天然來源例如細菌的酶特別有用。這些酶因此被得自所述細菌的天然核酸高度汙染。另一方面，本發明提供了去除含有汙染核酸及感興趣核酸的溶液的汙染的方法，包括以下步驟*將所述溶液與稱作片段化分子的具有通過片段化降解汙染核酸的性質的至少一類分子作用充分的時間，直到所述汙染核酸完全降解，保留了感興趣核酸；終止所述片段化分子的活性。所述汙染核酸可以是人類基因組DNA，感興趣核酸可以是以極少量存在於混合物中的病毒或細菌核酸。所述感興趣核酸可以通過片段化分子的作用而受到保護。例如，其可由外包膜(衣殼，細菌細胞壁等等)天然保護，而所述汙染核酸則否。在本發明的一個有利的實施方案中，在終止所述片段化分子的活性之後，該方法還包括含有擴增反應的補充步驟。優選地，本發明所述去除汙染方法特徵在於所使用的片段化分子具有以隨機方式水解所述汙染核酸的磷酸二酯鍵的性質。如一個實施方案所述，所述片段化分子是由形成雙(1，10-菲咯啉)/金屬絡合物的結合於金屬原子的兩個UO-菲咯啉分子所構成的絡合物。優選地，所述金屬是過渡金屬，例如銅，釕，鎳，鐵，鋅，銠，鈷或錳。優選地，所述片段化分子的兩個菲咯啉核通過連接臂相互連接形成了ClipPhen分子。ClipPhen分子已在文獻中廣泛描述。可有多種連接臂連接兩個菲咯啉核。優選地，兩個菲咯啉核之間的連接臂是由三個連續碳原子組成的鏈構成的，其中在中間位置的碳原子是取代的且其中每個末端碳原子都通過氧原子例如絲氨醇連接於菲咯啉核。優選地，中間位置的碳原子是由-NH2或-皿-(:0-0^取代的且每個末端碳原子都通過所述核上的2位或3位的氧原子連接於菲咯啉核。許多其他的連接也是可能的，例如二氨基-環己垸(ChemistryLetters,vol33，No.6，p684-985，Hayashi等人)或乙二醇，丙二醇或戊二醇(Synlett2001，No.lO，1629-1631，Boldron等人)。與金屬相連的ClipPhen分子的片段化活性是本領域技術人員公知的(ChemicalReview,1993，93，2295-2316，DSigman等人；JChemSoc1961，2007-2019，James等人)。出於改善其水解性質的目的，該分子已在眾多研究中進行了檢測。其具有降解全部核酸即以單鏈或雙鏈形式存在的DNA和RNA以及RNA/DNA異源雙鏈的優勢。因此，與雙(l，lO-菲咯啉)/金屬絡合物相比，2-ClipPhen/金屬((1，3-雙(1,10-菲咯啉-2-基氧基)丙-2-胺/金屬)禾卩3-ClipPhen/金屬(1，3-雙(1,10-菲咯啉-3-基氧基)丙-2-胺/金屬)表現出了大大增強的核酸酶活性(InorganicChemistry1998，3486-3489，Pitie等人；Chemcommun1998，2597-2598，Pitie等人；EurJInorgChem2003，528-540，Pitie等人以及BioconjugateChemistry2000，11，892-900，PitieM等人)。類似地，與銅絡合的ClipPhen分子可高效並以隨機方式水解DNA或RNA的磷酸二酯鍵。其可與銅原子絡合從而產生具有氧化態I或II的絡合物，如James等人在JChemSoc1961，2007-2019出版物中所示。分子2-ClipPhen-Cu和3-ClipPhen-Cu如下所示formulaseeoriginaldocumentpage10因此，本發明還涉及去除溶液中的存在的任意核酸的汙染的方法，所述方法包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分的時間，直到所述汙染核酸完全降解。又一方面，本發明包含去除含有汙染核酸和感興趣核酸的溶液的汙染的方法，包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分的時間，直到所述汙染核酸完全降解，保留了感興趣的核酸。如本發明的一個實施方案所述，可通過加入過量的有機還原劑終止所述片段化分子的片段化活性。當所述有機還原劑由硫醇構成時，片段化分子與終止所述反應的有機還原劑之間的比例大於1比100，優選大於1比1000。本實施方案的一大優點在於所述片段化分子是原位失活的。這些分子因此並不需要從溶液中移出。後者可在各種應用例如擴增中使用。因此，根據存在有機還原劑的濃度，所述片段化分子可被活化或失活。如本發明的另一實施方案所述，可通過加入對金屬比ClipPhen具有更高親和性的絡合劑(CA)例如EDTA或任意其他絡合劑終止所述片段化分子的片段化活性，並替換平衡ClipPhen-金屬+CA—ClipPhen+金屬畫CA在本發明的一個特別實施方案中，所述片段化分子是結合過氧化氫H202的I型銅絡合物，並任選具有其他還原劑，優選為有機還原劑。優選地，所述片段化分子是I型ClipPhen/Cu分子。在I型銅絡合物的情況下，所述核酸酶活性如以下兩個階段進行a)陽性電荷的銅絡合物與所述核酸形成絡合物；b)在一系列反應之後，通過與H202形成Cu-氧或Cu-OH中間體氧化所述核酸，從而導致核酸切割。如另一實施方案所述，所述分子是結合其他還原劑優選有機還原劑的II型銅絡合物。在這種情況下，在空氣與還原劑的作用下可在原位產生過氧化氫。再優選地，所述片段化分子是II型ClipPhen/Cu分子。當其他有機還原劑是羧酸或羧酸衍生物時，所述片段化分子與有機還原劑之間的比例範圍為1比1至1比100。至於前述實施方案的功能，所述有機還原劑構為*硫醇如二硫蘇糖醇(DTT)，硫代酸如巰基丙酸；或*羧酸；或*羧酸的衍生物如抗壞血酸；或*磷化氫如三羧乙基磷化氫(TCEP)。在一個特別實施方案中，所述片段化分子和/或還原劑被固定化於固相支持物上。這類固相支持物可以是乳膠顆粒(任選磁性的)，玻璃(CPG)，矽石，聚苯乙烯，瓊脂糖，瓊脂糖(sepharose)，尼龍等等。其還可以是濾器，膜，條或薄膜。當其上固定有片段化分子和/或還原劑的固相支持物從溶液中移出時，所述片段化分子的片段化活性也可被終止。所述片段化分子還可通過共價鍵或通過吸附於被考慮的支持物上得以固定。有許多涉及支持試劑的參考文獻業已存在；可特別參考Laurent等人的TetrahedronLetters45，8883-8887，2004。本發明與現有技術相比的又一優勢在於核酸所經歷反應的快速性。對濃度範圍為lnM至lOOnM的ClipPhen/金屬分子而言，處理時間的範圍為5分鐘至60分鐘，優選範圍為10分鐘至30分鐘。在本發明的優選方式中，所述溶液含有除核酸外用於擴增反應必需的全部組分，即靶，擴增引物以及檢測探針。本發明還涉及如本發明所述處理的溶液的用途，在有機還原劑存在的條件下將所述溶液混合於含有擬進行擴增的靶核酸以及特異於所述靶核酸的擴增引物和檢測探針的生物樣本，從而產生能夠終止所述片段化分子作用的過量有機還原劑。終止所述片段化分子作用的有機還原劑可以與加入活化所述片段化分子的核酸反應的其他有機還原劑相同或不同。定義術語"核酸"是指至少2個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的串聯。所述核酸可以是天然或合成的，寡核苷酸，多核苷酸，核酸片段，基閔會日DNA，核糖休RNA，信使RNA，轉運RNA，或通過酶擴增技術獲得的核酸，例如*PCR(聚合酶鏈反應)，見於專利USA-4683195，USA-4683202以及USA-4800159，及其衍生RT-PCR(逆轉錄PCR)，特別是以一步形式描述的，例如見於專利EP-B-0589272;*LCR(連接酶鏈反應)，例如描述於專利申請EP-A-0201184;*RCR(RepairChainReaction),描述於專利申請WO-A-90/01069;*3SR(自我持續序列複製)，參見專利申請WO-A-卯/06995;*NASBA(基於核酸序列的擴增)，參見專利申請WO-A-91/02818;以及*TMA(轉錄介導的擴增)，參見專利US-A-5399491。我們應該使用術語"擴增子"來指代通過酶擴增技術產生的核酸。術語"任意核酸"是指以單鏈或雙鏈形式的RNA或DNA序列以及RNA/DNA異源雙鏈。術語"終止所述片段化分子的活性"是指*加入過量的有機還原劑；或參加入絡合劑。術語"降解"是指降解或片段化至少90%的汙染核酸。優選地，所述降解被稱為"完全的"，其意味著對DNA或RNA的降解，優選為通過水解磷酸二酯鍵的降解，導致形成了"不可擴增的"核酸序列。術語"不可擴增的"核酸意味著在存在有至少10個核苷酸優選大小的引物條件下所述核酸不能被擴增。這些"不可擴增的"核酸大小因此小於20個核苷酸，優選為小於10個核苷酸。術語"溶液"是指同質或異質水溶液。其可以是作為混合物或其他的含有酶，有機分子(三磷酸核苷酸，糖，糖類，多糖，小有機分子等)，無機分子(鹽等)的複合溶液。所述溶液還可含有固相支持物，例如從乳膠，任選是磁性的乳膠，玻璃(CPG)，二氧化矽，聚苯乙烯，瓊脂糖，瓊脂糖，尼龍等形成的顆粒。其還可以是濾器，薄膜，膜或條。所述溶液還可以由與固相表面例如塑料管(Eppendorf類型)接觸的溶液組成，從而允許對所述表面去除汙染。附圖與實施例描述了特定的實施方案，且不應被理解為對本發明範圍的限制。圖1:對用ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物在37°C作用1小時的1080鹼基轉錄物(野生型沙門氏菌)降解情況的生物分析儀研究(Agilent,RNA6000PicoKit，USA)。在柱2，3，4，6和7中31秒的暗條帶對應於所述1080鹼基轉錄物。*柱1:核苷酸大小規模。注射入一系列增加的RNA大小，允許對所分析核酸的大小進行定量並計算，作為在該時間其通過生物分析儀檢測器前方的時間函數。在垂直軸上的測定單位是秒。通過時間與所述核酸質量的轉化是通過生物分析儀軟體實現的。*柱2:在存在5iaM(微摩)ClipPhen-Cu條件下的5nM(納摩)轉錄物。*柱3:在存在500nM的ClipPhen-Cu條件下的5nM轉錄物。*柱4:在存在50nM的ClipPhen-Cu條件下的5nM轉錄物。*柱5:加入500pM抗壞血酸的上述柱2。*柱6:加入50inM抗壞血酸的上述柱3。*柱7:加入5^iM抗壞血酸的上述柱4。圖2:通過增加DTT濃度(0-16mM)對核酸片段化的抑制。曲線A對應於OmM的DTT。曲線B對應於lmM的DTT。曲線C對應於3mM的DTT。曲線D對應於5mM的DTT。曲線E對應於10mM的DTT。曲線F對應於16mM的DTT。曲線G對應於對照OmM的DTT和OmM的抗壞血酸。圖3:在所述混合物中作為DTT濃度函數的模型螢光寡核苷酸片段化率(相對螢光單位(RFU)每分鐘)。圖4:ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物對含有核酸的水溶液(100細胞當量(叫uivalent)/ul蠟狀芽孢桿菌(5Ce^w)的總RNA)的效果。曲線A對應於未經任何處理的擴增對照(+對照)。曲線B對應於50pMClipPhen-Cu/500pM抗壞血酸混合物，通過加入17rnMDTT並保溫30分鐘，其活性被立即抑制。曲線C對應於保溫30分鐘的50pMClipPhen-Cu/500pM抗壞血酸混合物，在這一時間之後用DTT終止片段化。圖5:通過ClipPhen-Cu(與或不與抗壞血酸)對DNA或單鏈RNA片段化的比較。曲線被標準化為l。曲線a:用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025。曲線b:用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的螢光寡核苷酸(RNA)No16027。曲線c:實驗a的陰性對照用於ClipPhen-Cu混合物單獨作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025。曲線d:實驗b的陰性對照用於ClipPhen-Cu混合物單獨作用的螢光寡核苷酸(RNA)No16027。圖6:ClipPhen-Cu混合物(與或不與抗壞血酸)對單鏈或雙鏈DNA片段化的比較。所述曲線代表對應於每分鐘螢光升高的片段化速率(RFU/分)。曲線a:用於ClipPhen-Cu混合物作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025/互補DNA耙(No16026)雙鏈(陰性對照)。曲線b:用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025/互補DNA耙(No16026)雙鏈。曲線c:用於ClipPhen-Cu混合物作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025(陰性對照)。曲線d:用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025。圖7:ClipPhen-Cu(與或不與抗壞血酸)對DNA或RNA雙鏈或RNA/DNA異源雙鏈的片段化比較。曲線被標準化為l。曲線a:用於ClipPhen-Cu混合物作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025/互補DNA耙(No16026)雙鏈(陰性對照)。曲線b:用於ClipPhen-Cu混合物作用的螢光寡核苷酸(RNA)No16027/互補RNA耙(No16028)雙鏈(陰性對照)。曲線c:用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的螢光寡核苷酸(DNA)No16025/互補DNA耙(No16026)雙鏈。曲線d:用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的螢光寡核苷(RNA)No16027/互補RNA耙(No16028)雙鏈。曲線e:用於ClipPhen-Cu混合物作用的螢光寡核苷酸(RNA)No16027/互補DNA耙(No16026)異源雙鏈(陰性對照)。曲線f:用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的螢光寡核苷酸(RNA)No16027/互補DNA革巴(No16026)異源雙鏈。圖8:在存在5mM抗壞血酸的條件下，由固定於Tentagel珠的ClipPhen-Cu切割16sRNA(13ng/uL)的生物分析儀(Agilent)觀察。電泳圖A:在水中降解之前的RNA靶。電泳圖B:在存在抗壞血酸條件下降解之前的RNA靶。電泳圖C:在存在抗壞血酸和固定於Tentagel樹脂的ClipPhen-Cu條件下降解的RNA耙(1個Tentagel珠，30分鐘)。實施例1:ClipPhen-Cu分子對轉錄物的水解及抗壞血酸的起始物作用目的本實施例證明了ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物對模型核酸(沙門氏菌RNA轉錄物1080鹼基)的片段化作用。其還證明了抗壞血酸對片段化反應起始的作用。將所述轉錄物用於多種濃度的ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物進行作用。將對照也用於在缺乏抗壞血酸條件下的ClipPhen-Cu作用。隨後使用Agilent的生物分析儀對所述片段進行分析(圖1)。操作程序轉錄物溶液(沙門氏菌野生型，1080鹼基)是由2pl的於水中lpM濃度的轉錄物和18|ul的pH7.2的80mM(毫摩爾)磷酸緩衝液、20mMMgCl2、100mMNaCl組成的。將該溶液加熱至70°C保持2分鐘然後投入冰中。然後，向5nl這一溶液中加入1^1ClipPhen-Cu(500，50和5pM)和4|nl上述使用的緩衝液。所得為溶液2並在37°C放置1小時。然後，取5nl溶液2並加入42.5^1緩衝液和2.5nl新配製的抗壞血酸溶液(對ClipPhen-Cu而言為100eq)或在對照情況下為水。由此，分別製備含有5nM轉錄物，(5pM，500nM和50nM)CIipPhen-Cu以及(500，50和5]liM)抗壞血酸的一系列管或在對照情況下為水。立即將lpl所述6種溶液注射在RNAPico晶片(參考號碼為5067-1512的商業試劑盒，Agilent，USA，用於Agilent,USA的生物分析儀系統)上從而觀察片段化產物。結果與結論在柱5到7中，對於所述轉錄物的片段化作用可根據出現的低於20個核苷酸大小的各種條帶(在20秒時右側箭頭)來觀察。因此，經過ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物處理的轉錄物部分或全部降解，作為ClipPhen-Cu濃度的函數。在5nM至0.5jxM之間，可觀察到初始條帶消失。採用5nM轉錄物，5一ClipPhen-Cu和500nM抗壞血酸，獲得完全降解全部擴增子的反應時間是30-60分鐘的量級。全部降解所述轉錄物所需的ClipPhen-Cu數量為微摩爾量級(柱5)。相反，未用抗壞血酸(柱2)進行的相同實驗清楚顯示完整的條帶。這因此證明了當抗壞血酸未加入時(過量量級為l-100eq)，所述ClipPhen-Cu混合物沒有活性。實施例2:通過還原劑抑制ClipPhen-Cu分子目的本實施例旨在表明通過ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物對核酸的降解可以被加入過量的還原劑如DTT完全抑制。將模型螢光寡核苷酸(由Eurogentec(Liege，比利時)合成的序列16025:與ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的作用。通過片段化，其允許在520nm出現螢光，因為所述FAM螢光團物理上與TARMA螢光淬滅劑有一定距離。螢光的出現是使用螢光計(NucliSenEasyQ分析儀，NasbaDiagnostic,BioMerieux，Boxtel(NL))隨時間進行測量的。所述實驗是針對固定濃度的ClipPhen/抗壞血酸使用增加濃度的DTT來進行的，以測定通過弱化釋放的螢光而由DTT提供的抑制。操作程序將含有下列元件的一系列管在37°C保溫5分鐘*螢光寡核苷酸16025，10nM(1)Lil至200nM);*DTT(以在終體積中製備從1到16mM—系列濃度的lnl);以及*17pl磷酸緩衝液，80mM，pH7.2，MgCl220mM，NaCl100mM。然後，加入如下製備的lplClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物臨時製備的於50/50DMF/水中的200pMClipPhen和200pMCuCl2以及於水中的20rnM抗壞血酸(來自10mMClipPhen和1M抗壞血酸的濃縮溶液)。最後，所述20nl溶液含有10nM螢光寡核苷酸，10pMCIipPhen+Cu2+，lmM抗壞血酸和0/1/3/5/10/16mMDTT。對照是不使用抗壞血酸和不使用ClipPhen-Cu製備的。然後，將所釋放的螢光測定60分鐘(圖2)。條件如下exc/em濾器(485/518nm)，時間間隔(l分鐘)，積分時間(100ms)。使用所獲得的曲線，對所述反應前兩分鐘的片段化反應速率進行了測定，還繪製了圖，即描述作為DTT濃度函數的片段化速率的圖3。結果與結論可以看出對增加的DTT濃度而言，從lOmM開始不再出現螢光(圖2和圖3)。這意味著所述ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的活性完全被過量的還原劑終止了。這個實驗證明了向核酸/ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物中加入10-16mM的DTT能夠終止所述反應並使得該混合物符合於擴增反應的未來應用。實施例3:ClipPhen在水溶液中的去除汙染作用目的以200細胞當量/ul量的蠟狀芽孢桿菌總RNA混合物汙染的水溶液被用於與ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物(50nM/500nM)作用30分鐘去除汙染。通過以10mM的量加入DTT使得ClipPhen-Cu的活性隨後被完全終止。然後，進行了NASBA擴增反應(來自於bioMerieux的NuclisensBasic試劑盒V2，參考號碼60079136，Boxtel(NL))從而評價片段化效率並證明了可擴增核酸的缺乏。在對這一混合物進行擴增之前無需進行純化。製備了對照以測定此後的任意抑制作用，其中ClipPhen-Cu活性從tO就被抑制。至此，DTT是在加入靶RNA之前在充分的條件下(10mM)加入的並保溫30分鐘。操作程序對富含總RNA的水溶液通過ClbPhen-Cu/抗壞血酸混合物去除汙染lOplClipPhen-Cu(250nM於水/DMF，50/50)，20|il水和10^1濃度為2.5mM於水中的抗壞血酸被加入蠟狀芽孢桿菌RNA的總RNA溶液中(以2000細胞當量/ul水的5^1)。將該擬去除汙染溶液在環境溫度下保溫30分鐘。終止ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的片段化活性向前述溶液加入5inl173.7mMDTT(終DTT濃度17.3mM)從而終止水解反應並滅活ClipPhen。獲得溶液A。對照表明ClipPhen-Cu/抗壞血酸/DTT混合物沒有片段化活性且如果通過加入DTT立即終止所述片段化活性則不抑制NASBA同時進行了對照實驗，其中蠟狀芽孢桿菌RNA的總RNA溶液在存在5|nl173.7mMDTT，10plClipPhen國Cu(250(iM在水/DMF50/50，20^1水和lOinl抗壞血酸，2.5mM於水中)的條件下保溫。將其中ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物被立即滅活的這類溶液在環境溫度下保溫30分鐘。這個實驗可以測定由ClipPhen-Cu/抗壞血酸/DTT混合物對擴增反應的任意抑制。此為溶液B。去除汙染後對殘留於溶液A中且仍存在於溶液B中核酸的擴增接下來，向5^1溶液A或B中加入10^"反應混合物REAG"(來自NecliSensEasyQBasic試劑盒，bioMerieux，商業參考號碼285006，Boxtel(NL))。這樣的混合物含有擴增所需的試劑，兩種引物以及檢測擴增所需的探針。這樣的溶液還含有足量的DTT(6mM)以防止ClipPhen的反應性。因此所述混合物的終濃度為lOmMDTT。所述溶液在65°C保溫2分鐘然後在41。C保溫2分鐘。然後，向前述溶液中加入5jli1來自BasicKitNucliSensbioMerieux"酶混合物ENZ"混合物以進行擴增。所述反應介質在bioMerieux的"NucliSensEasyQ，，螢光計(NucliSenEasyQ分析儀，NasbaDiagnostic,BioMerieux,Boxtel(NL))中在41。C保持了l小時30分鐘。記錄所述螢光檢測結果並繪製曲線(圖4)。結果與結論在對應於通過加入DTT溶液立即抑制ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的對照的曲線B中觀察到了輕微的延遲。在擴增中的這種延遲完全不會改變所述檢測的靈敏度，因為擴增起始的斜率是相同幅度的。這是因為對陽性對照而言DTT的濃度增加(曲線A)。在這種情況下，表明ClipPhen-Cu/抗壞血酸/DTT混合物對NASBA沒有作用且適於這一擴增反應的酶也不會受到這一化合物混合物的影響。此外，還表明DTT抑制ClipPhen-Cu的片段化活性，因為當加入足量的DTT之後，沒有觀察到降解活性。曲線C表示儘管ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物的活性已經維持了30分鐘，然後通過加入DTT(17mM)終止，所述片段化依然終止以至於所述擴增曲線不再延遲。在此已經證明絡合物混合物(ClipPhen-Cu/抗壞血酸)可用於降解核酸，且這樣的活性可通過加入過量的DTT而終止，且這樣的溶液(沒有純化)可用於隨後的酶學擴增。這一技術因此可方便地解決核酸汙染的問題。實施例4:ClipPhen-Cu對除了RNA的核酸的片段化；對單鏈DNA、雙鏈DNA和雙鏈RNA以及RNA/DNA異源雙鏈的應用目的本實施例證明了ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物可降解單鏈RNA或DNA以及相應的雙鏈或異源雙鏈。操作程序由螢光寡核苷酸(探針)和由Eurogentec訂購的互補靶製備下表所示的溶液(表l)。表l:用於實施例4中的序列tableseeoriginaldocumentpage20螢光寡核苷酸母液的濃度在水中為200nM，其在18^1的80mM磷酸緩衝液，pH7.2，MgCl220mM，NaCl100mM中被稀釋成10nM(lpl)。以相同濃度加入互補靶作為本實施例的功能。將所述溶液隨後變性，並在37。C放置1小時從而允許兩條鏈雜交。然後，在使用EasyQ(bioMerieux，參見實施例1)在37°C實施120分鐘的螢光測定之前，除了對照，還需加入ClipPhen-Cu溶液(luL至20pM在水/DMF中，[終ClipPhen-Cu]=lpM)，然後是抗壞血酸溶液(1^1至2pM在水中，[終抗壞血酸]-100i^M)。根據所對應的不含有抗壞血酸的對照實驗，這些測定進行4次。將平均值列示於圖5，6禾口7。表2:用於實施例4中的寡核苷酸混合物ODN混合物在緩衝液中的ClipPhen-Cu抗壞血酸摩爾濃度(mM)摩爾濃度螢光DNA探160251010100針螢光RNA探160271010100針DNA/DNA16025/1602610/1010100RNA/RNA16027/1602810/1010100RNA/DNA16027/1602610/1010100結果與結論圖5所示為與ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用的對單鏈螢光DNA(16025，曲線a)或螢光RNA(16027，曲線b)隨時間進行螢光測定的結果。在兩種情況下，與對照相比(曲線c和d)都可觀察到非常清楚的螢光增加。這種螢光的出現證明了DNA以及RNA都被片段化了且螢光的出現在反應的最初瞬間是以相當的速率進行的。圖6所示為DNA/DNA雙鏈的片段化。在DNA/DNA雙鏈的形成過程中(曲線a和b)，我們觀察到與單鏈對照相比(曲線c和d)螢光水平升高6倍。這種升高並非由於ClipPhen-Cu，而是因為兩條鏈之間的雜交。從抗壞血酸加入的瞬間開始可觀察到在曲線b中螢光的下降，其達到了曲線d的螢光水平，對應於全部切割的單鏈所釋放的螢光。與對照相比，螢光的修飾清楚地表明單鏈DNA和雙鏈DNA/DNA是以完全類似的方式進行切割的。最終，我們評估了作為被片段化的核酸是雙鏈RNA或RNA或RNA/DNA異源雙鏈的函數的片段化速率的區別(圖7)。在這種情況下，對於3種對照及圖6所示，我們根據雙鏈的形成觀察到了螢光的增加，在隨後通過加入抗壞血酸誘導的片段化中觀察到了螢光的降低，達到了完全切割的單鏈的螢光水平。在所有情況下且不考慮雜合體的性質時，片段化發生，說明ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物完全適合於降解任意類型的核酸。實施例5:固定於固相支持物上片段化分子的去除汙染作用目的為了將ClipPhen固定於固相支持物並證明其活性在固定於Tentagel聚苯乙烯珠(商品參考號碼MB250002，RappPolymers,德國)之後依然能夠保持。操作程序將61.5mgTentagelNH2大珠(macrobead)(商品參考號碼MB250002，RappPolymers,德國)放置於SnapFit柱(ABI，美國)或Handee離心柱(參考號碼69705，Pierce,美國)中，相當於n=16.6pmol。用無水二甲亞碸(DMSO)洗滌珠從而去除任何可能存在的痕量水。萃取DMSO。將其放置於氬氣流。用於600pl無水DMSO中的14pl三乙胺(6eq，99pmol，-150mM)滲濾(l分鐘)。這一步驟確保胺基團是以適當的NH2形式而非NH/形式存在。所述溶液用三乙胺提取。用於400]Li1無水DMSO中的36.4mg辛二酸二琥珀醯亞胺酯(DSS)(6當量，99pmol，-250mM，Pierce)滲濾(10分鐘)。萃取含有過量DSS的溶液。對在所述反應這一階段的取出的幾個珠進行了茚三酮檢測，從而確保所有胺官能團都與連接物反應了。如果不是這種情況，珠子會變成藍色。將含有以下成分的反應混合物在環境溫度下滲濾至少1小時(1小時15分鐘-1小時30分鐘)於800^1DMSO中的3-ClipPhen(2.8叫，45pmol，56mM)，4-二甲基氨基吡啶(2.8eq，45|nmol，56mM)，6.3|il三乙胺(2.8eq，45|umol，56mM)。有可能在反應之前和之後取出幾pl反應混合物以在328nm在UV下的微分分析來確定珠官能化的程度。由於3-ClipPhen，所述反應混合物具有棕色。用無水DMSO進行洗滌直到洗滌溶液中的這種棕色消失。初始黃色的珠所具有的黃色在反應之後略微變暗。將於SO(HiI無水DMSO中的5.9^1乙醇胺(10eq，99nmol，-130mM)加入以滅活所有未反應的NHS基團。允許反應10分鐘。用1mlDMSO洗滌珠5次，然後用DMSO提取。用乙腈重複相同的操作(為了能夠乾燥珠)。用氬衝洗，然後在旋轉蒸發儀中蒸發。與銅絡合用於50/50DMSO/水中的lml的1MCuCV溶液滲濾(對55mg珠，即相對於官能化程度的145當量)10分鐘。用DMSO和水洗滌直到洗滌液無色(如果初始CuCl2溶液有色)，然後用乙腈洗。用氬衝洗。在旋轉蒸發儀中蒸發。切割檢測如下進行向Eppendorf管(最大容量200nl)中加入需要量的樹脂，於lmg與單個珠之間，即引入125nmol的ClipPhen/12.5mMTentage的量(即引入1.25-2.5nmol的ClipPhen/125uM-250uM的量)。向所述樹脂中加入靶RNA(1600鹼基16sRNA轉錄物，根據實驗濃度介於6-70ng/pL)，類似地以所需的濃度(5mM)加入抗壞血酸。樣本的總體積為IO^iL;所使用的緩衝液是pH7.4的tris緩衝液，終濃度為20mM。一個Tentagd樹脂珠就足以觀察切割。製備了與ClipPhen-Cu絡合物對照樣本偶聯的"單獨靶"(圖8電泳圖A)，"存在有抗壞血酸的靶(電泳圖B)"，"存在有樹脂的靶"。"存在有樹脂的靶"對照意味著所使用抗壞血酸的量對螢光沒有作用這一事實可以被檢測。根據所使用的靶，在放入AgilentRNA6000Nanochip(商業參考號碼為5067-1512的商業試劑盒，Agilent,美國)之前將所製備的樣本在環境溫度攪動30分鐘(lOOOrpm)。lpl上清液足以在生物分析儀(Agilent,美國)上進行分析。結果與結論所得結果與圖8所示(電泳圖C)表明只有在存在抗壞血酸，最少量樹脂(僅僅1珠Tentagd，即假定lmg樹脂含有50-100珠，支持ClipPhen的量為1.25-2.5nmol，即濃度範圍為125-250^M)的情況下，在半小時之內確實發生了對靶的切割。在RNA模型上這樣的切割是非常容易觀察到的，因為所產生的片段在電泳圖上是可見的(電泳圖C)。因此，證明了固化的ClipPhen依然具有活性並保持了其核酸降解性質。實施例6:去除含有汙染核酸和感興趣核酸的溶液的汙染的證明目的為了消除以較少量存在且由病毒衣殼保護的沒有降解存在的病毒核酸的病毒培養物上清中發現的"基因組細胞DNA"汙染物，其目的在於在不抑制感興趣靶的特異性擴增條件下降低從細胞DNA發生的非特異性擴增。為此，在ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用之前和之後，對上清中的基因組18SDNA濃度進行了分析(SearchLC+基因組DNA商業分析試劑盒，Promega，商業參考號碼G3041，美國)以產生一定範圍的稀釋。同時，在ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物作用之前和之後的病毒RNA的濃度也通過PCR用特異性異物和用LightCycler，SybrGreen(Roche，美國)進行了分析。操作程序將感染了病毒的細胞進行培養。在對照實驗中，使用KitSearchLC對上清中殘留的基因組DNA(18S)進行分析(下表中的條目B)。還使用LightCycler(Roche)測定了相應於所述病毒的核酸的量(使用特異性引物的擴增技術)(下表中的條目B)。在其他實驗中(下表中的條目A)，將上清用於ClipPhen-Cu/抗壞血酸混合物(ClipPhen-CuIOO一，抗壞血酸50mM，30分鐘，用2.5M終濃度DTT滅活)作用30分鐘，然後測定殘留基因組DNA(18S)的量以及相應於所述病毒的核酸的量。tableseeoriginaldocumentpage24結果與結論在該情況中可觀察到在病毒核酸的濃度基本未受到影響的條件下，採用切割物質處理的上清中基因組DNA的濃度降低了10倍(條目A)。通過基本上降低背景噪音，這項技術因此能夠增強分析病毒核酸的靈敏度。權利要求1.一種去除溶液中存在的任意核酸的汙染的方法，所述方法包括以下步驟-將所述溶液與由形成雙(1，10-菲咯啉)/金屬絡合物的結合於金屬原子的兩個1，10-菲咯啉分子所構成的絡合物所形成的至少一種片段化分子作用充分時間，直到所述核酸完全降解；以及-通過加入以下物質終止所述片段化分子的活性●過量的有機還原劑；或●絡合物質，例如EDTA。2.—種去除含有汙染核酸及感興趣核酸的溶液的汙染的方法，包括以下步驟-將所述溶液與由形成雙(1，10-菲咯啉)/金屬絡合物的結合於金屬原子的兩個l,10-菲咯啉分子所構成的絡合物形成的至少一種片段化分子作用充分的時間，直到所述汙染核酸完全降解，同時保留感興趣的核酸；以及-通過加入以下物質終止所述片段化分子的活性*過量的有機還原劑；或*絡合物質，例如EDTA。3.權利要求1或2所述的方法，其特徵在於在終止所述片段化分子的活性之後，所述方法還含有由擴增反應組成的補充步驟。4.權利要求1-3任一項所述的方法，其特徵在於所述金屬是過渡金屬，例如銅，釕，鎳，鐵，鋅，銠，鈷或錳。5.權利要求1-4任一項所述的方法，其特徵在於所述片段化分子的兩個菲咯啉核通過連接臂相互連接形成ClipPhen分子。6.權利要求5所述的方法，其特徵在於兩個菲咯啉核之間的連接臂是由三個連續碳原子的鏈構成的，其中在中間位置的碳原子是取代的且其中每個末端碳原子都通過氧原子連接於菲咯啉核。7.權利要求6所述的方法，其特徵在於在中間位置的碳原子是由-NH2或-NH-CO-CH3取代的且每個末端碳原子都通過所述核上的2位或3位的氧原子連接於菲咯啉核。8.權利要求5-7任一項所述的方法，其特徵在於所述ClipPhen分子是3-ClipPhen(1,3-雙(1,10-菲咯啉-3-基氧基)丙-2-胺)。9.一種去除溶液中存在的任意核酸的汙染的方法，所述方法包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分時間，直到稱為汙染核酸的所述核酸完全降解。10.—種去除含有汙染核酸和感興趣核酸的溶液的汙染的方法，包括將所述溶液與ClipPhen/金屬分子作用充分的時間，直到所述汙染核酸完全降解，而保留感興趣的核酸。11.權利要求1-10任一項所述的方法，其特徵在於所述片段化分子是結合過氧化氫1^202的1型銅絡合物，並任選具有其他還原劑，優選有機還原劑。12.權利要求1-10任一項所述的方法，其特徵在於所述片段化分子是優選結合於其他有機還原劑的II型銅絡合物。13.權利要求1-12任一項所述的方法，其特徵在於權利要求1-8任一項中所述的還原劑或權利要求11或12中所述的其他還原劑是有機還原劑，由以下組成*硫醇如二硫蘇糖醇(DTT)，硫代酸如巰基丙酸；或*羧酸；或*羧酸的衍生物如抗壞血酸；或*磷化氫如三羧乙基磷化氫(TCEP);或*至少兩種所述有機還原劑的組合。14.權利要求1-10任一項所述的方法，其特徵在於所述片段化分子被固定於固相支持物上。15.權利要求1-14任一項所述的方法，其特徵在於權利要求1-8任一項中所述的還原劑或權利要求11或12中所述的其他還原劑被固定於固相支持物上。16.權利要求14或15所述的方法，其特徵在於所述固相支持物是顆粒，膜，條，薄膜或濾器。17.權利要求11或12所述的方法，其特徵在於所述片段化分子與由羧酸或羧酸衍生物組成的其他有機還原劑之間的比例在1比1到1比100的範圍內。18.權利要求1-17任一項所述的方法，其中所述片段化分子與權利要求l-8任一項中所述的、由硫醇組成的還原劑之間的比例大於l比100，優選地大於1比1000。19.權利要求1-18任一項所述的方法，其特徵在於除了核酸外，所述溶液含有用於擴增反應必需的全部成分，艮口*靶；*擴增引物；以及*檢測探針。20.權利要求1-19任一項所述的方法，其特徵在於被處理的所述核酸是單鏈或雙鏈形式的RNA或DNA、以及RNA/DNA異源雙鏈。21.權利要求l-19任一項所述的方法，其特徵在於對於ClipPhen/金屬的濃度範圍為l(iM到100pM而言，所述被處理的核酸所經受的處理時間範圍為5到60分鐘，優選範圍為10到30分鐘。22.採用權利要求1-21任一項所述方法處理的溶液的用途，其特徵在於在權利要求1-8任一項中所述的有機還原劑存在的條件下，將所述溶液與含有擬進行擴增的耙核酸、以及所述靶核酸特異性的擴增引物和檢測探針的生物學樣品混合，從而產生終止所述片段化分子活性的過量有機還原劑。23.權利要求22所述的用途，其特徵在於權利要求1-8任一項中所述的有機還原劑與權利要求11或12中所述的其他有機還原劑相同。24.權利要求22所述的用途，其特徵在於權利要求1-8任一項中所述的有機還原劑不同於權利要求11或12中所述的其他有機還原劑。全文摘要本發明涉及去除溶液中含有的任意核酸的汙染的方法，包括以下步驟將所述溶液與具有通過片段化降解核酸即片段化分子的性質的至少一類分子相作用充分的時間，直到所述核酸完全降解，即產生汙染核酸，並終止所述片段化分子的活性。本發明還涉及以這種方法處理的此類溶液的用途。本發明優選用於診斷領域。文檔編號C12Q1/68GK101646785SQ200880010629公開日2010年2月10日申請日期2008年3月28日優先權日2007年3月30日發明者A·勞倫特,A·拉尤,G·帕拉尼奧斯-巴卡拉申請人:生物梅裡埃公司