一種耐糖皮質激素人淋巴瘤細胞系的製作方法
2023-07-05 08:42:56 2
專利名稱：一種耐糖皮質激素人淋巴瘤細胞系的製作方法
技術領域：
本發明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及一種具有耐糖皮質激素潛能的人淋巴瘤細胞系。
背景技術：
根據衛生部公布的第三次全國居民死亡原因調查結果顯示惡性腫瘤成為中國城市居民首位死因。惡性腫瘤已經嚴重威脅人們的生命。近年來，非霍奇金淋巴瘤發病率也逐年提高。美國腫瘤調查數據顯示09年非霍奇金淋巴瘤新增病例65980例，在女性腫瘤發病率上升至第5位。國內的統計資料與國外大體相似。瀰漫大B細胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤最常見的類型之一，具有侵襲性，佔非霍奇金淋巴瘤的30%-40%。儘管以⑶2。單抗為代表的生物免疫靶向治療應用使得瀰漫大B細胞淋巴瘤的總生存率明顯提高，但仍有超過半數的患者出現復發或耐藥。現對於瀰漫大B細胞淋巴瘤耐藥的機制尚未明確。目前認為， 化療是通過誘導細胞凋亡來發揮其療效,而瀰漫大B細胞淋巴瘤腫瘤細胞的內源性凋亡抵抗是影響化療敏感性的重要機制之一。CHOP方案作為瀰漫大B細胞淋巴瘤的標準治療方案，其中重要組成成分糖皮質激素具有誘導淋巴細胞凋亡的作用。糖皮質激素通過與細胞內的糖皮質激素受體結合，激活細胞內一系列的細胞信號通路，最終在細胞核內反式作用於目的基因，調控基因轉錄水平，從而發揮誘導凋亡的作用。一些臨床研究發現，在某些造血系統腫瘤中，對於糖皮質激素的初治反應是評價預後眾多指標之一。某些血液系統腫瘤患者存在對糖皮質激素原發性或繼發性不敏感從而影響療效。因此，研究糖皮質激素耐藥的問題引起越來越多的學者關注。但糖皮質激素耐藥機制的研究多來自急性淋巴細胞性白血病的體內外實驗，關於瀰漫大B細胞淋巴瘤與糖皮質激素耐藥相互關係的研究甚少。而臨床工作中發現不少瀰漫大B細胞淋巴瘤患者出現復發或耐藥。因此對於瀰漫大B細胞淋巴瘤耐藥的研究具有實踐意義。1974年，Sibley等最早從小鼠淋巴瘤糖皮質激素敏感株S49中分離了淋系細胞來源的耐糖皮質激素細胞系，之後CEM-7、WEHI-7等耐糖皮質激素細胞系相繼建立。這為研究血液系統腫瘤耐糖皮質激素機制提供了實驗基礎。但針對人瀰漫大B細胞淋巴瘤耐糖皮質激素細胞系尚未見報導，淋巴瘤糖皮質激素耐藥的研究缺少良好的實驗平臺。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有耐糖皮質激素潛能的人淋巴瘤細胞系。本發明提供了一種人瀰漫大B細胞淋巴瘤耐糖皮質激素細胞株，在本發明中稱為Toledo/DEX。所述細胞株對地塞米松的耐藥倍數高於源細胞。所述的源細胞是人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞系。本發明的細胞對阿黴素、長春新鹼或者環磷醯胺的耐藥倍數高於源細胞。本發明的細胞與源細胞的基本特徵相似，也有因耐糖皮質激素引起的特徵改變。細胞周期分布Gl期佔82. 32%，G2期3. 76%，S期13. 92%，G2/G1值為I. 98。該細胞裸鼠成瘤率為25%，潛伏期為31天。該細胞懸浮生長，呈圓形或橢圓形，體積較正常的淋巴細胞大，細胞大小不均一，細胞胞體偏大，形態不規則，核/漿比例增高，胞漿淡藍色，漿內見空泡，核不規則，可見多個核仁及核裂；電鏡下可見局部可見片層狀突起，有細長微絨毛。該細胞流式分析細胞免疫表型為⑶3'⑶5'⑶7_、⑶1Q+、ra19+、⑶79ノ、⑶2。+、⑶『、⑶『、⑶『、CD22'該細胞的該細胞的糖皮質激素受體GR a表達量高於源細胞。本發明的細胞株還具有以下生物學特性該細胞株體外培養生長良好，每2-3天傳代一次；細胞倍增時間是倍增時間為37. 10±2. 56小時；染色體數目為50，染色體變異與源細胞基本相同，但有個別細胞有差異，存在I或4或7或10號染色體異常，但均未形成兩個相關的克隆。較源細胞系Gl期細胞增多，而S期和G2期細胞減少；裸鼠成瘤率為25%，潛伏期為31天，源細胞成瘤率為0% ；CCK-8法檢測細胞對DEX (地塞米松)、ADM (阿黴素)、VCR (長春新鹼)和CTX (環磷醯胺)耐藥性均有所提高;Western Blot檢測GR a、GR @蛋白(糖皮質激素受體)的表達，進行灰度分析表明!'016(10/1^乂細胞系61^表達下調，且隨著耐藥倍數的增高而下降，同時GRP表達上調，且隨著耐藥倍數的增高而明顯上升。所述的源細胞人瀰漫大B細胞淋巴瘤Toledo細胞株來源於名女性瀰漫大B細胞 淋巴瘤患者的外周血，該患者經大劑量的化療及骨髄造血幹細胞移植治療後出現腦部轉移，屬典型的難治性淋巴瘤病例，建株於1990年，ATCC號CRL-2631，由復旦大學附屬華山醫院血液科引進並保存。本發明採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法誘導製得耐糖皮質激素人淋巴瘤細胞株Toledo/DEX，已於2011年3月4號保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號=CGMCC No. 4620，分類命名人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞株。本發明提供了所述的細胞株的製備方法，即採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法誘導耐藥細胞。未述及之處可以採用常規操作方法。本發明借鑑體外誘導化療藥物耐藥細胞的方法，採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法培養Toledo的糖皮質激素耐藥細胞系Toledo/DEX。Toledo/DEX細胞最終可在含DEX I. 024X KT5M的濃度中穩定生長。本發明採用下述步驟採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法誘導耐藥細胞。取對數生長期Toledo細胞(I X 106/ml)接種於25cm2培養瓶，加入含DEX起始濃度為I X KT8M的RPMI1640+10%新生牛血清的培養液，置於37°C、5%C02、飽和溼度的ニ氧化碳培養箱內培養96小時(第48 h時用含相同濃度DEX的完全培養基換液一次)，後用37°C的RPMI1640液洗2次，加入不含藥物的培養液，待細胞増殖再次進入對數生長期，提高DEX濃度I倍。如此逐步增加藥物濃度，培養6個月。本發明的細胞株可以用於糖皮質激素耐藥性的研究。本發明經實驗表明，可在含DEX I. 024X 10_5M的濃度中穩定生長，對於DEX (地塞米松)的耐藥性提高了 1227倍。
本發明經過6個月的培養，成功建立了對糖皮質激素耐藥指數為1227倍的人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞系Toledo/DEX。經實驗表明，本發明的Toledo/DEX細胞可在含DEX1.024X10_5M的濃度中穩定生長，對於DEX的耐藥性提高了 1227倍，是國內外首例具有耐糖皮質激素潛能的人瀰漫大B細胞淋巴瘤耐糖皮質激素細胞系。為研究瀰漫大B細胞淋巴瘤復發/耐藥的機制和逆轉策略提供了ー個新的實驗研究平臺。本發明的人淋巴瘤細胞系能為淋巴瘤耐糖皮質激素機制及逆轉糖皮質激素耐藥藥物篩選的研究建立良好的實驗平臺。
圖I. Toledo/DEX透射電鏡下的超微結構。可見,Toledo/DEX呈圓形或橢圓形,體積較正常的淋巴細胞大，細胞大小不均一，細胞胞體偏大，形態不規則，核/漿比例增高，胞漿淡藍色，漿內見空泡。核不規則，可見多個核仁及核裂，電鏡下可見局部可見片層狀突起，有細長微絨毛。圖2. Toledo/DEX細胞的裸鼠致瘤性，致瘤側種植Toledo/DEX細胞，未致瘤側種植源細胞。圖3Toledo/DEX細胞的細胞周期分析。
具體實施例方式實施例I Toledo/DEX細胞的建立
本發明採用人瀰漫大B細胞淋巴瘤Toledo細胞株作為源細胞，所述的人瀰漫大B細胞淋巴瘤ToIedo細胞株來源於名女性瀰漫大B細胞淋巴瘤患者的外周血，該患者經大劑量的化療及骨髄造血幹細胞移植治療後出現腦部轉移，屬典型的難治性淋巴瘤病例，建株於1990年，ATCC號CRL-2631，由復旦大學附屬華山醫院血液科引進並保存。本發明採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法誘導製得耐糖皮質激素人淋巴瘤細胞株Toledo/DEX，已於2011年3月4號保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)Jii :北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No. 4620，分類命名人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞株。本發明採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法培養Toledo的糖皮質激素耐藥細胞系Toledo/DEX。步驟如下採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法誘導耐藥細胞。取對數生長期Toledo細胞(IX 106/ml)接種於25cm2培養瓶，加入含DEX起始濃度為I X KT8M的RPMI1640+10%新生牛血清的培養液，置於37°C、5%C02、飽和溼度的ニ氧化碳培養箱內培養96小時(第48 h時用含相同濃度DEX的完全培養基換液一次)，後用37°C的RPMI1640液洗2次，加入不含藥物的培養液，待細胞増殖再次進入對數生長期，提高DEX濃度I倍。如此逐步増加藥物濃度，培養6個月。經過6個月的培養，成功建立了對糖皮質激素耐藥指數為1227倍的人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞系Toledo/DEX。本細胞株具有以下生物學特性該細胞株體外培養生長良好,姆2-3天傳代一次；Toledo/DEX懸浮生長,呈圓形或橢圓形,體積較正常的淋巴細胞大，細胞大小不均一，細胞胞體偏大，形態不規則，核/漿比例增高，胞漿淡藍色，漿內見空泡。核不規則，可見多個核仁及核裂，電鏡下可見局部可見片層狀突起，有細長微絨毛；細胞倍增時間是倍增時間為37. 10±2. 56小時；染色體數目為50，染色體變異與源細胞基本相同，但有個別細胞有差異，存在I或4或7或10號染色體異常，但均未形成兩個相關的克隆。流式分析細胞免疫表型為cd2_、⑶3_、ra5_、⑶7_、⑶1Q+、ra19+、⑶79ノ、⑶2。+、⑶『、⑶『、⑶『、CD22-與源細胞一致。PI檢測細胞周期分布Gl期佔82. 32%，G2期3. 76%，S期13. 92%，G2/Gl值為I. 98，較源細胞系Gl期細胞增多，而S期和G2期細胞減少；裸鼠成瘤率為25%，潛伏期為31天，源細胞成瘤率為0% ；CCK-8法檢測細胞對DEX、ADM、VCR和CTX耐藥性均有所提高(如表一);Western Blot檢測GRa、GRP蛋白的表達，進行灰度分析表明Toledo/DEX細胞系GRa表達下調，且隨著耐藥倍數的增高而下降，同時GRP表達上調，且隨著耐藥倍數的增高而明顯上升。
實施例2耐藥性測試
經實驗表明，本發明的Toledo/DEX細胞可在含DEX I. 024X IO^5M的濃度中穩定生長，對於DEX的耐藥性提高了 1227倍。表I Toledo/DEX細胞耐藥譜分析
權利要求
1.一種人瀰漫大B細胞淋巴瘤耐糖皮質激素細胞株，其特徵是，所述細胞株為耐糖皮質激素人淋巴瘤細胞株Toledo/DEX，保藏編號CGMCC No. 4620，分類命名人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞株；具有以下生物學特性該細胞懸浮生長，呈圓形或橢圓形，體積較正常的淋巴細胞大，細胞大小不均一，細胞胞體偏大，形態不規則，核/漿比例增高，胞漿淡藍色，漿內見空泡，核不規則，可見多個核仁及核裂；電鏡下可見局部可見片層狀突起，有細長微絨毛；該細胞細胞周期分布Gl期佔82. 32%，G2期3. 76%，S期13. 92%，G2/G1值為I. 98 ;該細胞裸鼠成瘤率為25%,潛伏期為31天。
2.如權利要求I所述的細胞株，其特徵是，所述細胞株對地塞米松的耐藥倍數高於源細胞；所述的源細胞是人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞系。
3.如權利要求I所述的細胞株，其特徵是，該細胞對阿黴素、長春新鹼或者環磷醯胺的耐藥倍數高於源細胞。
4.如權利要求I所述的細胞株，其特徵是，該細胞流式分析細胞免疫表型為CD2-、CD3_、CD5_、CD7_、0^0+、CD19+、CD79 a +、CD20+、CD38+、CD16-、CD56-、CD22-。
5.如權利要求I所述的細胞株，其特徵是，該細胞的糖皮質激素受體GRa表達量高於源細胞。
6.如權利要求I所述的細胞株，其特徵是，所述源細胞的ATCC號為CRL-2631。
7.權利要求I所述的細胞株的製備方法，其特徵是，採用長期間歇小劑量糖皮質激素遞增誘導法誘導耐藥細胞。
8.權利要求I所述的細胞株的應用，其特徵是，將所述的細胞用於糖皮質激素耐藥性的研究。
全文摘要
本發明屬微生物動物細胞系領域，具體涉及一種具有耐糖皮質激素潛能的人瀰漫大B細胞淋巴瘤耐糖皮質激素細胞系Toledo/DEX。本發明的Toledo/DEX細胞株GRα表達量低於源細胞，且所述細胞株對地塞米松的耐藥倍數高於源細胞；所述的源細胞是人瀰漫大B細胞淋巴瘤細胞系。該細胞系是國內外首例具有耐糖皮質激素潛能的人瀰漫大B細胞淋巴瘤耐糖皮質激素細胞系。本發明表明長期、間歇、小劑量糖皮質激素遞增誘導法建立淋巴瘤耐藥細胞系的方法是切實可行性，Toledo/DEX細胞系的建立將為後續糖皮質激素耐藥機制及逆轉的研究提供了一個實驗平臺。
文檔編號C12N5/09GK102766598SQ20111011413
公開日2012年11月7日 申請日期2011年5月4日 優先權日2011年5月4日
發明者許小平, 譚微, 陳波斌, 韓天潔, 馬燕 申請人:復旦大學附屬華山醫院