一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法

2023-07-05 04:05:06

專利名稱：一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法，特別是從中分離出一種為糖蛋白的蚯蚓3#纖溶酶組分，其分子量為24056道爾頓，與其它單組分的蚯蚓纖溶酶相比較，其體內溶栓作用最強，對凝血時間影響最小，可用於開發抗栓和溶栓藥物。
背景技術：
蚯蚓纖溶酶是蚯蚓體內多組分蛋白水解酶，目前臨床已經作為有效的口服溶栓藥物用於治療因血栓引起的各種心、腦血管疾病。市售蚯蚓纖溶酶基本上都是蚯蚓抽提液乾粉，如江中博洛克和百奧蚓激酶。提高療效的最有效方法就是將蚯蚓纖溶酶進行純化，去掉那些無用甚至有害的雜質；此外，蚯蚓纖溶酶是由多個組分構成的，有的佔主要部分，有的佔次要部分。只有主要部分才真正具有開發價值。而主要部分中的不同組分之間在體內溶栓和毒副作用方面也有很大差別。開發蚯蚓纖溶酶主要部分的最佳組分是目前需要解決的問題。
中國專利CN1454994A公開了一種「分離純化單組分纖溶酶的親和層析法」，它是採用瓊脂糖凝膠偶聯p-氨基苯甲脒配基製備親和層析柱，從蚯蚓的勻漿液中分離純化出具有較強纖溶活力的單組分蛋白酶。通過該親和層析柱，用含有脲基及胍基的化合物製備洗脫液進行梯度洗脫，經透析或分子篩等方法脫鹽，得到其中的EFE-III纖溶蛋白酶，它具有很強的纖維蛋白溶解活力。上述親和層析法是用昂貴的珠狀瓊脂糖為載體，這就限制了它的大規模工業化生產。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種方法簡便實用、成本低廉，適合於大規模生產的一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案本發明以濾紙為載體，偶聯大豆胰蛋白酶抑制劑，構成蚯蚓纖溶酶親和層析系統，通過親和層析和梯度洗脫從蚯蚓勻漿液分離出一種為糖蛋白的蚯蚓3#纖溶酶組分，其分子量為24056道爾頓；本方法的具體步驟如下(1)用常規方法製備蚯蚓勻漿液；(2)親和層析系統的製備a、載體的預處理(預處理的目的是提高濾紙的孔徑和強度)載體選用實驗室用的定性濾紙，在兩層濾紙之間夾一層尼龍窗紗後捲成濾紙卷、將濾紙卷放入燒杯中，將0.5～2.0mol/L的氫氧化鈉溶液倒入燒杯中攪拌一小時，倒出溶液；再將同樣濃度的氫氧化鈉溶液並且其中含有1％～10％的環氧氯丙烷和1mg/ml的NaBH4倒入燒杯中、在50～70℃時攪拌10～60分鐘，倒出溶液，用去離子水洗2～3次；b、載體的活化將上述預處理過的濾紙卷採用常規方法進行活化；c、載體與大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯將上述經活化處理後的濾紙卷用0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液洗一次，然後將其浸入含有大豆胰蛋白酶抑制劑的碳酸氫鈉溶液中，碳酸氫鈉溶液的濃度為0.1mol/L，其中大豆胰蛋白酶抑制劑的含量為5～50mg/ml，4～8℃時，攪拌18～22小時，再依次用PH9.0的碳酸氫鈉、PH4.0的醋酸-醋酸鈉溶液清洗；最後將偶聯了大豆胰蛋白酶抑制劑的濾紙卷懸浮於PBS溶液中，該溶液PH7.4、內含1mg/ml的NaBH4，4～8℃時，攪拌一小時，再用PBS溶液洗2～3次；d、裝柱將上述偶聯了大豆胰蛋白酶抑制劑的濾紙卷除去水分後裝入玻璃層析柱中；層析柱裝好後用PBS溶液進行平衡；(3)親和層析
將蚯蚓勻漿液連續泵入層析柱中，同時監測流出液的纖溶酶的含量，當流出液纖溶酶含量超過4～8μg/ml時，停止進樣，然後用PBS溶液平衡；(4)梯度洗脫藉助於梯度混合儀和輸液泵進行連續洗脫，洗脫劑是由PBS溶液和0～6mol/L的尿素組成的混合洗脫劑，用分布收集器收集洗脫下來的樣品，分別收集蚯蚓2#、3#、4#纖溶酶組分的洗脫峰，2#、3#、4#纖溶酶組分分別對應2、3、4號洗脫峰；最後將洗脫樣品對水透析，凍幹保存。
所述的蚯蚓勻漿液的製備方法如下將新鮮蚯蚓或蚯蚓乾粉用萬能粉碎機粉碎成50～200目的細小顆粒，按1∶1～1∶5體積比加入生理鹽水，然後加0.5～5％重量/體積的硼砂和1～10％重量/體積的硫酸鋁鉀，攪拌混勻，室溫放置1～7天，濾紙自然過濾。
所述的蚯蚓選自赤子愛勝蚓、雙胸蚓、異唇蚓、正蚓、鋸齒蚓中的一種。
所述載體的活化方法如下將預處理過的濾紙卷浸入0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉中，該醋酸-醋酸鈉中含10～60mmol/L的高碘酸鈉，其PH值為4～6，室溫避光攪拌10～60分鐘，用去離子水洗2～3次。
本發明的有益效果是由於改進了親和層析介質，用廉價的濾紙代替昂貴的珠狀瓊脂糖，使生產成本大大降低，從而適合於大規模生產，另外它還具有方法簡便實用的特點。


圖1為利用本發明方法分離出的蚯蚓纖溶酶各種組分的溶栓活性實驗結果。
圖2為利用本發明方法分離出的蚯蚓纖溶酶各種組分對出血時間影響的實驗結果。
具體實施例方式
本實施例以濾紙為載體，偶聯大豆胰蛋白酶抑制劑，構成蚯蚓纖溶酶親和層析系統，通過吸附和洗脫從蚯蚓勻漿液分離出3#纖溶酶組分。
分離出來的3#組分是蚯蚓體內主要纖溶酶組分之一，利用PIERCE公司糖檢測試劑盒進行測定，它是一種糖蛋白；根據中國科學院化學研究所質譜中心測定結果，分子量為24056道爾頓。與其它主要組分和纖溶酶全組分比較，3#組分的體內溶栓作用最強，對凝血時間影響最小，可用於開發抗栓和溶栓藥物(包括口服和針劑)。
本實施例的具體步驟如下(1)蚯蚓勻漿液的製備將新鮮的赤子愛勝蚓或其乾粉(所用的蚯蚓也可以選用雙胸蚓、異唇蚓、正蚓或鋸齒蚓中的任意一種或者用它們的乾粉)用萬能粉碎機粉碎成50～200目的細小顆粒，按1∶1～1∶5體積比加入生理鹽水，然後加0.5～5％重量/體積的硼砂和1～10％重量/體積的硫酸鋁鉀，攪拌混勻，室溫放置1～7天，濾紙自然過濾，濾液澄清透明，此勻蚯蚓漿液含纖溶酶50～300μg/ml。
(2)親和層析系統的製備a、載體的預處理(預處理的目的是提高濾紙的孔徑和強度)將實驗室用的定性濾紙裁成10釐米寬和60釐米長的濾紙條，將這些濾紙條整齊的疊放在一起，每兩層之間放一塊同樣大小的尼龍窗紗，然後從一端把它們捲成一個濾紙卷，中間捆一道細線，放入適宜大小的燒杯中，濾紙卷的一端距燒杯底部1～2釐米，以保證攪拌子的自由旋轉。將0.5～2.0mol/L的氫氧化鈉溶液倒入燒杯中，使溶液液面超過濾紙卷，然後把燒杯放在磁力攪拌器上攪拌一小時。將溶液倒出，加入同樣濃度的氫氧化鈉溶液，但其中含有1％～10％的環氧氯丙烷和1mg/ml的NaBH4，在50～70℃時攪拌10～60分鐘，用去離子水洗2～3次。
b、載體的活化將預處理過的濾紙卷浸入0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉中，該醋酸-醋酸鈉中含10～60m mol/L的高碘酸鈉，其PH值為4～6，室溫避光攪拌10～60分鐘，用去離子水洗2～3次。
c、載體與大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯將上述經活化處理後的濾紙卷用0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液洗一次，然後將其浸入含有大豆胰蛋白酶抑制劑的碳酸氫鈉溶液中，碳酸氫鈉溶液的濃度為0.1mol/L，其中大豆胰蛋白酶抑制劑的含量為5～50mg/ml，4～8℃時，攪拌18～22小時，再依次用PH9.0的碳酸氫鈉、PH4.0的醋酸-醋酸鈉溶液清洗；最後將偶聯了大豆胰蛋白酶抑制劑的濾紙卷懸浮於PBS溶液中，該溶液pH7.4、內含1mg/ml的NaBH4，4～8℃時，攪拌一小時，再用PBS溶液洗2～3次；d、裝柱取出濾紙卷，解開細線，用手掌將紙卷壓在玻璃板上並沿著最初的捲動方向滾動濾紙卷，以便除去部分水分。小心將濾紙卷塞入玻璃層析柱的底部，層析柱內徑應稍大於濾紙卷的外徑，這樣便於操作和使液體經過載體時能保持一定流速；但又不能太大，否則引起液體流動不均勻，影響層析效果。層析柱裝好後，用輸泵液從上部將PBS溶液打入柱內進行平衡，流出液先經過紫外檢測儀，然後進入分布收集器進行樣品收集。當指針到達基線時停止平衡。
(3)親和層析將蚯蚓勻漿液連續泵入層析柱中，同時監測流出液的纖溶酶的含量，當流出液纖溶酶含量超過4～8μg/ml時，停止進樣，然後用PBS溶液平衡，當檢測儀指針達到或接近基線時，停止平衡。
(4)梯度洗脫藉助於梯度混合儀和輸液泵進行連續洗脫，洗脫劑是由PBS溶液和0～6mol/L的尿素組成的混合洗脫劑，用分布收集器收集洗脫下來的樣品，分別收集蚯蚓2#、3#、4#纖溶酶組分的洗脫峰，2#、3#、4#纖溶酶組分分別對應2、3、4號洗脫峰；如果直接用6mol/L尿素洗脫，則得纖溶酶全組分樣品；最後將洗脫樣品對水透析，凍幹保存。
利用本實施例分離出的蚯蚓纖溶酶各種組分的溶栓實驗如下(一)實驗血栓溶栓實驗取健康雄性Wistar大鼠80隻，體重240±8(330～350)g，按體重均勻分組，每組10隻，戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg)，氣管插管，分離左、右頸總動脈。取內徑1.5mm、長25cm三段套連的弧形聚乙烯管，中間內置一根6cm長的4號手術線，用肝素生理鹽水(25U/ml)充滿聚乙烯管。將管的一端插入左頸外靜脈，另一端插入右靜總動脈，開放血流並記錄時間。血液從動脈流經聚乙烯管返回靜脈。15min後血栓形成開始給藥。從股靜脈按1.5ml/kg的體積推注給藥量的三分之一，約1分鐘推完，其餘三分之二的藥量按15ml/kg的體積推注，約30min推完。停藥後1小時阻斷血流，迅速取出手術線，稱血栓溼重。圖1為溶栓組分的體內溶栓實驗結果，其中3#組分的溶栓活性最高。
(二)出血時間延長實驗取體重18～22g昆明小鼠，雌雄各半，按體重隨機分成7組，每組10隻。給藥組分別尾靜脈推注纖溶酶溶液，空白對照組靜注生理鹽水，陽性藥物對照組靜注尿激酶2000U/kg。體積均為0.1ml/10g，20min後將小鼠裝入固定鼠筒內，每筒一隻，使尾巴露在筒外，用膠布固定於臺面，距遠端0.5cm處剪斷鼠尾，待血液自行溢出開始記時，每隔30秒鐘用濾紙吸去血滴一次，直至血液自然停止溢出為止(用濾紙沾時無血)，記錄出血時間。圖2為全組分、2#、3#和4#組分對出血時間影響的實驗結果，其中3#組分對出血時間影響最小。
權利要求
1.一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法，其特徵在於以濾紙為載體，偶聯大豆胰蛋白酶抑制劑，構成蚯蚓纖溶酶親和層析系統，通過親和層析和梯度洗脫從蚯蚓勻漿液分離出一種為糖蛋白的蚯蚓3#纖溶酶組分，其分子量為24056道爾頓；本方法的具體步驟如下(1)用常規方法製備蚯蚓勻漿液；(2)親和層析系統的製備a、載體的預處理載體選用實驗室用的定性濾紙，在兩層濾紙之間夾一層尼龍窗紗後捲成濾紙卷、將濾紙卷放入燒杯中，將0.5～2.0mol/L的氫氧化鈉溶液倒入燒杯中攪拌一小時，倒出溶液；再將同樣濃度的氫氧化鈉溶液並且其中含有1％～10％的環氧氯丙烷和1mg/ml的NaBH4倒入燒杯中、在50～70℃時攪拌10～60分鐘，倒出溶液，用去離子水洗2～3次；b、載體的活化將上述預處理過的濾紙卷採用常規方法進行活化；c、載體與大豆胰蛋白酶抑制劑偶聯將上述經活化處理後的濾紙卷用0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液洗一次，然後將其浸入含有大豆胰蛋白酶抑制劑的碳酸氫鈉溶液中，碳酸氫鈉溶液的濃度為0.1mol/L，其中大豆胰蛋白酶抑制劑的含量為5～50mg/ml，4～8℃時，攪拌18～22小時，再依次用PH9.0的碳酸氫鈉、PH4.0的醋酸-醋酸鈉溶液清洗；最後將偶聯了大豆胰蛋白酶抑制劑的濾紙卷懸浮於PBS溶液中，該溶液PH7.4、內含1mg/ml的NaBH4，4～8℃時，攪拌一小時，再用PBS溶液洗2～3次；d、裝柱將上述偶聯了大豆胰蛋白酶抑制劑的濾紙卷除去水分後裝入玻璃層析柱中；層析柱裝好後用PBS溶液進行平衡；(3)親和層析將蚯蚓勻漿液連續泵入層析柱中，同時監測流出液的纖溶酶的含量，當流出液纖溶酶含量超過4～8μg/ml時，停止進樣，然後用PBS溶液平衡；(4)梯度洗脫藉助於梯度混合儀和輸液泵進行連續洗脫，洗脫劑是由PBS溶液和0～6mol/L的尿素組成的混合洗脫劑，用分布收集器收集洗脫下來的樣品，分別收集蚯蚓2#、3#、4#纖溶酶組分的洗脫峰，2#、3#、4#纖溶酶組分分別對應2、3、4號洗脫峰；最後將洗脫樣品對水透析，凍幹保存。
2.根據權利要求1所述的一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法，其特徵在於蚯蚓勻漿液的製備方法如下將新鮮蚯蚓或蚯蚓乾粉用萬能粉碎機粉碎成50～200目的細小顆粒，按1∶1～1∶5體積比加入生理鹽水，然後加0.5～5％重量/體積的硼砂和1～10％重量/體積的硫酸鋁鉀，攪拌混勻，室溫放置1～7天，濾紙自然過濾。
3.根據權利要求2所述的一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法，其特徵在於所述載體的活化方法如下將預處理過的濾紙卷浸入0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉中，該醋酸-醋酸鈉中含10～60mmol/L的高碘酸鈉，其PH值為4～6，室溫避光攪拌10～60分鐘，用去離子水洗2～3次。
4.根據權利要求2所述的一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法，其特徵在於所述的蚯蚓選自赤子愛勝蚓、雙胸蚓、異唇蚓、正蚓、鋸齒蚓中的一種。
全文摘要
本發明涉及一種分離蚯蚓纖溶酶單一組分的方法，特別是從中分離出一種為糖蛋白的蚯蚓3#纖溶酶組分，其分子量為24056道爾頓，與其它單組分蚯蚓纖溶酶相比較其體內溶栓作用最強，對凝血時間影響最小，可用於開發抗栓和溶栓藥物。本發明以濾紙為載體，偶聯大豆胰蛋白酶抑制劑，構成蚯蚓纖溶酶親和層析系統，通過親和層析和梯度洗脫從蚯蚓勻漿液分離出蚯蚓3#纖溶酶組分。本發明的有益效果是由於改進了親和層析介質，用廉價的濾紙代替昂貴的珠狀瓊脂糖，使生產成本大大降低，從而適合於大規模生產，另外它還具有方法簡便實用的特點。
文檔編號C12N9/68GK1673367SQ20051001241
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月23日 優先權日2005年3月23日
發明者趙曉瑜, 靜天玉, 武金霞 申請人:河北大學